Name: Oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Naucz się oznaczania ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach HEK293T przy użyciu barwienia komórek żywych. Ta metoda umożliwia wizualizację receptorów GPCR poprzez immunofluorescencję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Matsunami za krytyczną lekturę niniejszego manuskryptu.

1. Procedura:
Procedura składa się z trzech części realizowanych w ciągu 3 dni: transferu komórek, transfekcji oraz immunocytochemii, przy czym każdego dnia wykonuje się jeden etap. Transfer i transfekcja komórek w ciągu pierwszych dwóch dni muszą być przeprowadzone w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Dzień 1: Przesiewanie komórek HEK293T do analizy ekspresji powierzchniowej.
<ol>
<li>Poziomka transferowa (M10): W warunkach sterylnych wymieszać minimalne medium niezbędne (MEM) uzupełnione o 10% (objętościowo) płodowej surowicy bydlęcej.</li>
<li>Hodywać komórki w płytce hodowlanej 100 mm do pożądanego stopnia konfluencji, w zależności od liczby płytek wymaganych do przygotowania układu. Ważne jest określenie frakcji komórek do transferu, aby uniknąć przerośnięcia lub zbyt małej gęstości komórek: na przykład z płytki 100 mm o 100% konfluencji można przenieść około 3% komórek do płytki 35 mm, aby uzyskać w niej konfluencję na poziomie około 30%.</li>
<li>Przed transferem komórek, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, pokryć szklane szkiełka podstawowe 22 X 22 mm sterylną poli-D-lizyną (1mg/ mL) i umieścić jedno w każdej płytce hodowlanej 35 mm, stroną pokrytą do góry, w celu wysiania komórek (Rycina 1). Pozostawić roztwór do wyschnięcia na 5- 10 minut. W tym czasie można włączyć źródło UV w komorze laminarnej, aby wysterylizować szkiełka, jeśli jest to pożądane. Poli-D-lizyna pomaga komórkom heterologicznym przylegać do szkiełek.</li>
<li>Aby przenieść komórki, odessać istniejące medium z płytki 100 mm, przemyć poprzez ostrożne dodanie 8 mL sterylnego PBS, odessać PBS i poddać komórki trypsynizacji, używając 3 mL 0,05% Trypsyny-EDTA; gdy komórki odkleją się od płytki, zablokować dalszą reakcję enzymatyczną, dodając 5 mL M10. Rozbić skupiska komórek i przenieść wymaganą objętość do sterylnej probówki stożkowej; wirować przy 200g przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Odessać nadsącz zawierający Trypsynę-EDTA, pozostawiając nienaruszony pellet komórek. Aby przenieść komórki do płytek 35 mm, dodać 1 mL M10 do każdej płytki i rozbić skupiska, aby zdysocjować komórki. Dodać 1 mL resuspenderowanych komórek do każdej płytki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="Schemat procesu TLC; metoda chromatograficzna pokazująca aplikację próbki, rozwój i wizualizację." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Pokrycie szklanych szkiełek podstawowych 22 X 22 mm poli-D-lizyną i umieszczenie jednego szkiełka stroną pokrytą do góry w każdej płytce 35 mm.</li>
</ol>
Dzień 2: Transfekcja komórek HEK293T.
<ol>
<li>Od 18 do 24 godzin po przesiewaniu komórki są gotowe do transfekcji receptora, który ma zostać poddany analizie. Należy użyć receptora oraz RTP1S sklonowanych w ssaczym wektorze ekspresyjnym pCI, przygotowanych z kultur bakteryjnych przy użyciu Qiagen Miniprep Kit zgodnie z protokołem opisanym wcześniej4. Należy zastosować receptory z etykietą epitopu rodopsyny o długości 20 aminokwasów na końcu N, aby ułatwić barwienie immunocytochemiczne.</li>
<li>Do każdej transfekcji należy użyć 1000ng konstruktu receptora, 250 ng konstruktu RTP1S oraz 50 ng zielonego białka fluorescencyjnego. Transfekcję należy przeprowadzić przy użyciu Lipofectamine 2000, zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
Dzień 3: Immunocytochemia w celu wizualizacji receptorów barwionych na powierzchni komórek.
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem przygotować roztwory do barwienia i płukania, a następnie schłodzić je do 4°C. Medium do barwienia: Minimum Essential Medium, 45 mL; Fetal Bovine Serum, 5 mL; HEPES (1M), 500 μL (stężenie końcowe 10mM); azotek sodu (1,5M), 500 μL (stężenie końcowe 15mM). Roztwór do płukania: HBSS, 500 mL; HEPES (1M), 5 mL (stężenie końcowe 10mM); azotek sodu (1,5M), 5 mL (stężenie końcowe 15mM). Oba roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C do ponownego użycia. Przygotować roztwory przeciwciał poprzez 100-krotne rozcieńczenie wymaganych przeciwciał w medium do barwienia.</li>
<li>Immunochemię w celu barwienia receptorów węchowych na powierzchni rozpocząć około 24 godzin po transfekcji. Aby przeprowadzić barwienie żywych komórek, układ doświadczalny musi zostać schłodzony do 4°C: napełnić duży pojemnik lodem i wyrównać jego powierzchnię, położyć na lodzie tackę i spryskać ją 70% etanolem. Odciąć kawałek parafilmu (krótszy niż długość tacki) i przymocować go do spryskanej etanolem tacki, aby uzyskać gładką powierzchnię. Przenieść szklane zakrywki z transfektowanymi komórkami na parafiliim, pojedynczo, stroną z komórkami do góry, używając pęsety. Na każdą zakrywkę nałożyć 100 μL zimnego roztworu barwiącego pierwszorzędowego, ostrożnie dozując go od narożnika zakrywki (Rysunek 2). Po naniesieniu roztworu przeciwciał na wszystkie zakrywki, przykryć tackę, aby zapobiec wysychaniu roztworu w powietrzu. Inkubację pierwszorzędową prowadzić przez 45-60 minut.</li>
<li>Po inkubacji pierwszorzędowej szybko przenieść zakrywki do oryginalnych naczyń hodowlanych 35 mm zawierających medium. Odessać medium i delikatnie dodać 2 mL schłodzonego roztworu do płukania od krawędzi naczynia, aby zapobiec utracie komórek z zakrywki. Odessać roztwór do płukania i powtórzyć czynność dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy płukania. Po trzecim płukaniu nie odsysać roztworu.</li>
<li>Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych w medium do barwienia i przenieść zakrywki z roztworu do płukania na nową warstwę parafilmu na tej samej tacce. Ponownie delikatnie nanieść 100 μL roztworu przeciwciał na każdą zakrywkę, dozując od narożnika, podobnie jak podczas inkubacji pierwszorzędowej. Inkubację drugorzędową prowadzić przez 30-45 minut, a następnie przenieść zakrywki z powrotem do roztworu do płukania w oryginalnych naczyniach 35 mm. Ponownie wypłukać zakrywki trzy razy w opisany sposób.</li>
<li>Odessać roztwór po ostatnim płukaniu i dodać 2 mL 1% schłodzonej paraformaldehydu. Utwierdzić komórki w schłodzonym 1% roztworze paraformaldehydu na lodzie przez 15 minut.</li>
<li>Zamontować zakrywki na czystych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu medium montażowego Mowiol, stroną z komórkami do dołu, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza (Rysunek 3). Po wyschnięciu Mowiolu na powietrzu delikatnie opłukać zakrywki, dodając wodę destylowaną na powierzchnię i natychmiast ją odsysając. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="Schemat procesu nanopowlekania przedstawiający osadzanie cieczy na powierzchni podłoża w celu utworzenia cienkiej warstwy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Nałożyć na każdą zakrywkę 100 μL zimnego roztworu barwiącego pierwszorzędowego. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="Proces przygotowania preparatu, ustawienie szkiełka mikroskopowego, krok po kroku, spłaszczanie próbki, technika laboratoryjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Zamontować zakrywki stroną z komórkami do dołu na czystych szklanych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu medium montażowego Mowiol.</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki:
Barwienie żywych komórek umożliwia wizualizację białek na powierzchni komórek podczas transfekcji receptorów wraz z białkami opiekuńczymi (w tym przypadku receptora węchowego Olfr62 wraz z białkiem transportującym receptor RTP1S) (Rysunek 4). Barwienie receptorów na powierzchni komórki charakteryzuje się punktowym wzorem barwienia (Rysunek 4B, wstawka). Barwienie przeprowadzone w niewłaściwy sposób może prowadzić do zwiększonego poziomu szumów, co utrudnia obserwatorowi odróżnienie rzeczywistego barwienia powierzchniowego od szumu. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna z GFP dla analizy ekspresji Olfr62 i RTP1S, wyniki obrazowania komórkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Transfekcja receptorów wraz z białkami opiekuńczymi pozwala na wizualizację białek na powierzchni komórek przy użyciu barwienia żywych komórek. Transfekcja samego receptora węchowego Olfr62 (A) oraz transfekcja Olfr62 z białkiem opiekuńczym RTP1S (B). Poziomy ekspresji GFP służą jako kontrola transfekcji (A' i B').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Każdy krok należy przeprowadzić starannie, aby zapewnić wyraźne i charakterystyczne barwienie powierzchniowe. Cały proces barwienia musi odbywać się w niskiej temperaturze (na lodzie), a tacka, na której układane są szkiełka nakrywkowe, musi zostać schłodzona przed użyciem, aby zapewnić przeżywalność komórek. Co więcej, fiksację przeprowadza się na koniec procesu barwienia powierzchniowego. Stanowi to wyraźny kontrast w stosunku do barwienia wewnętrznego, gdzie fiksacja poprzedza barwienie w celu permeabilizacji błony ko...

<table><tbody><tr><td>Kryszka 22 X 22 mm (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>Z L-glutaminianem, solą Earle&amp;rsquo;s i wodorowęglanem</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 1X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td>Z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu</td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Azotek sodu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>Szkło hodowlane 35 X 10 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Barwny świat zapachów jest rozpoznawany przez zmysł węchu. Węch u myszy jest mediowany przez repertuar około 1200 receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCRs) 1, które według przypuszczeń wiążą lotne cząsteczki substancji zapachowych i przekształcają sygnał zewnątrzkomórkowy w sygnał wewnątrzkomórkowy poprzez sprzężenie z białkiem G Gαolf. Uważa się, że wiązanie substancji zapachowych z receptorami odbywa się zgodnie z regułą kombinatoryczną, co oznacza, że jedna substancja zapachowa może wiązać się z kilkoma receptorami, a jeden receptor może wiązać kilka substancji zapachowych w różnym stopniu 2. Badania biochemiczne, sygnalizacyjne oraz badania wiązania ligandów dla większości GPCRs były wygodnie przeprowadzane z wykorzystaniem komórek heterologicznych. Jednak stosowanie komórek heterologicznych do badania receptorów węchowych było przez długi czas niemożliwe, ponieważ po transfekcji nie były one eksportowane na powierzchnię komórki. Saito i wsp. wykazali, że chaperony z rodziny białek transportujących receptory (RTP), posiadających pojedynczy motyw przechodzenia przez błonę, wykazują zwiększoną ekspresję w neuronach sensorycznych węchu i działają jako chaperony transportujące receptory węchowe na powierzchnię w komórkach heterologicznych podczas wspólnej kotransfekcji 3. Aby przeprowadzić testy biochemiczne dla receptorów z użyciem komórek heterologicznych, należy najpierw ustalić, czy receptor wykazuje silną ekspresję powierzchniową w danej linii komórkowej. Można to zbadać poprzez nadekspresję receptorów wraz z chaperonem RTP1S, a następnie przeprowadzić barwienie żywych komórek w celu fluorescencyjnego oznakowania wyłącznie domeny zewnątrzkomórkowej lub tagu w tej domenie. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia żywych komórek, który może być wygodnie wykorzystany do wykrywania receptorów węchowych na powierzchni komórek HEK293T. Ponadto może on służyć do badania ekspresji powierzchniowej innych receptorów chemosensorycznych lub GPCRs.

W niniejszym materiale prezentujemy protokół barwienia żywych komórek, który umożliwia wygodne wykrywanie receptorów zapachowych na powierzchni komórek HEK293T. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do analizy ekspresji powierzchniowej innych receptorów chemosensorycznych lub receptorów GPCR.

Oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych

Barwny świat zapachów jest rozpoznawany przez zmysł węchu. Węch u myszy jest oparty na repertuarze około 1200 receptorów sprzężonych z białkiem G...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie, w jaki sposób można wykryć ekspresję powierzchniową receptorów chemosensorycznych przy użyciu barwienia żywych komórek HEK 2 93 T; osiąga się to poprzez uprzednie osadzenie komórek na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną w naczyniach hodowlanych. Drugim krokiem procedury jest transfekcja DNA w komórkach HEK 2 93 T. Trzecim krokiem procedury jest przeprowadzenie barwienia żywych komórek z użyciem przeciwciał pierwszorzędowych oraz sprzężonych z fluoroforem przeciwciał wtórnych.Ostatnim krokiem procedury jest utrwalenie barwionych komórek i nałożenie szkiełek cover slip. W efekcie można uzyskać wyniki obrazujące lokalizację receptorów na powierzchni komórek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta umożliwia wykrycie chemoreceptorów eksportowanych na powierzchnię komórek heterologicznych, takich jak HK 2 93 T. Demonstracja wizualna tej metody wskaże kluczowe kroki, których należy ściśle przestrzegać, aby utrzymać komórki przy życiu w celu ich autobarwienia.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą uznać takie etapy jak przenoszenie, obchodzenie się i montowanie szkiełka nakrywki za trudne. Jednak po kilku próbach technika ta staje się łatwa. Przy użyciu zmodyfikowanego protokołu z wykorzystaniem kolumny cgen, oczyść DNA osocza receptora i receptora. Transport białka RT TP one s sklonowanego w wektorze ekspresyjnym PCI zapewnia, że w przypadku barwienia immunologicznego powlekany receptor jest znakowany terminalnie epitopem o długości 20 aminokwasów, aby ułatwić przyleganie komórek.Zakoduj szkiełka podstawowe stężeniem 1 mg/mL poli-L-lizyny. Umieść szkiełka w 35 mm naczyniach do hodowli komórkowej stroną powleczoną do góry, aby wyschły na powietrzu wewnątrz sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Wysiej komórki HEK 293T do gęstości około 30% w 1 mL pożywki M10, upewniając się, że między szkiełkiem a naczyniem do hodowli komórkowej nie uwięziono pęcherzyka powietrza. Inkubuj w 37 °C i 5% CO2 przez 18 do 24 godzin. Dla każdej transfekcji przygotuj mieszaninę DNA składającą się z 1000 ng konstruktu receptora, 250 ng konstruktu RTP1S oraz 50 ng konstruktu GFP.Zgodnie z instrukcjami producenta, przeprowadź transfekcję komórek za pomocą lipectomy 2000. Przygotuj medium do barwienia, dodając azydek sodu i hippies do M 10. Medium to można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.Następnie przygotuj bufor piorący zawierający 15 millimolar azydku sodu i 10 millimolar HEPES. W zimnym HBSS bufor piorący można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius przez kilka miesięcy. Aby przeprowadzić barwienie w niskiej temperaturze, przygotuj kuwetę z odpowiednim roztworem i pozostaw ją na lodzie przez pięć minut.Przenosząc szkiełka podstawowe stroną z komórkami do góry, umieść szkiełka zawierające transfekowane komórki w paraformie, zaczynając od rogu szkiełka. Ostrożnie dodaj 100 µL zimnego przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w medium barwiącym. Inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki w oryginalnych naczyniach hodowlanych o średnicy 35 mm, naprzemiennie dodając i odsysając zimny roztwór do mycia.Powtórzyć dwukrotnie. W analogiczny sposób inkubować SI trzy sprzężone przeciwciała wtórne przez 30 minut. Przeprowadzić przemywanie trzykrotnie w płytkach 35 milimetrowych.Na koniec utrwalaj komórki schłodzonym 1% roztworem paraformaldehydu, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Przytwierdź szkiełka nakrywkowe stroną z komórkami do dołu do szkiełek przedmiotowych, używając do tego celu odpowiedniego spoiwa; uprzednio opłucz powierzchnię szkiełek nakrywkowych wodą destylowaną, aby usunąć osady soli.Zazwyczaj, podobnie jak w przypadku OL FFR 62 i RTPs, barwienie receptorów na powierzchni komórki charakteryzuje się punktowym wyglądem sygnału fluorescencyjnego pochodzącego z koniugatu przeciwciał. Po opanowaniu tej techniki można jej użyć do zabarwienia od 32 do 40 szkiełek nakrywkowych w czasie zaledwie dwóch i pół do trzech godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury z użyciem wielu szkiełek nakrywkowych ważne jest, aby przenosić je i rozpoczynać inkubację z przeciwciałami pojedynczo, aby zapobiec wysychaniu komórek.

assaying-surface-expression-chemosensory-receptors-heterologous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w heterologicznych komórkach

Źródło: de March, C. A. et. al., Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora odorantu przez nawaniacz w fazie gazowej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym w rekombinowanych komórkach ssaków za pomocą pomiaru luminescencji. Wiązanie odorantu wyzwala aktywację białka G i produkcję cAMP, aktywując białka glosensor, które emitują luminescencję po związaniu substratu, zapewniając ilościową miarę...

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji receptorów zapachowych w komórkach rekombinowanych

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Wzorce aktywacji receptorów węchowych kodują tożsamość zapachu, ale brak opublikowanych danych identyfikujących ligandy zapachowe dla receptorów węchowych ssaków utrudnia opracowanie kompleksowego modelu kodowania zapachu. Protokół ten opisuje metodę ułatwiającą wysokoprzepustową identyfikację ligandów receptorów węchowych i ilościowe określenie aktywacji receptora.

Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Naucz się oznaczania ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach HEK293T przy użyciu barwienia komórek żywych. Ta metoda umożliwia wizualizację receptorów GPCR poprzez immunofluorescencję.

Oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych

Przeglądaj więcej filmów