Izolacja bakterii Gram-ujemnych z insercją transpozonów genomowych

Rozpocznij od rozmrożenia zamrożonej kultury pokrytej populacji bakterii Gram-ujemnych dawcy i biorcy na lodzie.

Komórki biorcze przenoszą transpozony, krótkie segmenty DNA, które zawierają gen oporności na antybiotyk kanamycynę. Te transpozony są losowo integrowane z genomem gospodarza.

Dodaj kulturę do bogatej w składniki odżywcze płytki agarowej zawierającej kanamycynę, ale bez składników odżywczych specyficznych dla dawcy.

Dodaj sterylne koraliki i delikatnie obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić kulturę.

Usuń koraliki i inkubuj. Bakterie biorcy wykorzystują składniki odżywcze, ale tylko te ze zintegrowanymi transpozonami są odporne na kanamycynę, co prowadzi do tworzenia kolonii.

Bakterie dawcy i biorcy bez transpozonów nie rozwijają się.

Policz jednostki tworzące kolonie, aby oszacować liczbę bakterii biorców z unikalnymi insercjami transpozonów.

Dodaj świeże podłoże i zbierz populację bakterii.

Odwirować w celu osadzenia bakterii i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w pożywce z krioprotektantem, aby zachować żywotność bakterii.

Rozmrozić podwielokrotność zamrożonego krycia na lodzie. Następnie za pomocą sterylnych szklanych kulek rozprowadzić 150 mikrolitrów rozcieńczenia na każdej płytce agarowej Luria-Bertani o wymiarach 30 na 150 milimetrów, uzupełnionej kanamycyną.

Wyrzuć zużytą probówkę zawierającą nadmiar krycia i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 godzin. Po inkubacji policz jednostki tworzące kolonie na każdej płytce, aby oszacować całkowitą liczbę mutantów w bibliotece transpozonów. Policz 20% co najmniej trzech płytek, aby określić szacunkową liczbę kolonii dla całej grupy płytek.

Po obliczeniu szacowanej wydajności kolonii dodaj od trzech do pięciu mililitrów LB do każdej płytki i zeskrob bakterie za pomocą sterylnego narzędzia do skrobania. Wyciągnij zawiesiny bakteryjne ze wszystkich płytek do 50-mililitrowych stożkowych probówek i osadzaj zawiesiny, wirując w temperaturze 5 000 razy G przez siedem minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach LB, uzupełnionych 30% glicerolem.

Następnie zrób jednomililitrowe porcje z biblioteki transpozonów w kriowialach i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.