JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:38 min. • November 28th, 2025
Zacznij od umieszczenia kuwety w spektrofotometrze fluorescencyjnym wyposażonym w uchwyt i mieszadło do sterowania temperaturą.
Dodaj wcześniej podgrzany bufor o umiarkowanie kwaśnym pH i ustaw temperaturę w utrzymaniu, aby symulować warunki naprężenia.
Do próbki testowej dodaj kwasowo-ochronny chaperon pochodzący z E. coli.
W próbce sterującej dodaj równą objętość bufora.
Następnie wprowadź białko substratu wrażliwe na temperaturę i kwasy do obu próbek.
Zacznij monitorować rozpraszanie światła.
Inkubować próbki w warunkach stresu, aby wywołać rozkładanie podłoża.
Przy umiarkowanie kwaśnym pH chaperon aktywuje się i stabilizuje rozwinięte białko.
Dodaj roztwór soli neutralizujący pH i kontynuuj rejestrowanie rozpraszania światła.
W próbce kontrolnej powrót do neutralnego pH powoduje agregację rozwiniętego białka, zwiększając rozpraszanie światła.
W próbce badanej chaperon sprzyja ponownemu składaniu podłoża, co powoduje mniejsze rozpraszanie światła w porównaniu do grupy kontrolnej.
Porównaj sygnały rozpraszania światła, aby ocenić aktywność opiekunów.
Umieść kwarcową kuwetę o jednym mililitrze w spektrofotometrze fluorescencyjnym wyposażonym w uchwyty i mieszadła do próbek z kontrolą temperatury.
Ustaw długość fali wzbudzenia i emisji na 350 nanometrów. Dodaj odpowiednie objętości wcześniej podgrzanego buforu D o pożądanych wartościach pH do kiwety. Całkowita objętość wynosi 1000 mikrolitrów.
Ustaw temperaturę w uchwytie na kuwetę na 43 stopnie Celsjusza. Dodaj 12,5 mikromolowego HdeB do buforu, a następnie 0,5 mikromolowego MDH. Zacznij monitorować rozpraszanie światła.
Inkubuj reakcję przez 360 sekund, aby umożliwić odpowiednie rozwinięcie MDH. Podnieś pH do siedmiu stopni, dodając objętość 0,16 do 0,34 dwutrzonowego niebuforowanego fosforanu dipotasu i kontynuuj rejestrowanie rozpraszania światła przez kolejne 440 sekund. Przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.