$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Pobierz próbkę wody morskiej zawierającej różnorodne mikroorganizmy, w tym bakterie niszczące zanieczyszczenia środowiskowe.
Próbkę rozcieńczaj seryjnie, aby zmniejszyć gęstość mikroorganizmów, i nakładaj ją na nośnik odżywczy.
Po wykubaniu wybierać morfologicznie odrębne kolonie, które mogą nadal posiadać genetycznie i metabolicznie różnorodne typy bakterii.
Każdą wybraną kolonię rozpraszaj w rozproszenie pojedynczych komórek i inkubację.
Każda komórka tworzy kolonię, reprezentując genetycznie czysty izolat bakteryjny o unikalnym profilu metabolicznym.
Każdy izolat zaszczepić w podłożu wzrostu i inkubować, aby zwiększyć biomasę.
Rozwiń hodowlę, wyrzuć supernatant i przemyj buforem, aby usunąć pozostałe podłoże.
Ponownie zawiesi komórki w buforze i zaszczep je w podłożu selekcyjnym zawierającym EE2, zanieczyszczenie środowiska.
Jako jedyne źródło węgla w ośrodku, EE2 wybiera bakterie, które mogą go metabolizować dla energii i wzrostu.
Mętność w ośrodku wskazuje na wzrost bakterii, potwierdzając izolację izolatu bakterii niszczącego zanieczyszczenia.
Aby selekcjonować bakterie, najpierw wykonaj seryjne rozcieńczenia od 10 do minus dziewięć w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców oraz do 10 do minus sześciu dla próbek wody. Pipeta rozcieńcza się w górę i w dół pięć razy, zanim odrzuci końcówkę.
Następnie zabij każdy z nich w wir. Za każdym razem wiruj próbki przez pięć sekund przed kolejnym rozcieńczeniem seryjnym. Pipetować 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na szalkach Petriego zawierających 3% chlorku sodu, lizogenii bulionu agarowego i nałożyć je na talerz.
Inkubuj płytki przez jeden do trzech dni w temperaturze docelowej, na przykład 26 stopni Celsjusza. Sprawdzam tablice raz dziennie. Wybieraj i izoluj kolonie o wyraźnych morfologiach wzrostu na nowych płytkach za pomocą techniki płyt spaskowanych.
Powtarzaj ten krok tyle razy, ile trzeba, aby na talerzach rosły czyste kolonie. Przechowuj izolaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub w glicerolu, jak opisano w rękopisie. Aby przeprowadzić test degradacji EE2, wybierz jedną kolonię ze świeżych płytek i zaszczep w dwóch mililitrach sterylnego medium LB w probówce.
Jeśli jest to bulion glicerolowy, weź 10 mikrolitrów bulionu bakteryjnego glicerolu i rozmazuj go na płytki agaru LB. Inkubuj w temperaturze 24 do 28 stopni Celsjusza przez noc, aby pojedyncze kolonie mogły rosnąć. Umieść rurkę zawierającą LB medium o nachyleniu pod stałym mieszaniem przy 150 g, w temperaturze 24 do 28 stopni Celsjusza przez noc.
Po wzroście bakterii należy rozpuszczać komórki przez wirowanie w 8 000 g przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar. Aby przemyć pozostały bulion LB, dodaj dwa mililitry wody solnej, aby ponownie zawiesić komórki.
Powtórz mycie dwa razy, aby upewnić się, że nie ma śladów źródła węgla. Zaszczepić wyprane i ponownie zawiesowane komórki w minimalnym pożywce Bushnell Haas zawierającej EE2 jako jedyne źródło węgla. Oceń wzrost bakterii na podstawie gęstości optycznej w 600 nanometrach oraz jednostek tworzących naszą kolonię na medium agarowym LB po 16 do 72 godzinach inkubacji.