Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciw SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

W niniejszej procedurze przygotowano rekombinacyjną szczepionkę wykazującą białko RBD SARS-CoV i oceniono jej zdolność do indukowania aktywności neutralizującej przeciwko pseudowirusowi SARS. Najpierw białko RBD zostaje wyekspresowane i oczyszczone z supernatantu hodowli transfekowanych komórek 2 9 3 T. Oczyszczone białko jest następnie wykorzystywane do immunizacji.

Myszy oraz surowice są pobierane od zaszczepionych zwierząt w różnych punktach czasowych po immunizacji w celu ilościowego określenia potencjału neutralizacyjnego surowic odpornościowych. Przeprowadza się test neutralizacji pseudowirusów; produkuje się rekombinanty pseudowirusów SARS wykazujące ekspresję lucyferazy, które następnie inkubuje się z miareczkowaną surowicą mysią. Następnie ocenia się zdolność tych zneutralizowanych wirusów do infekowania komórek wykazujących ekspresję koreceptora ACE dla SARS, mierząc względną aktywność lucyferazy w zainfekowanych komórkach.

Następnie można obliczyć 50% miano przeciwciał neutralizujących. Nazywam się tu. Obecnie pracuję jako postdoc w laboratorium.

Główną zaletą testu neutralizacji pseudowirusów w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak testy neutralizacji oparte na żywym wirusie, jest względne bezpieczeństwo tej metody. Nie wymaga ona zakaźnego wirusa SARS i może być przeprowadzona w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa innym niż trzeci. Procedurę zademonstruje Laying Due, postdoc w moim laboratorium, który koncentruje się na opracowywaniu szczepionek przeciwko wyłaniającym się chorobom zakaźnym, takim jak SARS i grypa. Odmrozić aliquoty sterylnego buforu 2X HBBS pH 7, 2,5 M chlorku wapnia oraz plazmidu RBD w temperaturze pokojowej.

Po rozmrożeniu roztworów przenieś 2 mL 2X HBS do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. W probówce o pojemności 15 mL wymieszaj 200 µL chlorku wapnia z 40 µg plazmidu RBD. Przy użyciu sterylnej pipety 5 mL doprowadź objętość do 2 mL, stosując sterylną wodę destylowaną o temperaturze pokojowej. Dodawaj roztwór plazmidu do 2X HBS kroplami, utrzymując mieszaninę pod stałym, ale delikatnym wirowaniem w wierteksie.

Utrzymanie powolnego i ciągłego wirowania w mieszalniku vortex jest kluczowe dla uzyskania osadu o odpowiedniej konsystencji, co zapewnia wysoką wydajność transfekcji. Przechowywać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po tej inkubacji dodać mieszaninę kropla po kropli do kolby zawierającej komórki 2 9 3 T o konfluencji od 50 do 70%.

W objętości 40 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej należy równomiernie rozprowadzić roztwór do transfekcji. Wymieszaj pożywkę natychmiast po dodaniu mieszaniny do transfekcji. Umieść komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenku węgla.

Po 8 do 10 godzinach inkubacji usunąć całą pożywkę komórkową i zastąpić ją 50 mililitrami świeżej pożywki serum-free optimum, aby uniknąć zakłóceń wywołanych przez surowicę podczas następnego etapu oczyszczania białka, a następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C. Po dwóch dniach zebrać nadsącz zawierający ekspresowane białko RBD i odwirować go przez 15 minut przy 6 000 RPM w celu usunięcia szczątków komórkowych. Po osadzeniu komórek przenieść nadsącz do nowej probówki i dodać koktajl inhibitorów proteaz.

Aby zapobiec degradacji białka, należy zastosować kolumny nickel NTA super flow zgodnie z instrukcjami producenta w celu oczyszczenia rekombinowanego białka RBD z zebranego supernatantu. Eluuj białko RBD buforem zawierającym 250 millimolar ole. Następnie, używając probówek Emon Ultra 15, skoncentruj oczyszczone białko zawierające OLE poprzez wirowanie przy 3000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około 15 minut. Odrzuć frakcję przepływową.

Dodaj PBS do probówek z koncentratem RBD i ponownie odwiruj przy 3000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Powtórz proces płukania dwukrotnie. Aby zapewnić całkowite usunięcie oleju, oczyszczone białko należy teraz rozpuścić w PBS, a następnie przenieść białko pipetą do czystej probówki EPR o pojemności 1,5 mililitra.

Na koniec oblicz stężenie oczyszczonego białka za pomocą spektrofotometru NanoDrop, używając PBS jako próbki zerowej, a następnie przechowuj próbkę w temperaturze -80 °C. Najpierw dodaj 1 ml sterylnego PBS do jednej fiolki systemu adiuwantowego Sigma. Podgrzej w kąpieli wodnej do temperatury od 40 do 45 °C i dokładnie mieszaj fiolkę w wirówce vortex przez dwie do trzech minut.

Następnie przygotować emulsję białka z adiuwantem w probówce typu einor o pojemności 1,5 ml. Połączyć pożądaną ilość rozmrożonego, oczyszczonego białka rozcieńczonego w PBS z równą objętością systemu adiuwantowego i intensywnie mieszać w wortexie przez dwie do trzech minut. Przygotować również emulsje kontrolne, mieszając sam adiuwant z PBS. Podskórnie.

Wstrzyknąć co najmniej pięciu myszom szczepu BC w wieku od czterech do sześciu tygodni po 200 µL początkowej mieszaniny immunizacyjnej zawierającej 20 µg białka na dawkę lub emulsji kontrolnej podskórnie w 21. dniu po początkowym szczepieniu. Podać dawki przypominające zawierające 10 µg białka w końcowej objętości 200 µL każda. Pobrać próbki krwi od każdej myszy przed początkową immunizacją oraz 10 dni po każdym szczepieniu, a wyizolowaną surowicę przechowywać w temperaturze -20 °C.

Inaktywacja dopełniacza w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Na 16 godzin przed transfekcją wysiać komórki 293T w 100-milimetrowych naczyniach do hodowli tkankowej w gęstości 2 milionów komórek na naczynie. Przygotować odczynik do transfekcji zgodnie z wcześniejszym opisem i przeprowadzić kotransfekcję komórek plazmidem kodującym białko S SARS-CoV oraz innym kodującym genom HIV-1 z defektywnym białkiem ENV i ekspresją lucyferazy. Od ośmiu do dziesięciu godzin po transfekcji.

Pożywkę zastąpiono 10 mililitrami świeżej pożywki DMEM zawierającej 10% serum, a następnie komórki zwrócono do inkubatora. Po dwóch dniach zebrano supernatant zawierający pseudowirus SARS. Supernatant przepuszczono przez filtr strzykawkowy o porach 0,45 mikrona w celu usunięcia szczątków komórkowych i podzielono wirusa na alykwoaty.

Użyć natychmiast lub zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, używając wielokanałowej pipety do płytek. Przenieść komórki 293T wykazujące ekspresję receptora ACE2 dla SARS-CoV do 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek w stężeniu 10 000 komórek na 100 µL na dołek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Użyć oddzielnej płytki 96-dołkowej do miareczkowania rekombinowanego pseudowirusa SARS wykazującego ekspresję lucyferazy i określić odpowiednie stężenie wirusa dla testu neutralizacji w rzędach A i B pierwszej płytki.

150 µL na studzienkę 10% F-B-S-D-M-E-M. Następnie do rzędów A1 i B1 dodać 150 µL nierozcieńczonego wirusa i przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenie seryjne w dwóch powtórzeniach, przenosząc 150 µL ze studzienek w rzędzie pierwszym do studzienek w następnym rzędzie i tak dalej, aż do rzędu 11. Odrzucić ostatnie 150 µL i nie dodawać wirusa do rzędu 12.

Po przeprowadzeniu rozcieńczeń seryjnych i inkubacji komórek ACE 2 93 T przez 16 godzin, należy zainfekować komórki, przenosząc 100 µL z każdej studzienki płytki z wirusem do odpowiadającej jej studzienki płytki zawierającej komórki. Inkubować komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C, aby umożliwić zainfekowanie komórek przez wirusy. Poziom infekcji w każdej studzience należy określić, odczytując płytkę w luminometrze ultra 3 84.

Ilość zakażenia jest proporcjonalna do intensywności aktywności lucyferazy. W teście neutralizacji zostanie wykorzystane stężenie wirusa, przy którym względna jednostka lucyferazy jest około tysiąc razy większa niż tło RLU samych komórek w kolumnie 12. Najpierw przygotuj neutralizację w oddzielnej płytce 96-dołkowej, używając pipety wielokanałowej do naniesienia 150 µL 10% F-B-S-D-M-E-M do dołków w pierwszej kolumnie oraz 120 µL do dołków w pozostałych kolumnach.

Następnie nanieś trzy mikrolitry każdego badanego surowicy mysiej do powtórzonych studni w pierwszej kolumnie. W tym przykładzie dwie pierwsze studnie zawierają surowicę rozcieńczoną 50-krotnie od myszy immunizowanej białkiem RBD. Kolejne dwie zawierają surowicę od drugiej myszy immunizowanej białkiem RBD, a ostatnie cztery studnie zawierają surowicę od dwóch zwierząt kontrolnych immunizowanych PBS. Używając pipety wielokanałowej, wykonaj pięciokrotne rozcieńczenie seryjne surowicy, przenosząc 30 mikrolitrów ze wszystkich studni pierwszej kolumny do studni drugiej kolumny i powtarzając tę czynność aż do kolumny 11.

Odrzuć pozostałe 30 µL i pozostaw studzienki w kolumnie 12 bez surowicy. Następnie do każdej z nich dodaj 120 µL rozcieńczonego pseudowirusa SARS. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, aby umożliwić przeciwciałom anty-RBD w surowicy mysiej związanie i zneutralizowanie pseudowirusa SARS.

Po tej inkubacji przenieś 100 µL zneutralizowanego wirusa z każdej studni do odpowiadających im studni na płytce 96-dołkowej zawierającej komórki 293T wykazujące ekspresję ACE2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, aby umożliwić infekcję. Po zainfekowaniu komórek usuń nadsącz za pomocą pipety wielokanałowej i zastąp go 100 µL świeżego medium na każdą studnię.

Po 72 godzinach w temperaturze 37 °C przenieś płytkę z powrotem do inkubatora. Ponownie usuń nadsączy przy użyciu pipety wielokanałowej. Na tym etapie każdy pseudowirus, który nie został zneutralizowany przez surowicę mysią, powinien być w stanie zainfekować komórki. Dodaj 60 µL na dołek odczynnika do lizy kultur komórkowych z lucyferazą.

Umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej i pozostaw komórki do lizy na jedną lub dwie godziny. Po przeprowadzeniu lizy komórek przenieś 50 µL lizatów komórkowych do płytki 96-dołkowej do luminometru i dodaj 50 µL podłoża dla lucyferazy do każdego dołka. Użyj luminometru Ultra 3 84 ustawionego w trybie luminescencji dla płytek 96-dołkowych, aby odczytać płytkę i ocenić względną aktywność lucyferazy w poszczególnych dołkach, na podstawie której można wyliczyć procent zneutralizowanego wirusa.

Dane te wykazują, że uzyskany procent neutralizacji wirusa jest proporcjonalny do stężenia surowicy z myszy immunizowanych RBD. W przeciwieństwie do nich, surowica z zwierząt wstrzykniętych PBS nie neutralizuje wirusa przy żadnym z tych stężeń. Można łatwo wyznaczyć wartość NT 50, czyli miano surowicy, przy którym neutralizowanych jest 50% wirusa.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że pewność siebie i cierpliwość są niezbędne dla powodzenia eksperymentów. Po obejrzeniu tych filmów powinni Państwo lepiej rozumieć, jak przeprowadzić ekspresję rekombinowanej szczepionki przeciwko SARS w subkulturze komórek ssaczych oraz jak określić zdolność do indukcji odpowiedzi przeciwciał neutralizujących w modelach mysich.