Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

W niniejszej procedurze przygotowywana jest rekombinowana szczepionka wykazująca ekspresję białka RBD SARS COV, a następnie ocenia się jej zdolność do indukowania aktywności neutralizującej przeciwko pseudowirusowi SARS. Najpierw białko RBD jest ekspresyjne i oczyszczane z supernatantu hodowli transfekowanych komórek 2 9 3 T. Oczyszczone białko jest następnie wykorzystywane do immunizacji.

Myszy oraz surowice są pobierane od zaszczepionych myszy w różnych punktach czasowych po immunizacji w celu ilościowego określenia potencjału neutralizacji surowic odpornościowych. Przeprowadzany jest test neutralizacji pseudowirusa, w którym produkowany jest rekombinowany pseudowirus SARS wykazujący ekspresję lucyferazy, a następnie inkubowany z miareczkowaną surowicą myszy. Następnie zdolność zneutralizowanych wirusów do infekowania komórek wykazujących ekspresję koreceptora ACE dla SARS jest oceniana poprzez pomiar względnej aktywności lucyferazy w zainfekowanych komórkach.

Następnie można obliczyć 50% miano przeciwciał neutralizujących. Nazywam się tu. Obecnie pracuję jako stażysta w laboratorium.

Główną zaletą testu neutralizacji pseudowirusów w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak testy neutralizacji oparte na żywych wirusach, jest fakt, że technika ta jest stosunkowo bezpieczna. Nie wymaga ona zakaźnego wirusa SARS i może być przeprowadzana w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznym innym niż trzeci. Procedurę zaprezentuje Laying Due, która jest stypendystką badawczą w moim laboratorium i zajmuje się opracowywaniem szczepionek przeciwko nowym chorobom zakaźnym, takim jak SARS i grypa. Odlyczone porcje sterylnego buforu 2X HBBS pH 7, 2,5 M chlorku wapnia oraz plazmidu RBD w temperaturze pokojowej.

Po rozmrożeniu roztworów przenieś 2 ml 2X HBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. W probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 200 µl chlorku wapnia z 40 µg plazmidu RBD. Za pomocą sterylnej pipety 5 ml doprowadź objętość do 2 ml, używając sterylnej wody destylowanej w temperaturze pokojowej. Dodawaj roztwór plazmidu do 2X HBS kroplami, stale i delikatnie mieszając zawiesinę na wortexie.

Utrzymanie powolnego i ciągłego mieszania w wirze jest kluczowe dla uzyskania wytrąconego osadu o odpowiedniej konsystencji, co zapewnia wysoką wydajność transfekcji. Przechowywać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po tej inkubacji dodać mieszaninę kroplami do kolby zawierającej komórki 2 9 3 T o stopniu konfluencji od 50 do 70%.

W objętości 40 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej ważne jest równomierne rozprzestrzenienie roztworu do transfekcji. Wymieszaj pożywkę niezwłocznie po dodaniu mieszaniny do transfekcji. Umieść komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% carbon dioxide.

Po 8 do 10 godzinach inkubacji usunąć całą pożywkę komórkową i zastąpić ją 50 mililitrami świeżej pożywki serum-free optimum, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń wywołanych przez surowicę podczas późniejszego oczyszczania białka, a następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C. Po dwóch dniach zebrać nadsącz zawierający ekspresowane białko RBD i odwirować go przez 15 minut przy 6 000 RPM w celu usunięcia szczątków komórkowych. Po s pelletowaniu komórek przenieść nadsącz do nowej probówki i dodać koktajl inhibitorów proteaz.

Aby zapobiec degradacji białka, należy zastosować kolumny nickel NTA super flow zgodnie z instrukcjami producenta w celu oczyszczenia rekombinowanego białka RBD z zebranego supernatantu. Następnie należy eluować białko RBD buforem zawierającym 250 millimolar ole. Kolejnie, używając probówek Emon Ultra 15, skoncentrować oczyszczone białko zawierające OLE poprzez wirowanie przy 3000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około 15 minut. Odciek należy usunąć.

DODAĆ PBS do probówek z koncentratem RBD i ponownie odwirować przy 3000 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Powtórzyć płukanie dwukrotnie. Aby zapewnić całkowite usunięcie ole, oczyszczone białko należy teraz rozpuścić w PBS i przenieść białko pipetą do czystej probówki EOR o pojemności 1,5 mililitra.

Na koniec oblicz stężenie oczyszczonego białka za pomocą NanoDrop, używając PBS jako próbki zerowej, a następnie przechowuj próbkę w temperaturze -80 °C. Najpierw dodaj 1 mL sterylnego PBS do jednej fiolki systemu adiuwantowego Sigma. Podgrzej wstępnie w kąpieli wodnej w temperaturze od 40 do 45 °C i dokładnie wymieszaj fiolkę na wirówce typu vortex przez dwie do trzech minut.

Następnie przygotować emulsję adiuwantową z białkiem w probówce typu einor o pojemności 1,5 ml. Wymieszać pożądaną ilość rozmrożonego, oczyszczonego białka rozcieńczonego w PBS z równą objętością systemu adiuwantowego i energicznie mieszać w wirówce typu vortex przez dwie do trzech minut. Przygotować również emulsje kontrolne, mieszając adiuwant z samym PBS. Podskórnie.

Wstrzyknąć co najmniej pięciu myszom szczepu BC w wieku od czterech do sześciu tygodni po 200 µL początkowej mieszaniny immunizacyjnej zawierającej 20 µg białka na dawkę lub emulsji kontrolnej podskórnie w 21. dniu po pierwszej inokulacji. Wstrzyknąć dawki przypominające zawierające 10 µg białka w końcowej objętości 200 µL każda. Pobrać próbki krwi od każdej myszy przed początkową immunizacją oraz 10 dni po każdym szczepieniu, a wyizolowaną surowicę przechowywać w temperaturze -20 °C po odwirowaniu.

Inaktywacja dopełniacza w temperaturze 56 °C przez 30 minut na 16 godzin przed transfekcją. Wysiać komórki 293T w 100-milimetrowych naczyniach do hodowli tkankowej w gęstości 2 milionów komórek na naczynie. Przygotować odczynik do transfekcji zgodnie z wcześniejszym opisem i przeprowadzić kotransfekcję komórek plazmidem kodującym białko S wirusa SARS-CoV oraz innym kodującym genom HIV-1 wykazującym ekspresję lucyferazy przy defekcie białka ENV. Od ośmiu do dziesięciu godzin po transfekcji.

Zastąpiono pożywkę 10 mililitrami świeżej pożywki DMEM zawierającej 10% serum, a następnie przeniesiono komórki z powrotem do inkubatora. Po dwóch dniach pobrano nadsącz zawierający pseudowirus SARS. Nadsącz przepuszczono przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 mikrona w celu usunięcia szczątków komórkowych i rozdzielono wirusa na aliquoty.

Użyć natychmiast lub zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, używając wielokanałowej pipety do płytek. Wysiać komórki 2 9 3 T wykazujące ekspresję receptora ACE2 SARS COV w 96-dołkowej płytce do hodowli tkanek w stężeniu 10 000 komórek na 100 µL na dołek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Użyć oddzielnej płytki 96-dołkowej do miareczkowania rekombinowanego pseudowirusa SARS wykazującego ekspresję lucyferazy i wyznaczyć odpowiednie stężenie wirusa do testu neutralizacji w rzędach A i B pierwszej płytki.

150 µL na dołek 10% F-B-S-D-M-E-M. Następnie dodać 150 µL nierozcieńczonego wirusa do rzędów A1 i B1 i przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenia seryjne w dubletach, przenosząc 150 µL z dołków w rzędzie pierwszym do dołków w kolejnym rzędzie i tak dalej, aż do rzędu 11. Odrzucić ostatnie 150 µL i nie dodawać wirusa do rzędu 12.

Po wykonaniu rozcieńczeń seryjnych i inkubacji komórek ACE 2 93 T przez 16 godzin, należy zainfekować komórki, przenosząc 100 µL z każdej studzienki płytki z wirusem do odpowiadającej jej studzienki w płytce z komórkami. Inkubować komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C, aby umożliwić wirusom zainfekowanie komórek. Poziom infekcji w każdej studzience należy określić, odczytując płytkę w luminometrze ultra 3 84.

Ilość infekcji jest proporcjonalna do intensywności aktywności lucyferazy. W teście neutralizacji zostanie użyte stężenie wirusa, przy którym względna jednostka lucyferazy (RLU) jest około tysiąc razy większa niż tło RLU samych komórek w kolumnie 12. Należy przygotować neutralizację w oddzielnej płytce 96-dołkowej, rozpoczynając od dodania za pomocą pipety wielokanałowej 150 µL 10% F-B-S-D-M-E-M do dołków w pierwszej kolumnie oraz 120 µL do dołków w pozostałych kolumnach.

Następnie do podwójnych studzienek w pierwszej kolumnie dodaj po 3 µL każdego badanego serum mysiego. W tym przykładzie dwie pierwsze studzienki zawierają serum z myszy uodpornionej RBD w rozcieńczeniu 50-krotnym. Kolejne dwie zawierają serum z drugiej myszy uodpornionej RBD, a ostatnie cztery studzienki zawierają serum od dwóch zwierząt kontrolnych uodpornionych PBS. Używając pipety wielokanałowej, wykonaj pięciokrotne rozcieńczenia seryjne surowicy, przenosząc 30 µL ze wszystkich studzienek pierwszej kolumny do studzienek drugiej kolumny i powtarzając tę czynność aż do kolumny 11.

Odrzuć pozostałe 30 µL i pozostaw studzienki w kolumnie 12 bez surowicy. Następnie do każdej z nich dodaj 120 µL rozcieńczonego pseudowirusa SAR na studzienkę. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, aby umożliwić przeciwciałom anty-RBD w surowicy mysiej związanie i neutralizację pseudowirusa SARS.

Po tej inkubacji przenieść 100 µL zneutralizowanego wirusa z każdej studni do odpowiadających im studni płytki 96-dołkowej zawierającej komórki 2 9 3 T wykazujące ekspresję ACE2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 24 h, aby umożliwić infekcję. Po zainfekowaniu komórek usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej i zastąpić go 100 µL świeżego medium na każdą studnię.

Po 72 godzinach w temperaturze 37 °C przenieś płytkę z powrotem do inkubatora. Ponownie usuń nadsącz. W tym momencie wszelkie pseudowirusy, które nie zostały zneutralizowane przez surowicę mysią, powinny być w stanie zainfekować komórki. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 60 µL odczynnika do lizy kultur komórkowych zawierającego lucyferazę do każdej studzienki.

Umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej i pozostaw komórki do lizy na jedną lub dwie godziny. Po przeprowadzeniu lizy komórek przenieś 50 µL lizatów komórkowych do 96-dołkowej płytki do luminometru i dodaj 50 µL substratu lucyferazy do każdego dołka. Użyj luminometru Ultra 3 84 ustawionego w trybie luminescencji dla płytek 96-dołkowych, aby odczytać płytkę i ocenić względną aktywność lucyferazy w różnych dołkach, na podstawie czego można wyznaczyć procent zneutralizowanego wirusa.

Dane te wykazują, że stopień neutralizacji wirusa jest proporcjonalny do stężenia surowicy pochodzącej od myszy immunizowanych RBD. W przeciwieństwie do nich, surowica od zwierząt wstrzykniętych PBS nie neutralizuje wirusa przy żadnym z tych stężeń. Można łatwo wyznaczyć NT 50, czyli miano surowicy, przy którym zneutralizowane zostaje 50% wirusa.

Podczas próby przeprowadzenia tej procedury ważne jest, aby pamiętać, że pewność siebie i cierpliwość są kluczowe dla sukcesu eksperymentów. Po obejrzeniu tych materiałów wideo powinni Państwo lepiej rozumieć sposób ekspresji rekombinacyjnej szczepionki przeciwko SARS w hodowlach komórek ssaczych oraz określać zdolność do indukcji odpowiedzi przeciwciał neutralizujących w modelach mysich.