Name: Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS na bazie RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i wykrywanie neutralizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj metodę przygotowania szczepionki rekombinowanej przeciwko SARS opartej na domenie wiążącej receptor RBD. Naucz się ekspresji białka w komórkach 293T, szczepienia myszy i oceny aktywności neutralizującej przy użyciu testu pseudowirusowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) Stanów Zjednoczonych (RO1 AI68002).

1. Przygotowanie rekombinowanego białka RBD SARS-CoV
<ol>
<li>Przygotowanie odczynnika do transfekcji fosforanem wapnia
<ol>
<li>Przygotowanie buforu 2X HBS: Wymieszać 16 g NaCl, 0,4 g Na2HPO4*7H2O oraz 13,0 g HEPES. Dostosować pH do wartości 7,00 i uzupełnić objętość do 1000 mL wodą destylowaną. Po przefiltrowaniu roztworu w celu sterylizacji, rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C. 
Wskazówka: Każda zmiana wartości pH może wpłynąć na wyniki transfekcji. Dlatego zaleca się przetestowanie kilku wartości pH w okolicy 7,00 (na przykład 6,99, 7,00 lub 7,01) i wybranie optymalnej dla transfekcji przy użyciu metody opisanej poniżej.</li>
<li>Przygotowanie 2,5 M CaCl2: Dodać 73,5 g CaCl2*2H2O do wody destylowanej do uzyskania końcowej objętości 200 mL. Przefiltrować roztwór i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
</li>
<li>Transfekcja plazmidem rekombinowanym i oczyszczanie białka
<ol>
<li>Przeszczepić komórki 293T przy konfluencji 50-70% na 24 h przed transfekcją. Hodować komórki w kolbach do hodowli tkankowych T-175 cm2 w 40 mL DMEM zawierającego 10% inaktywowanej ciepłem (HI) FBS oraz 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) w temperaturze 37°C w 5% CO2.</li>
<li>Wszystkie odczynniki do transfekcji powinny zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed zabiegiem. Odczynniki te obejmują 2X HBS, 2,5M CaCl2, DiH2O oraz plazmid rRBD 6. 
Wskazówka: Końcowy konstrukt plazmidu rekombinowanego użyty do ekspresji białka powinien zawierać peptyd sygnałowy, aby zapewnić sekrecję ekspresowanych białek rekombinowanych do nadsączu hodowli. Do końca C-końca ekspresowanego białka można dodać znacznik 6x His w celu ułatwienia oczyszczania.</li>
<li>Przygotować jedną probówkę BD Falcon 50 mL (A) i jedną 15 mL (B), a następnie dodać odczynniki do probówek zgodnie z Tabelą 1. Do probówki A dodać bufor 2X HBS. Do probówki B dodać 2,5M CaCl2 oraz plazmid rRBD, a następnie uzupełnić objętość do wymaganej wartości za pomocą DiH2O. 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td colspan="4">A. Jedna kolba do hodowli tkankowych T-175 cm2 (4000 μL/kolba): przygotowanie do ekspresji rRBD</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Probówka A </td>
 <td colspan="2">Probówka B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X HBS</td>
 <td>2000 μL</td>
 <td>2,5M CaCl2</td>
 <td>200 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>DNA plazmidu rRBD</td>
 <td>40 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>DiH2O do</td>
 <td>2000 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="4">B. Jedna szalka Petriego 100-mm (1000 μL/szalka): przygotowanie do produkcji pseudowirusa SARS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">Probówka A </td>
 <td colspan="2">Probówka B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X HBS</td>
 <td>500 μL</td>
 <td>2,5M CaCl2</td>
 <td>50 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>DNA plazmidu SARS-CoV S</td>
 <td>5 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>plazmid HIV-1 (pNL4-3.luc.RE)</td>
 <td>5 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>DiH2O do</td>
 <td>500 μL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Przygotowanie i objętości mieszaniny do transfekcji 
Objętości wymienione w Tabeli 1 dotyczą jednej jednostki transfekcji. W przypadku użycia większej liczby kolb lub szalek do transfekcji, należy odpowiednio dostosować objętości.</li>
<li>Roztwór DNA-wapnia z probówki B dodawać kroplami do probówki A, utrzymując stałe i łagodne mieszanie w wortexie. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20-30 min. Kluczem do udanej transfekcji fosforanem wapnia jest wielkość i kształt powstałego osadu. Dlatego mieszaninę należy wortexować stale i powoli, aby spełnić ten wymóg i w rezultacie zwiększyć wydajność transfekcji.</li>
<li>Mieszaninę dodawać kroplami i równomiernie do komórek 293T (4000 μL/kolba). Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO2.</li>
<li>Wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą, bezzsyłkową pożywkę OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (50 mL/kolba) 8-10 h po transfekcji. Kontynuować hodowlę komórek przez kolejne dwa dni w tych samych warunkach.</li>
<li>Zebrać nadsącz zawierający ekspresowane białko rRBD 72 h po transfekcji. Odwirować przy 6000 obr./min przez 15 min, aby usunąć debris komórkowy. Do zebranego nadsączu dodać koktajl inhibitorów proteaz i przechowywać w temperaturze 4°C przez noc.</li>
<li>Następnego dnia oczyścić rekombinowane białko rRBD z nadsączu hodowlanego przy użyciu Ni-NTA Superflow zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Skoncentrować oczyszczone białko za pomocą probówek koncentrujących Amicon Ultra -15. Po koncentracji białka dodać PBS do probówek koncentrujących i ponownie odwirować, aby usunąć imidazol z buforu elucyjnego. Obliczyć stężenie białka i przechowywać oczyszczone białko w temperaturze -80°C do czasu użycia.</li>
</ol>
</li>
</ol>
2. Immunizacja myszy i pobieranie próbek
<ol>
<li>Podgrzać system adiuwantowy Sigma (SAS) do 40-45°C zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 1 mL PBS do każdej fiolki i dokładnie wymieszać.</li>
<li>Przygotować emulsję białko-adiuwant zgodnie z protokołem zamieszczonym w Tabeli 2. Odmierzyć pipetą obliczoną ilość białka rRBD do probówki o pojemności 1,5 mL. Dodać do probówki taką samą objętość adiuwantu SAS i intensywnie mieszać w wortexie przez 2-3 min w celu utworzenia emulsji. 
Wskazówka: Objętości wymienione w Tabeli 2 dotyczą jednej myszy. Dostosować objętości do rzeczywistej liczby użytych myszy. Dla każdej grupy wymieszać białka i adiuwant wymagane dla każdej szczepionki. Zawsze przygotowywać jedną dodatkową próbkę do szczepienia, aby zapewnić dokładność. 
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Grupa</td>
 <td >1a szczepionka 
 (200 μL/mysz)</td>
 <td >2a szczepionka 
 (200 μL/mysz)</td>
 <td >3a szczepionka 
 (200 μL/mysz)</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >białko rRBD</td>
 <td >20 μg białka w PBS 
 (100 μL) + 100 μL SAS</td>
 <td >10 μg białka w PBS (100 μL) + 100 μL SAS</td>
 <td >10 μg białka w PBS (100 μL) + 100 μL SAS</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >kontrola PBS</td>
 <td >100 μL PBS + 
 100 μL SAS</td>
 <td >100 μL PBS + 
 100 μL SAS</td>
 <td >100 μL PBS + 
 100 μL SAS</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Protokół immunizacji myszy</li>
<li>Przeprowadzić pierwszą immunizację podskórną samic myszy BALB/c (w wieku 4-6 tygodni, 5 myszy/grupa), a następnie dwukrotnie podać dawkę przypominającą z rRBD i SAS, jak wskazano w Tabeli 2. Grupę PBS stosować jako kontrolę. Jako miejsce wstrzyknięć podskórnych zazwyczaj wybiera się luźną skórę między łopatkami. Alternatywnie często stosuje się brzuszną stronę brzucha, ponieważ ułatwia to iniekcję i pozwala zaobserwować ewentualne wycieki z miejsc wstrzyknięcia. Przy stosowaniu powtarzających się dawek szczepionek łatwo jest wybierać różne miejsca wstrzyknięcia, co zapobiega potencjalnym miejscowym reakcjom skórnym.</li>
<li>Pobrać krew z myszy metodą zatocza zakrzepowego w znieczuleniu przed immunizacją oraz 10 dni po każdym szczepieniu; naświetlać surowice w temperaturze 56°C przez 30 min w celu inaktywacji dopełniacza. Przechowywać surowice mysie w temperaturze -20°C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Wykrywanie neutralizacji przy użyciu testu neutralizacji pseudowirusów
<ol>
<li>Przygotowanie pseudowirusa SARS
<ol>
<li>Przesiej komórki 293T do 100 mm szalek hodowlanych (2x106 komórek/szalka) 16 h przed transfekcją i hoduj komórki zgodnie z powyższymi instrukcjami.</li>
<li>Przygotuj odczynniki do transfekcji zgodnie z Tabelą 1. Przeprowadź kotransfekcję plazmidu kodującego białko S SARS-CoV oraz plazmidu kodującego genom HIV-1 z defektem białka Env, wykazującego ekspresję lucyferazy (pNL4-3.luc.RE), przy użyciu odczynnika do transfekcji z fosforanu wapnia.</li>
<li>Wymień medium na 10 mL świeżego DMEM zawierającego 10% FBS i 1% P/S 8-10 h po transfekcji. Zbierz nadsącz zawierający pseudowirusa SARS 72 h po transfekcji.</li>
<li>Przefiltruj pseudowirusa przez filtr 0,45 μm. Podziel na aliquoty i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
</ol>
</li>
<li>Test neutralizacji pseudowirusa SARS
<ol>
<li>Przesiej komórki 293T wykazujące ekspresję receptora ACE2 SARS-CoV (ACE2/293T) w zagęszczeniu 104 komórek/100 μL/studzienkę w 96-dołkowych płytkach hodowlanych 16 h przed infekcją.</li>
<li>Rozcieńcz pseudowirusa SARS dwukrotnie, aby oznaczyć miano wirusa w komórkach ACE2/293T.</li>
<li>Wykonaj rozcieńczenia seryjne surowic mysich w 96-dołkowych płytkach hodowlanych i dodaj równą objętość mianowanego pseudowirusa SARS. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C przez 1 h.</li>
<li>Po inkubacji dodaj 100 μL mieszaniny surowica-pseudowirus do komórek ACE2/293T i kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37°C w 5% CO2. Po 24 h dodaj świeże DMEM.</li>
<li>Całkowicie usuń nadsącze hodowlane z płytek 72 h po infekcji. Dodaj 1X odczynnik do lizy komórek w hodowli dla lucyferazy (60 μL/studzienkę) i przeprowadź lizę komórek poprzez ciągłe wstrząsanie płytek przez 1-2 h w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieś lizaty komórkowe (50 μL/studzienkę) do płytek do luminometru (96-dołkowe płytki Microfluor). Dodaj substrat lucyferazy (50 μL/studzienkę) dołączony do zestawu testowego lucyferazy i zmierz względną aktywność lucyferazy w luminometrze Ultra 384.</li>
<li>Oblicz miano neutralizacji pseudowirusa SARS i przedstaw jako miano przeciwciał neutralizujących 50% (NT50) 6.</li>
</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li>
<li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theileria+annulata%3A+control+measures%2C+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li>
<li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mouse%2C+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1%2BrV270%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li>
<li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension%3A+a+rapid+mammalian+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li>
<li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li>
<li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian%2C+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li>
<li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li>
<li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li>
<li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies%3A+implication+for+developing+subunit+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li>
<li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li>
<li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li>
<li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension%3A+a+rapid+mammalian+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca%282%2B%29-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li>
<li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Gęstość komórek jest istotnym czynnikiem wpływającym na skuteczność transfekcji opartej na fosforanie wapnia. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepsze wyniki uzyskuje się przy konfluencji komórek poniżej 70%. Aby zatem zwiększyć wydajność transfekcji, zaleca się utrzymanie gęstości komórek na poziomie około 50-70% konfluencji. Metoda transfekcji fosforanem wapnia jest zazwyczaj uważana za mniej wydajną w porównaniu z innymi metodami, takimi jak transfekcja lipidowa 16. W niniejszym protokole zastosowano jednak zmodyfikowaną metodę transfekcji fosforanem wapnia, w której stałe i powolne mieszanie roztworu transfekcyjnego za pomocą voreksu zapewnia powstanie osadu o odpowiedniej wielkości i kształcie, co zwiększa wydajność transfekcji.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12430</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka OPTI-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Roche Group</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30450</td><td></td></tr><tr><td>System adiuwantowy Sigma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6322</td><td></td></tr><tr><td>System do analizy lucyferazy</td><td>Promega Corp.</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy kultur komórkowych lucyferazy (5X)</td><td>Promega Corp.</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra - 15</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Microfluor 96-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7905</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr Ultra 384</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko sars opartych na rbd: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Ze względu na swój profil bezpieczeństwa oraz zdolność do indukowania silnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko infekcjom, szczepionki podjednostkowe są stosowane jako kandydaty do walki z szerokim spektrum patogenów 1-3. Ponieważ system komórek ssaków umożliwia modyfikacje potranslacyjne, tworząc w ten sposób prawidłowo sfałdowane i glikozylowane białka, białka rekombinowane ekspresowane w komórkach ssaków wykazują największy potencjał w zakresie zachowania wysokiej antygenowości i immunogenności 4-6.
Choć od 2004 roku nie zgłoszono nowych przypadków SARS, przyszłe ogniska choroby stanowią stałe zagrożenie; dlatego opracowanie szczepionek przeciwko SARS-CoV jest rozważnym krokiem zapobiegawczym i powinno zostać zrealizowane. Domena RBD białka S SARS-CoV odgrywa istotną rolę w wiązaniu receptorów i indukcji specyficznych przeciwciał neutralizujących przeciwko infekcji wirusowej 7-9. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy nowe metody opracowania podjednostkowej szczepionki opartej na RBD przeciwko SARS. W skrócie, rekombinowane białko RBD (rRBD) wyekspresowano w supernatancie hodowlanym ssaczych komórek 293T, aby uzyskać prawidłowo sfałdowane białko o odpowiedniej konformacji i wysokiej immunogenności 6. Transfekcję komórek rekombinowanym plazmidem kodującym RBD przeprowadzono następnie metodą transfekcji fosforanem wapnia 6,10 z pewnymi modyfikacjami. W porównaniu z metodą transfekcji lipidowej 11,12, ta zmodyfikowana metoda transfekcji fosforanem wapnia jest tańsza, łatwiejsza w obsłudze i ma potencjał do osiągnięcia wysokiej wydajności po uformowaniu kompleksu transfekcyjnego o odpowiednim rozmiarze i kształcie 13,14. Na koniec w protokole wprowadzono test neutralizacji pseudowirusa SARS, który wykorzystano do wykrycia aktywności neutralizującej w surowicach myszy zaszczepionych białkiem rRBD. Test ten jest stosunkowo bezpieczny, nie wymaga użycia zakaźnego SARS-CoV i może być przeprowadzany bez konieczności posiadania laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3) 15.
Opisany tutaj protokół może być również wykorzystany do projektowania i badania rekombinowanych szczepionek podjednostkowych przeciwko innym wirusom z białkami fuzyjnymi klasy I, na przykład HIV, wirusowi RSV, wirusowi Ebola, wirusowi grypy, a także wirusom Nipah i Hendra. Ponadto metody generowania pseudowirusa i następującego po tym opracowania testu neutralizacji pseudowirusa można zastosować w odniesieniu do wszystkich tych wirusów.

Niniejszy protokół opisuje ogólną procedurę badania subunitowych szczepionek opartych na rekombinowanym domenie wiążącej receptor (RBD) przeciwko SARS. Obejmuje on metody transfekcji i ekspresji białka RBD w komórkach 293T, immunizację myszy białkiem RBD oraz wykrywanie aktywności neutralizacji w surowicach mysich przy użyciu uznanego testu neutralizacji pseudowirusa SARS.

Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

Ze względu na swój profil bezpieczeństwa oraz zdolność do indukowania silnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko infekcjom, szczepionki podjednostkowe były stosowane jako kandydaci do szerokiego...

<a class="grey_button" href="/video/3351">
Chiński
</a>

protocol-for-recombinant-rbd-based-sars-vaccines-protein-preparation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Protokół dla szczepionek przeciwko SARS opartych na rekombinowanym RBD: Przygotowanie białka, Szczepienia zwierząt i Wykrywanie neutralizacji

System genetyki odwrotnej dla szczepionkowego szczepu MP-12 wirusa gorączki Doliny Rift jest użytecznym narzędziem do tworzenia dodatkowych mutantów MP-12 o zwiększonej atenuacji i immunogenności. Opisujemy protokół generowania i charakteryzacji szczepów mutantów NSs.

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulacji genem NSs szczepu MP-12 wirusa gorączki doliny Rift w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionki

Ten film demonstruje metodę generowania szczepionek przeciwko pęcherzykom błony zewnętrznej (OMV) wyświetlającym wiele wartości. Komórki ssaków są transfekowane w celu ekspresji i wydzielania antygenów wirusowych połączonych ze znacznikiem SpyTag i znacznikiem polihistydyny. Antygeny te są następnie oczyszczane przy użyciu kolumny powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Oczyszczony antygen miesza się z pęcherzykami błony zewnętrznej wykazującymi ekspresję powierzchniowego...

Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Opisany protokół opisuje procedurę wytwarzania kompleksu białkowego HiBiT wiążącego receptor domeny oraz jego zastosowanie do szybkiego i czułego wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2.

Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Poznaj metodę przygotowania szczepionki rekombinowanej przeciwko SARS opartej na domenie wiążącej receptor RBD. Naucz się ekspresji białka w komórkach 293T, szczepienia myszy i oceny aktywności neutralizującej przy użyciu testu pseudowirusowego.

Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS na bazie RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i wykrywanie neutralizacji (Wideo) | JoVE Journal

Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

Przeglądaj więcej filmów