Name: Wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy za pomocą zymografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Naucz się wykrywać aktywność metaloproteinaz macierzy (MMP) za pomocą zymografii żelatynowej. Ta metoda pozwala analizować aktywność enzymów w nadnatworach komórkowych i płynach ustrojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. S. Resslerowi (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) za zasugerowanie użycia koncentratorów białek w celu zwiększenia stężenia MMP w nadnadpłynach z kultur komórkowych.
Projekt ten był wspierany przez granty z funduszu badawczego Mrs. Clifford Elder White Graham Endowed Research Fund oraz NIH/NIAMS (AR059838) przyznane CB. Treść opracowania leży wyłącznie po stronie autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko NIH.

1. Nakładanie próbek i prowadzenie elektroforezy
<ol>
	<li>Wszystkie próbki muszą zostać odpowiednio przygotowane, aby zachować aktywność enzymów, i użyte niezwłocznie po pobraniu lub przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80°C. Próbki nie mogą zawierać czynników redukujących (takich jak β-merkaptoetanol) ani nie mogą być gotowane przed nałożeniem na żel.</li>
	<li>Otwórz opakowanie zawierające żel w kasecie, a następnie wypłucz kasetę wodą dejonizowaną.
	<ul>
		<li>Usuń taśmę ochronną z dołu kasety oraz grzebień z góry żelu.</li>
		<li>Wypłucz dołki trzy razy buforem do elektroforezy (rozcieńczonym do 1X w wodzie dejonizowanej).</li>
		<li>Umieść żel w Mini-Cell, upewniając się, że krótszy bok kasety jest skierowany do wewnątrz. Zablokuj go za pomocą klina do napinania żelu (Gel Tension Wedge). Mini-Cell umożliwia równoległe prowadzenie elektroforezy jednego lub dwóch żeli.</li>
		<li>Napełnij górną (wewnętrzną) komorę buforem do elektroforezy 1X powyżej poziomu dołków i sprawdź, czy nie ma wycieków. W przypadku wycieków usuń bufor i ponownie ustaw żel.</li>
		<li>Napełnij dolną komorę buforem do elektroforezy 1X.</li>
	</ul>
 </li>
	<li>W jednym dołku nanieś 10 μL markeru masy cząsteczkowej białek. 
	<ul>
		<li>Wymieszaj próbkę z równą ilością buforu do nakładania na żel i nanieś do dołków za pomocą końcówek do nakładania próbek (wymienianych po każdej próbce). Do dołków można nanieść łącznie do 20 μL.</li>
	</ul>
 </li>
	<li>Załóż pokrywę na Mini-Cell i podłącz przewody elektrod do zasilacza. Włącz zasilacz i ustaw stałe napięcie 125 V na 90 minut. Sprawdź, czy na drucie w dolnej komorze tworzą się małe pęcherzyki, co wskazuje na przepływ prądu.</li>
	<li>Podczas prowadzenia pierwszego żelu monitoruj postęp migracji co 15 minut, używając błękitu bromofenolowego zawartego w buforze do nakładania jako wskaźnika. Prowadź elektroforezę do momentu, aż barwnik wskaźnikowy dotrze do dolnej krawędzi żelu.</li>
</ol>
2. Renaturacja i wywoływanie żelu
<ol>
	<li>Dla każdego żelu przygotuj 100 mL 1X buforu renaturującego oraz 200 mL buforu denaturującego, oba w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Gdy barwnik śledzący błękit bromofenolowy dotrze do dolnej krawędzi żelu, wyłącz zasilacz, otwórz Mini-Cell i wyjmij żel. Rozdziel obie strony kasety za pomocą noża do żelu (lub szpatułki do ważenia). Odetnij róg, aby zaznaczyć kierunek żelu.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go w pojemniku z 100 mL buforu renaturującego. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Usuń bufor renaturujący i dodaj do żelu 100 mL buforu wywoływującego. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Usuń bufor wywoływujący i dodaj do żelu kolejne 100 mL buforu wywoływującego. Inkubuj przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Usuń bufor wywoływujący i wypłucz żel trzy razy (po 5 minut każdy) wodą dejonizowaną przy łagodnym mieszaniu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zeskanuj żel, aby zapisać dokładne położenie prążków standardu białkowego, ponieważ po barwieniu żelu staną się one słabiej widoczne lub całkowicie niewidoczne.</li>
	<li>Zbarw żel, dodając do niego 20 mL SimplyBlue Safestain. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Usuń SimplyBlue SafeStain i odbarwiaj żel w 100 mL lub większej ilości wody dejonizowanej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Aby uzyskać lepsze wyniki, wymień wodę na świeżą wodę dejonizowaną i inkubuj przez kolejną godzinę lub dłużej w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjmij żel z wody i umieść go w plastikowej koszulce ochronnej.</li>
	<li>Zeskanuj żel z rozdzielczością 300 dpi lub wyższą. Zapisz obraz w formacie TIFF (Rycina 1A).</li>
	<li>Zmierz intensywność prążków za pomocą programu ImageJ (lub innego podobnego oprogramowania). 
	<ul>
		<li>Otwórz plik TIFF w programie ImageJ (Rycina 1A).</li>
		<li>Wyświetl obraz w czerni i bieli, wybierając „Image&gt;Type&gt;8-bit” (Rycina 1B).</li>
		<li>Użyj prostokątnego narzędzia zaznaczania, aby obrysować pierwszy prążek, rysując prostokąt, którego wysokość jest co najmniej dwukrotnie większa niż szerokość (jest to wymóg oprogramowania).</li>
		<li>Naciśnij „1” lub wybierz „Analyze&gt;Gels&gt;Select first lane”, aby obrysować prążek.</li>
		<li>Pojawi się nowy prostokąt; przesuń go na następny prążek i wybierz „Analyze&gt;Gels&gt;Select next lane”. Powtarzaj czynność, aż wszystkie prążki zostaną zaznaczone (Rycina 1B).</li>
		<li>Naciśnij „3” lub wybierz „Analyze&gt;Gels&gt;Plot lanes”, aby wygenerować wykres profilu dla każdego prążka (Rycina 1C).</li>
		<li>Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostych (powinno być już automatycznie wybrane), aby narysować linie bazowe tak, aby interesujący nas pik stanowił całkowicie zamknięty obszar.</li>
		<li>Wybierz narzędzie „wand” (czarodziej) i kliknij wewnątrz każdego piku, aby go zaznaczyć.</li>
		<li>Wybierz „Analyze&gt;Gels&gt;Label peaks”, aby uzyskać tabelę z polem powierzchni każdego zaznaczonego piku. Dane te można przedstawić w formie wykresu (Rycina 1D) lub znormalizować względem wartości wybranego prążka. Normalizacja ta jest szczególnie istotna przy łączeniu wartości z kilku powtórzeń żeli w celu określenia istotności statystycznej wyników.</li>
</ul>
</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiamy żel z 11 studzienkami wypełnionymi różnymi supernatantami z hodowli komórkowych, zawierającymi różne ilości MMP-2 (Rycina 1A). Bezpośrednia obserwacja tego żelu wykazuje wyraźne różnice w stężeniach MMP-2 pomiędzy niektórymi studzienkami. Na przykład widać wyraźnie, że studzienki nr 4 i 5 zawierają znacznie więcej MMP-2 niż studzienka nr 11 czy nawet studzienka nr 10. Do obiektywnej kwantyfikacji prążków zastosowaliśmy densytometrię z użyciem oprogramowania ImageJ (Rycina 1B-D), co potwierdziło około 4-krotną różnicę w ilości MMP-2 pomiędzy studzienką nr 11 a studzienkami nr 4 i 5 oraz około 2-krotną różnicę w ilości MMP-2 pomiędzy studzienką nr 10 a studzienkami nr 4 i 5.
<img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Wyniki elektroforezy; prążki żelowe, piki absorbancji, analiza intensywności prążków na wykresie słupkowym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Detekcja MMP-2 za pomocą zymografii żelatynowej. A, Obraz zeskanowanego żelu żelatynowego. Numery studzienek są wskazane u góry żelu. B, Ten sam żel co w A, przedstawiony w czerni i bieli do analizy densytometrycznej. Każdy prążek został zaznaczony prostokątem w programie ImageJ. C, Dwa przykłady profili densytometrycznych dla żelu przedstawionego w A i B (prążki nr 4 i nr 11). U podstawy każdego piku narysowano linię prostą w celu utworzenia zamkniętego obszaru. D, Wykres pól powierzchni pików dla żelu przedstawionego w A i B przed (lewo) i po (prawo) normalizacji do gęstości prążka nr 1.
<img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Elektroforeza żelowa i wykres słupkowy przedstawiający poziomy białek Pro-MMP-2 i MMP-2 w próbkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Ten rysunek demonstruje, w jaki sposób zymografia może być wykorzystana jako technika półilościowa. W 7 kolejnych dołkach naniesiono rozcieńczenia seryjne (kroki rozcieńczeń 1:1) i zmierzono gęstość prążków zarówno dla pro-MMP-2, jak i MMP-2.

<ol><li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li>
<li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li>
<li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+regulators+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li>
<li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li>
<li>Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metallopreoteinases%3A+what+do+they+not+do%3F+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li>
<li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+%28TIMPs%29%3A+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li>
<li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+matrix+metalloproteinases+%28MMPs%29+activities%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li>
<li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li>
<li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+activity+assays%3A+importance+of+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+zymography%3A+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li>
<li>Yu, W. H., Woessner, J. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania analizy zymograficznej MMP-2 w supernatantach kultur komórkowych.
Ilość próbki do naniesienia na żel musi zostać określona empirycznie, w zależności od pochodzenia i interesującej nas MMP. Naniesienie zbyt małej ilości uniemożliwi detekcję, natomiast naniesienie zbyt dużej ilości może prowadzić do nasycenia, ponieważ proteaza może strawić jedynie ograniczoną ilość substratu w obszarze prążka. W razie potrzeby próbkę można rozcieńczyć w wodzie dejonizowanej przed zmieszaniem z buforem do nakładania lub skrócić czas wywoływania z całej nocy do 4 godzin. Możliwe jest również zagęszczenie białek w roztworze przy użyciu koncentratorów (np. Millipore katalog nr UFC803024). Jeśli prążki pozostają ledwo widoczne, może być konieczne wywoływanie żeli przez dłuższy czas, nawet do 48 godzin. Przy przygotowywaniu próbek z nadsączów kultur tkankowych należy zwrócić uwagę, że płodowa surowica bydlęca (oraz inne surowice) zawiera MMP, które mogą wpływać na wyniki. Z tego powodu wszystkie nadsącze zbieramy po hodowli w medium wolnym od surowicy.
Przemycia opisane w punktach 2.9 i 2.10 protokołu są niezbędne do usunięcia tła z trawionych prążków. Dłuższy czas przemywania pozwoli usunąć więcej tła, ale spowoduje również osłabienie intensywności barwienia substratu w całym żelu. Jeśli wymagany jest dłuższy czas przemywania, zalecamy skanowanie żelu co kilka godzin, aby wybrać skan o najlepszym kontraście.
Tę technikę można wykorzystać do wykrywania innych MMP. Na przykład MMP-9 można wykryć na żelach żelatynowych, a w mniejszym stopniu również MMP-1, MMP-8 i MMP-13, ponieważ żelatyna nie jest ich preferowanym podłożem. MMP-1 i MMP-13 najlepiej wykrywa się za pomocą zymografii kolagenowej, natomiast kazeina jest preferowanym podłożem dla MMP-11 i pozwala również na wykrycie MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 oraz MMP-139. 
MMP-7 (matrylizyna) oraz kolagenazy (MMP-1 i MMP-13) są trudne do wykrycia, gdy występują w niskich stężeniach w żelach kazeinowych lub żelatynowych. Dodanie heparyny do próbki w momencie nakładania na żel znacznie poprawia granicę wykrywalności dla MMP-7. W przypadku MMP-1 i MMP-13 heparynę należy dodać do żelu, gdy elektroforeza jest już w toku12.
Ponieważ zymografia mierzy aktywność enzymatyczną po denaturacji i renaturacji enzymów, pozwala ona na oznaczenie aktywności wszystkich MMP obecnych w próbce. Obejmuje to enzymy, proenzymy oraz enzymy związane z inhibitorami endogennymi (np. TIMP-2). Możliwe jest jednak określenie stopnia aktywacji MMP w próbce poprzez porównanie gęstości prążka enzymu aktywnego z gęstością prążka proenzymu, który charakteryzuje się nieco wyższą masą cząsteczkową.
Zymografia często okazuje się niewystarczająca do zidentyfikowania konkretnej MMP. Porównanie poziomu migracji MMP ze znanymi standardami masy cząsteczkowej pomaga w identyfikacji, jednak należy zauważyć, że niektóre z tych standardów zawierają czynnik redukujący i w warunkach nieredukcyjnych mogą wskazywać inną masę cząsteczkową9. Alternatywnym rozwiązaniem jest naniesienie rozpuszczalnej rekombinowanej MMP na ten sam żel co próbki badawcze. MMP mogą jednak wiązać się z innymi białkami, co powoduje zmianę pozornej masy cząsteczkowej. Podczas inkubacji w buforze wywoławczym do żelu (lub części żelu przeciętego na pół) można dodać selektywne inhibitory MMP jako narzędzia farmakologiczne do identyfikacji interesującej nas MMP. W celu potwierdzenia identyfikacji danej MMP zaleca się zastosowanie drugiej techniki (Western Blot, immunocytochemii lub testu ELISA). Należy przy tym pamiętać, że granice detekcji w metodzie Western Blot są często znacznie niższe niż w przypadku żeli zymograficznych, co przy zastosowaniu tej techniki może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych.

<table><tbody><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell aparat do elektroforezy w układzie CE</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz (model 302)</td><td>VWR international</td><td>93000-744</td><td></td></tr><tr><td>Żele do zymogramów Novex 10% żelatyny, 1,0 mm, 12 studzienek</td><td>Invitrogen</td><td>EC61752BOX</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do ładowania żelu Blue Juice</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do nakładania próbek na żel</td><td>VWR international</td><td>53509-015</td><td></td></tr><tr><td>Marker masy cząsteczkowej białek</td><td>Invitrogen</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy Novex Tris-Glicyna-SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Bufor renaturujący do zymogramów Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2670</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wywołujący do zymogramów Novex</td><td>Invitrogen</td><td>LC2671</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Skaner fotograficzny Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>Autor: W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr></tbody></table>

wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy metodą zymografii

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Metaloproteinazy macierzy (MMPs) są cynkozależnymi endopeptydazami. Degradują one białka poprzez rozszczepianie wiązań peptydowych. Zidentyfikowano ponad dwadzieścia MMP, które są podzielone na sześć grup w zależności od ich struktury i swoistości substratowej (kolagenazy, żelatynazy, MMP typu błonowego [MT-MMP], stromelizyny, matrylizyny i inne). MMP odgrywają kluczową rolę w inwazji komórek, degradacji chrząstki, przebudowie tkanek, gojeniu ran oraz embriogenezie. Uczestniczą zatem zarówno w procesach fizjologicznych, jak i w patogenezie wielu chorób, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, nowotwory czy przewlekła obturacyjna choroba płuc1-6. W niniejszym materiale skupimy się na MMP-2 (żelatynaza A, kolagenaza typu IV), która jest szeroko eksprymowaną metaloproteinazą. Przedstawimy sposób wykrywania MMP-2 w nadsączach z hodowli komórkowych za pomocą zymografii – powszechnie stosowanej, prostej, a zarazem bardzo czułej techniki, opisanej po raz pierwszy w 1980 roku przez C. Heussena i E.B. Dowdle'a7-10. Technika ta jest półilościowa, zatem może być wykorzystana do określenia poziomu MMP w próbkach badawczych, gdy na ten sam żel naniesione zostaną znane stężenia rekombinowanych MMP11.
Roztwory zawierające MMP (np. nadsączki z hodowli komórkowych, mocz lub surowicę) nanosi się na żel poliakrylamidowy zawierający dodecylosiarczan sodu (SDS; w celu linearyzacji białek) i żelatynę (substrat dla MMP-2). Bufor do próbek został opracowany tak, aby zwiększyć lepkość próbki (ułatwiając nakładanie na żel), dostarczyć barwnika śledzącego (błękit bromofenolowy; do monitorowania migracji próbki), dostarczyć cząsteczek denaturujących (do linearyzacji białek) oraz kontrolować pH próbki. Następnie białka migrują pod wpływem prądu elektrycznego w buforze do elektroforezy, który zapewnia stałą szybkość migracji. Odległość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do masy cząsteczkowej białka (małe białka poruszają się przez żel szybciej niż duże, a zatem migrują dalej w głąb żelu). Po migracji żel umieszcza się w buforze renaturującym, aby umożliwić białkom odzyskanie ich struktury trzeciorzędowej, niezbędnej do aktywności enzymatycznej. Następnie żel umieszcza się w buforze wywoławczym, który umożliwia proteazie trawienie jej substratu. Bufor wywoławczy zawiera również octan p-aminofenylortęciowy (APMA) w celu aktywacji nieproteolitycznych pro-MMP do aktywnych MMP. Kolejnym krokiem jest barwienie substratu (w naszym przykładzie żelatyny). Po wypłukaniu nadmiaru barwnika z żelu, obszary trawienia przez proteazę pojawiają się jako jasne prążki. Im jaśniejszy prążek, tym wyższe stężenie zawartej w nim proteazy. Intensywność barwienia prążków można następnie określić za pomocą densytometrii, wykorzystując oprogramowanie takie jak ImageJ, co pozwala na porównanie próbek.

Niniejszy protokół opisuje test oparty na aktywności enzymatycznej do wykrywania metaloproteinaz macierzy w nadsączach z kultur komórkowych lub płynach ustrojowych.

Wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy metodą zymografii

Metaloproteinazy macierzy (MMP) to zawierające cynk endopeptydazy. Degradują one białka poprzez rozszczepianie wiązań peptydowych. Zidentyfikowano ponad dwadzieścia MMP...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy. Osiąga się to poprzez przygotowanie próbki do elektroforezy poprzez dodanie buforu do nakładania prób pozbawionego czynników redukujących. Następnie na żel z żelatyną nakłada się próbkę i prowadzi elektroforezę do momentu, aż barwnik śledzący dotrze do końca żelu.Po elektroforezie żel zostaje poddany renaturacji, wywołaniu, barwieniu i odbarwianiu. Ostatnim etapem procedury jest zeskanowanie żelu w celu analizy danych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące aktywność metaloproteinaz macierzy w próbkach poprzez analizę gęstości prążków.Witajcie, reprezentuję laboratorium dr Kristin Bitten z Katedry Fizjologii Molekularnej i Biofizyki w LER College of Medicine. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykrywania metaloproteinaz macierzy za pomocą zymografii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania metaloproteinaz macierzy wydzielanych przez hodowane pierwotne komórki.Przejdźmy do części badawczej. Przed rozpoczęciem tego protokołu należy odpowiednio przygotować wszystkie metaloproteinazy macierzy (MMPs), aby zachować aktywność enzymów. Próbki można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.Tutaj MMP-2, znana również jako żelatynaza A lub kolagenaza typu IV, jest wykorzystywana do wykazania wizualizacji aktywności MMP za pomocą zymografii. Po przygotowaniu enzymów MMP, należy pobrać worek z żelem do zymografii żelatynowej 10%, zawierający żel wewnątrz kasety. Przepłucz kasetę wodą dejonizowaną.Usuń taśmę ochronną z dołu kasety oraz grzebień z góry żelu. Przepłucz dołki trzy razy buforem do elektroforezy Tris-glicyna z SDS.Umieść żel w aparacie do elektroforezy w mini-komorze, upewniając się, że krótszy bok kasety jest skierowany do wewnątrz. Zablokuj żel za pomocą klina napinającego. Napełnij górną komorę aparatu buforem do elektroforezy Tris-glicyna SDS powyżej poziomu studzienek i sprawdź, czy nie ma wycieków.Napełnić również dolną komorę zestawu do elektroforezy żelowej buforem do elektroforezy. Następnie nanieść 10 µL markera białkowego. Zmieszać równą ilość próbki z buforem do nakładania na żel, który nie zawiera czynników redukujących.W przeciwieństwie do standardowej elektroforezy SDS-PAGE, nie należy gotować próbek, lecz wprowadzić je bezpośrednio do studzienek żelu. Przy użyciu końcówek do nakładania próbek, w studzienkach tych można zmieścić objętość do 20 µL. Nałóż pokrywę na kasetę do elektroforezy i podłącz przewody elektrod do zasilacza.Włącz zasilacz i ustaw żel na stałe napięcie 125 V przez 90 minut. Podczas prowadzenia pierwszej elektroforezy sprawdź, czy na drucie w dolnej komorze tworzą się małe pęcherzyki, co wskazuje na przepływ prądu. Monitoruj postęp migracji co 15 minut, wykorzystując błękit bromofenolowy zawarty w buforze do nakładania próbek jako wskaźnik dla każdego żelu.Przygotować 100 mililitrów buforu Rena o stężeniu jeden raz xmo gram oraz 200 mililitrów buforu wywołującego o stężeniu xmo gram, oba w wodzie dejonizowanej. Gdy barwnik śledzący bromo-fenolowy dotrze do dolnej krawędzi żelu, wyłączyć zasilacz. Otworzyć minikomorę i wyjąć żel.Rozdziel dwie strony kasety. Za pomocą noża do żeli odetnij narożnik, aby zaznaczyć kierunek żelu. Ostrożnie wyjmij żel z kasety i umieść go w naczyniu zawierającym 100 mililitrów buforu Rena.Inkubować żel przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu, usunąć bufor Rena i dodać do żelu 100 mililitrów buforu wywoływującego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Następnie usunąć bufor wywoływujący i dodać do żelu kolejne 100 mililitrów świeżego buforu wywoływującego.Inkubuj żel przez noc w temperaturze 37°C. Po inkubacji nocnej usuń bufor wywoławczy i wypłucz żel, inkubując go w wodzie dejonizowanej przy delikatnym wytrząsaniu. Powtórz to płukanie dwukrotnie, za każdym razem przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Umieść żel w plastikowej koszulce i usuń pęcherzyki powietrza. Następnie zeskanuj żel skanerem fotograficznym, aby zapisać dokładne położenie pręgów standardu białkowego, ponieważ staną się one niemal niewidoczne po zabarwieniu żelu.Przebarw żel, dodając do niego 20 mililitrów barwnika Simply Blue Safe. Inkubuj żel przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przy łagodnym mieszaniu usuń barwnik Simply Blue Safe i odbarwiaj żel w 100 mililitrach wody dejonizowanej w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.Po jednej godzinie wymienić wodę na świeżą wodę dejonizowaną i kontynuować inkubację żelu przez co najmniej jedną godzinę. Aby przeanalizować dane za pomocą cytometrii, najpierw ostrożnie wyjąć żel z wody i umieścić go w plastikowej koszulce ochronnej. Za pomocą skanera zdjęć zeskanować żel z rozdzielczością 300 dpi lub wyższą.Zapisz obraz w formacie TIFF. Otwórz plik TIFF w programie Image J lub podobnym oprogramowaniu do kwantyfikacji w celu pomiaru intensywności prążków. Wyświetl obraz w czerni i bieli, wybierając typ obrazu ośmiobitowy.Użyj prostokątnego narzędzia zaznaczania, aby obrysować pierwszy prążek, rysując prostokąt, którego wysokość jest co najmniej dwukrotnie większa niż szerokość. Wybierz opcję analizy żeli (analyze gels). Wybierz pierwszą ścieżkę, a prążek zostanie zaznaczony.Następnie pojawi się nowy prostokąt. Przesuń go na kolejny prążek, wybierz Analyze gels, a następnie select next lane. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie prążki zostaną zaznaczone.Wybierz opcję analizy ścieżek żeli (analyze gels plot lanes), aby wygenerować wykres profilu dla każdego prążka. Użyj narzędzia wyboru linii prostej do narysowania linii bazowych w taki sposób, aby interesowany pik stanowił całkowicie zamknięty obszar. Wybierz narzędzie magiczna różdżka (wand tool) i kliknij wewnątrz każdego piku, aby go zaznaczyć.Wybierz opcję analyze gels label peaks, aby uzyskać tabelę z powierzchnią każdego wybranego piku. Dane te można wykreślić w tej formie lub znormalizować względem wartości wybranej prążka. Normalizacja ta jest szczególnie istotna podczas agregowania wartości z kilku powtórzonych żeli w celu określenia istotności statystycznej wyników.Każda studnia żelu przedstawionego tutaj została załadowana inną kulturą komórek. Nadtłustwo zawierało różne ilości MMP 2. Bezpośrednia obserwacja tego żelu wykazuje wyraźne różnice w stężeniach MMP 2 pomiędzy niektórymi studniami.Na przykład wyraźnie widać, że zarówno dołek czwarty, jak i piąty zawierają znacznie więcej MMP 2 niż dołki 10 i 11, co pozwala na obiektywną kwantyfikację prążków. Do analizy gęstości wykorzystano oprogramowanie Image J. Program ten wykazał około czterokrotną różnicę w poziomie mmp.Zaobserwowano dwukrotną różnicę w ilościach między studniami 11 a studniami 4 i 5. Podobnie, dwukrotną różnicę w ilościach MMP2 odnotowano między studnią 10 a studniami 4 i 5. Przedstawiamy w ten sposób sposób wykrywania parametrów funkcjonalnych.Metal persis opracowany przez xog. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o niegotowaniu próbki. W przeciwnym razie na żelu nie będzie widocznych żadnych prążków.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy przez zymografię

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

W tym filmie wykonujemy zymografię, technikę elektroforetyczną, aby przeanalizować aktywność proteolityczną w próbkach biologicznych.

Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Ten film demonstruje technikę elektroforezy żelowej zymografii do oceny aktywności metaloproteinaz macierzy (MMP) obecnych w supernatancie hodowli komórkowej. Aktywne MMP degradują specyficzny dla MMP substrat osadzony w żelu poliakrylamidowym, który po barwieniu pojawia się jako przezroczyste pasma na ciemnym zabarwionym tle.

Elektroforeza żelowa zymografii: technika elektroforetyczna do wykrywania metaloproteinaz macierzy poprzez ocenę aktywności enzymatycznej

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Tutaj prezentujemy protokół do określania specyficzności proteazy w surowych ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii MALDI-TOF.

Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Oczyszczanie, dializa i aktywacja znacznika his-tag są stosowane w celu zwiększenia wydajności rozpuszczalnej, aktywnej metaloproteinazy-3 domeny katalitycznej ekspresji białka u bakterii. Frakcje białkowe są analizowane za pomocą żeli SDS-PAGE.

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Proteinazy są niezbędne dla patogenezy bakterii, umożliwiając inwazję i unikanie odporności. Jednoetapowa ekstrakcja białek cytoplazmatycznych i błonowych bakterii w ich aktywnej postaci jest wstrząsająca. Ten artykuł wideo przedstawia ekstrakcję całych białek komórkowych Leptospira do analizy zymografii w celu wykrycia i scharakteryzowania żelatynaz.

Jednoetapowa ekstrakcja i analiza zymograficzna żelatynaz bakteryjnych

Naucz się wykrywać aktywność metaloproteinaz macierzy (MMP) za pomocą zymografii żelatynowej. Ta metoda pozwala analizować aktywność enzymów w nadnatworach komórkowych i płynach ustrojowych.

Wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy metodą zymografii

Przeglądaj więcej filmów