Test odporności na etanol w celu oceny integralności matrycy biofilmu

Weźmy biofilmy pochodzące z bakterii patogennych uprawiane na agarze odżywczym.

Nieobrobiony biofilm zawiera gęsto upakowane bakterie w ochronnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Biofilm objęty inhibitorem zawiera luźno powiązane komórki w rzadkiej macierzy.

Podziel każdy biofilm na pół, następnie naświetl jedną połowę buforem jako kontrolę, a drugą etanolem, aby wywołać stres przeciwdrobnoustrojowy.

W nieobtworzonym, eksponowanym etanolem biofilmie gęsta matryca zmniejsza dyfuzję etanolem i ogranicza penetrację komórek, co skutkuje mniejszym zabijaniem bakterii.

W biofilmie obtraktowanym inhibitorem i wystawionym na etanol, rzadka matryca pozwala etanolowi łatwiej przenikać, prowadząc do większego zabijania bakterii.

Wiruj rurki i usuń supernatant. Dodaj bufor i sonik, aby rozproszyć komórki.

Nakładaj rozcieńczone zawiesiny i inkubuj, aby umożliwić wzrost żywotnych bakterii.

Liczą jednostki tworzące kolonie (CFU); mniej CFU z biofilmu objętego inhibitorami i wystawionym na etanol potwierdza, że integralność matrycy jest niezbędna dla oporności na etanol.

Weź czystą żyletkę i pokrój kolonie biofilmu na dwie równe części z pomocą szablonu. Ostrożnie podnieś połowę kolonii czystą łopatką i przelej ją do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, zawierającej 500 mikrolitrów PBS.

Weź drugą połowę kolonii i przelej ją do mikrowirówki zawierającej 500 mikrolitrów 50% etanolu. Będą one używane do oceny odporności na środki sterylizujące. Następnie podobnie weź pierwszą połowę kolonii poddanej D-leucynie i umieść ją w PBS.

Następnie weź drugą połowę tej kolonii i przelej ją na etanol. Wszystkie probówki zawierające połówki biofilmu inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wiruj je przez pięć minut przy 18 000 g.

Używając pipety, ostrożnie usuń supernatant. Dodaj 300 mikrolitrów PBS, a następnie sonikanuj komórki na niskim ustawieniu za pomocą mikrotipowego sonikatora. Dodaj dodatkowe 700 mikrolitrów PBS, aby uzyskać końcową objętość jednego mililitra.

Następnie wykonaj rozcieńczenie szeregowe od 10 do minus siódemki w PBS. Weź 100 mikrolitrów jednego z rozcieńczeń i zaszczep płytkę LB Agaru o zawartości 1,5%. Powtórz ten krok dla dwóch innych rozcieńczeń na próbkę.

Rozsmaruj inokulum za pomocą szklanych kulek, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zbadaj płyty i policz jednostki tworzące kolonie, czyli CFU. Po obliczeniu wartości CFU na mililitr oblicz procent osób, które przeżyły w PBS w porównaniu do leczenia etanolem.