Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie oraz przetestowanie poboru komórkowego, sekrecji i właściwości przeciwwirusowych krystalicznych nanocząsteczek leków przeciwwirusowych, które określamy mianem nano art. Jest to realizowane poprzez wstępne przetwarzanie leków przeciwwirusowych za pomocą homogenizacji sonicznej lub mielenia na mokro. Drugim krokiem procedury jest charakterystyka właściwości fizycznych cząsteczek nano art po izolacji pierwotnych monocytów metodą przeciwprądowej wirowki.

Są one hodowane przez siedem dni w pożywce DMEM zawierającej czynnik stymulujący kolonie makrofagów (MCSF), który indukuje ich różnicowanie w makrofagi pochodzące z monocytów. Trzecim krokiem jest zbadanie poboru, retencji i uwalniania nano art w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów. Ostatnim etapem procedury jest przetestowanie in vitro skuteczności antyretrowirusowej nano art w makrofagach pochodzących z monocytów.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące ułatwiony pobór oraz powolne uwalnianie nano-sztuki z komórek oraz wysoką skuteczność przeciwwirusową. Są one określane poprzez pomiary stężeń leku za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz poprzez badanie materiałów z nadsączu hodowli zainfekowanej za pomocą pomiaru aktywności odwrotnej transkryptazy. Cześć, nazywam się Hanta Aldi i jestem pracownikiem naukowym na stopniu postdoc w laboratorium dr. Howarda Gelmana na University of Nebraska Medical Center.

Przedstawione przez nas metody mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nanomedycyny, w tym w kwestii wykorzystania systemów dostarczania leków opartych na komórkach do rozwoju działań w badaniach translacyjnych. Może to zostać osiągnięte poprzez zastosowanie nanoformułowanej terapii antyretrowirusowej o przedłużonym okresie półtrwania. Nasze badania potwierdzają potencjał wykorzystania nano art w zastosowaniach klinicznych.

Witam, nazywam się Ari Noche i jestem doktorantem w programie MD PhD, pracującym w Laboratorium Neurologii Wschodzącej im. Carol Schwartz. Pod kierunkiem dr. Gendelmana zastosowania technik, które tutaj prezentujemy, rozszerzają się na terapię antyretrowirusową, ponieważ związki w formulacjach nanometrycznych mogą jednocześnie poprawiać biodostępność i farmakokinetykę, redukując przy tym skutki uboczne związane z przyjmowaniem leków. Dzięki wykorzystaniu dostępnych klinicznie leków antyretrowirusowych i zamknięciu ich w nanocząsteczkach, możemy poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych oraz pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.

Witam, jestem dr Howard Gendelman. Jestem lekarzem-naukowcem, profesorem oraz kierownikiem Katedry Farmakologii i Neurobiologii Eksperymentalnej na University of Nebraska Medical Center. Naszym ogólnym celem jest uproszczenie leków antyretrowirusowych, aby uczynić je łatwiej dostępnymi oraz poprawić ich biodystrybucję i farmakokinetykę.

Przekazuję teraz państwa pod opiekę Ari i Seana, którzy zaprowadzą państwa do laboratorium badawczego i zaprezentują proces wytwarzania oraz opracowywania tych nanocząsteczek. Użyteczność kliniczna i rozwój tutaj, w University of Nebraska Medical Center. Aby wytworzyć nanoart metodą mokrego mielenia, najpierw należy odważyć kryształy leku oraz różne surfaktanty, które zostaną użyte do przygotowania nanoformulacji, a następnie zmieszać je z 10 mM buforem HEES o pH 7,8. Używa się do tego mieszadła T 18 ultra Turrax aż do całkowitego rozproszenia; stężenie leku w formulacji powinno wynosić od 1% do 2% w przypadku mielenia ciągłego.

Upewnij się, że chłodziarka i kompresor są włączone, a ciśnienie wyjściowe wynosi około 100 PSI. Następnie przygotuj urządzenie do załadowania mediów mielących do zbiornika i dodaj 50 ml kulek do komory mielącej. Używając lejka, upewnij się, że w gwintach lub poza komorą mielącą nie znajdują się żadne kulki, aby uniknąć wycieków z uszczelnienia mechanicznego. Na koniec sprawdź, czy oring znajduje się na swoim miejscu w komorze mielącej.

Następnie należy wybrać odpowiednią wielkość oczek sita i zabezpieczyć pokrywy, dokręcając nakrętki. Wielkość oczek sita powinna wynosić co najmniej połowę średnicy kulek. Należy zastosować sito o dużych oczkach, aby zapobiec zapychaniu się filtra podczas ciągłego mielenia.

Po opuszczeniu komory mielącej, należy wprowadzić do wlotu produktu zawiesinę leku z różnymi ilościami środków powierzchniowo czynnych. Minimalna objętość zawiesiny powinna wynosić 100 milliliters. Zapobiegnie to przegrzaniu komory mielącej, a także ograniczy zanieczyszczenie kulek dzięki mniejszemu zużyciu części.

Następnie uruchom pompę. Używając jednostki sterującej, należy ustawić szybkość przepływu wymaganą dla danej formulacji. Następnie włącz mieszadło i dostosuj prędkość obrotową na jednostce sterującej.

Prędkość można zwiększyć od 600 obrotów na minutę do 4 320 obrotów na minutę. W przypadku mikro-młyna kulowego należy monitorować temperaturę za pomocą wskaźnika temperatury przymocowanego na górze komory mielącej, aby upewnić się, że nie dochodzi do przegrzania. Następnie należy zmielić próbkę przy różnych prędkościach i przepływach, a następnie pobrać niewielkie alikwoty formulacji o objętości około 1 ml w celu pomiaru wielkości i ładunku przy użyciu dyfrakcyjnego rozpraszania światła w urządzeniu Malvern Zeta Sizer.

Po uzyskaniu pożądanej wielkości cząstek należy zatrzymać mielenie za pomocą jednostki sterującej i, przy wciąż włączonej pompie, zebrać próbkę do kolby, pozwalając na całkowite spłynięcie leku. Należy pamiętać o wyłączeniu pompy po zakończeniu procesu oraz o wyjęciu i oczyszczeniu kulek. Następnie zawiesinę z młyna należy przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów i ustawić wirówkę na 10 000 obrotów na minutę na 30 minut.

Po zakończeniu cyklu wirowania zmierz objętość nadsączu i zastąp go taką samą ilością świeżego roztworu surfaktantu. Po zakończeniu resuspensji przenieś zawiesinę do komory mielącej i miel przez 10 minut. Pobierz alikwot o objętości około jednego mililitra i ponownie zmierz rozmiar oraz ładunek próbki za pomocą analizatora Zeta sizer.

Na koniec, za pomocą HPLC zmierz stężenie preparatów nano art, aby wytworzyć nano art poprzez homogenizację. Używając Avastin Emulex C five, przygotuj kryształy leku oraz różne surfaktanty zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie przenieś zawiesinę do naczynia homogenizującego i rozpocznij recyrkulację. Przed rozpoczęciem homogenizacji próbki upewnij się, że chiller jest włączony.

Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż miernik wskaże 20 000 ± 2000 PSI, a następnie kontynuuj homogenizację do momentu uzyskania docelowej wielkości cząstek. Zazwyczaj trwa to od 45 do 60 minut. Okresowo pobieraj próbkę o objętości około 1 ml i mierz wielkość oraz ładunek zhomogenizowanej zawiesiny przy użyciu zeta sizer centrifuge, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.

Następnie, po zawieszeniu Resus, przenieś zawiesinę do homogenizatora C five. Ponownie uruchom obieg, przywróć ciśnienie homogenizacji do 20 000 ± 2000 PSI i homogenizuj przez 30 minut, aby przeprowadzić proces za pomocą sonikacji przy użyciu procesora ultradźwiękowego cold Palmer. Wlej roztwór chlorometanu, PLGA i leku do 1% roztworu surfaktanta PVA i umieść w kąpieli lodowej w urządzeniu ultradźwiękowym.

Rozpocznij sonikację przy amplitudzie 50%, choć dla mniejszych partii próbek amplitudę można zmniejszyć do około 30%; sonikuj próbkę przez 10 minut. Pobierz niewielką alikwot do analizy wielkości cząstek. Jeśli wielkość cząstek przekracza 1,5 mikrona, sonikuj próbki w odstępach dwuminutowych do maksymalnie 16 minut łącznie.

Próbki należy obserwować pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu i udokumentować obserwacje. Za pomocą mieszadła magnetycznego należy wytworzyć odpowiedni wir w zawiesinie i kontynuować mieszanie przez noc w temperaturze pokojowej. Po 24 godzinach należy zebrać zawiesinę i przelać ją do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.

Odwiruj próbki z prędkością 8,000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 5 °C, odlej nadsącz i resuspenduj połowę próbki w 75 ml filtrowanej wody z odwróconej osmozy, a drugą połowę w 75 ml 0,5% surfaktantu CTAB (bromku cetylotrimetyloamoniowego). Ponownie odwiruj próbki z prędkością 8,000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 5 °C i resuspenduj każdy z osadów w łącznej objętości 20 ml roztworu mannitolu. Na koniec, w przypadku cząstek otrzymanych metodą homogenizacji lub sonikacji, zmierz wielkość cząstek za pomocą analizatora ZetaSizer oraz zmierz stężenie próbek metodą HPLC.

Aby przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, należy wziąć przygotowane zawiesiny nano art i poddać je sonikacji przez 10 s. Przy amplitudzie 20% z użyciem sondy sonikacyjnej, należy wziąć szkiełko nakrywkowe i umieścić je na mikroskopie odwróconym. Na szkiełku nakrywkowym.

Wymieszać 15 µL zawiesiny nano-art z 100 µL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, mieszając roztwór poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Następnie nanocząsteczki należy zobrazować przy użyciu obiektywu 20x w celu oceny morfologii. Próbki można również przygotować do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Tutaj widzimy obrazy uzyskane za pomocą niskonapięciowego skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F po izolacji monocytów z krwi poprzez wirowanie, a następnie przeskalowaniu oczyszczonych monocytów do stężenia 1×10⁶ komórek/mL w pożywce DMEM uzupełnionej o następujące dodatki. Następnie wysiewamy 2×10⁶ komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 i inkubujemy przez siedem dni, aby umożliwić różnicowanie monocytów w makrofagi w celu analizy poboru i zbierania komórek. Mieszamy nano art z pożywką hodowlaną do stężenia końcowego 100 µM i dodajemy 1 mL medium terapeutycznego do każdego dołka w wybranym punkcie czasowym lub gdy komórki zostaną całkowicie nasycone nano art.

Usunąć całe medium hodowlane i przemyć komórki trzykrotnie 1 mL PBS, aby usunąć wszystkie cząsteczki, które nie zostały pobrane przez komórki. Usunąć komórki przylegające z dna dołka za pomocą scrapra do komórek (cell lifter) i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Następnie odwirować komórki przy 1000 RCF w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Odrzuć nadsącz i dodaj 200 µL 100% metanolu, aby zlizować komórki i rozpuścić nano art, krótko sonikując osad za pomocą sondy sonikacyjnej przy amplitudzie 20% przez dwie do pięciu sekund. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu analizy zawartości leku. Retencję wewnątrzkomórkową nano art można również zwizualizować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej po przygotowaniu skrawków za pomocą mikrotomu, jak pokazano tutaj.

Szczegóły dotyczące analizy uwalniania nano arch i traktowania komórek należy znaleźć w tekście towarzyszącym do niniejszego artykułu, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą analizy pobierania i zbierania komórek. Jednak zamiast zbierać komórki po przemyciu, należy zastąpić PBS dwiema mililitrami pożywki do hodowli komórkowej bez MCSF i bez nano art w wyznaczone dni lub w momencie, gdy pożywka zmieni kolor na żółty; w wybranym dniu należy wymienić połowę pożywki. Należy pobrać jeden mililitr pożywki komórkowej wraz z powtórzonymi próbkami komórek i poddać je analizie leku.

Aby zwizualizować w czasie rzeczywistym pobieranie nanocząsteczek za pomocą mikroskopii bifokalnej nano art, najpierw należy przygotować barwnik DRE, taki jak vibrant, i dodać go do medium. Zgodnie z instrukcjami producenta, należy dodać medium zawierające barwnik do dojrzałych makrofagów pochodzenia monocytarnego, a następnie trzykrotnie wypłukać komórki, używając 1 mL medium hodowlanego, aby usunąć nadmiar barwnika. Następnie należy wymieszać nano art z medium hodowlanym, używając nano art znakowanego fluorescencyjnie, i dodać medium do traktowania z oznakowanym nano art. Bezpośrednio przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy rejestrować obrazy co 30 sekund przez cztery godziny, używając obiektywu 60x.

Na koniec można przeprowadzić testy infekcji i zakaźności HIV-1. Najpierw należy potraktować komórki zgodnie z opisem dla wizualizacji uwalniania art. Następnie, w wybranych dniach, należy usunąć całe medium i zastąpić je medium bez MCSF, zawierającym HIV-1 AA z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 0,01 cząsteczek wirusa na komórkę, i inkubować przez 24 godziny.

Następnie usunąć medium wirusowe i zastąpić je świeżym wirusem, a następnie hodować komórki w medium wolnym od wirusa przez 10 dni, wymieniając połowę medium co drugi dzień lub w razie potrzeby, aby utrzymać żywotność komórek przez 10 dni po infekcji. Pobrać 10 µL medium z każdej studzienki i przenieść do płytki 96-dołkowej, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy odwrotnej transkrypcji. Można również przeprowadzić późniejsze oznaczenia białka p24 wirusa HIV-1.

Tutaj możemy wyraźnie zobaczyć morfologię komórek eksponowanych na wirusa przy mnożniku infekcji 0,01 w 1. dniu po zastosowaniu nano art. W tych makrofagach pochodzenia monocytarnego nie ma oznak infekcji wirusowej, a nanocząstki są wyraźnie widoczne w cytoplazmie komórek. W tym przypadku komórki zostały eksponowane na wirusa 10 dni po zastosowaniu nano art.

Niektóre z tych komórek zostały zainfekowane, co wskazywało barwienie P 24 oraz tworzenie się wielojądrowych komórek olbrzymich, jednak w porównaniu z komórkami nieleczonymi nadal odnotowano znaczną ochronę. Należy zauważyć, że nanocząsteczki są nadal widoczne w cytoplazmie komórek w B, lecz w mniejszym stopniu niż w a; struktury te nie występują w komórkach, które nie zostały poddane działaniu nano art. Na tych konfokalnych filmach z żywych komórek widzimy makrofagi oznakowane na zielono i nano art oznakowane na czerwono.

Tutaj widzimy, że komórki kumulują bardzo mało nanocząsteczek. W tym przypadku cząsteczki są szybko gromadzone, co wskazuje zwiększona czerwona fluorescencja. Różnice te są zgodne z wynikami uzyskanymi podczas analizy poboru leku. Korzystając z HPLC, możemy dodatkowo zaobserwować, że komórki aktywnie pobierają cząsteczki.

Różnica w tempie akumulacji nano art w komórkach odzwierciedla wpływ charakterystyki fizycznej, takiej jak rozmiar, kształt i ładunek, na zdolność makrofagów do wychwytu i zatrzymania nano art. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wytwarzania nano art przy użyciu technik homogenizacji przez mielenie na mokro oraz sonikacji. Są to skuteczne metody produkcji nanocząsteczek antyretrowirusowych.

Mielenie na mokro i homogenizacja służą do frakcjonowania większych cząsteczek kryształów leku na mniejsze nanocząsteczki w surfaktantach lipidowych, natomiast technika sonikacji pozwala na wytworzenie pojedynczych kropel leku o rozmiarach nano w polimerze. W niniejszym materiale zaprezentowaliśmy również sposób wykorzystania makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów jako platformy testowej do oceny transportu nanocząsteczek. Nasza metoda testowania umożliwia bardzo proste badanie zdolności cząsteczek do bycia pochłanianymi, zatrzymywanymi i uwalnianymi przez komórki, a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusów.

Pozwala to badaczowi zidentyfikować nanostruktury artystyczne, które mogą mieć największą szansę na powodzenie in vivo, a ostatecznie na zastosowanie u zainfekowanych ludzi. Pełne wyniki tych eksperymentów zostały opublikowane w naszym artykule Online Nano. Artykuł zatytułowany Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics ukazał się w czasopiśmie Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Bardzo dziękuję.