Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie oraz przetestowanie poboru komórkowego, sekrecji i właściwości antyretrowirusowych krystalicznych nanocząsteczek antyretrowirusowych, które określamy mianem nano art. Jest to realizowane poprzez wstępne przetworzenie leków antyretrowirusowych za pomocą homogenizacji sonicznej lub mielenia na mokro. Drugim etapem procedury jest charakterystyka właściwości fizycznych cząsteczek nano art po wyizolowaniu pierwotnych monocytów metodą przeciwprądowej wirowania.

Są one hodowane przez siedem dni w medium DMEM zawierającym czynnik stymulujący kolonie makrofagów (MCSF), który indukuje ich różnicowanie w makrofagi pochodzące z monocytów. Trzecim krokiem jest zbadanie pobierania, retencji i uwalniania nano art w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów. Ostatnim etapem procedury jest przetestowanie in vitro skuteczności przeciwwirusowej nano art w makrofagach pochodzących z monocytów.

W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące ułatwione pobieranie i powolne uwalnianie nano art z komórek oraz wysoką skuteczność przeciwwirusową. Są one określane poprzez pomiary stężeń leku za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz poprzez badanie materiałów z nadsączu kultur zakażonych za pomocą pomiaru aktywności odwrotnej transkryptazy. Cześć, nazywam się Hanta Aldi i jestem stypendystą podoktorskim w laboratorium dr. Howarda Gelmana na University of Nebraska Medical Center.

Przedstawione przez nas metody mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny, w tym w kwestii wykorzystania systemów dostarczania leków opartych na komórkach do rozwoju działań w zakresie badań translacyjnych. Można to osiągnąć poprzez zastosowanie nanoformułowanej terapii antyretrowirusowej o przedłużonym okresie półtrwania. Nasze badania potwierdzają potencjał wykorzystania nano ART w zastosowaniach klinicznych.

Witajcie, nazywam się Ari Noche i jestem studentem studiów MD-PhD pracującym w Laboratorium Neurologii Rozwojowej Carol Schwartz. Pod kierownictwem dr. Gendelmana, zastosowanie technik, które tutaj prezentujemy, rozciąga się na terapię antyretrowirusową, ponieważ związki sformułowane w nanoskali mogą jednocześnie poprawić biodostępność i farmakokinetykę, redukując przy tym skutki uboczne związane z przyjmowaniem leków. Poprzez wykorzystanie dostępnych klinicznie leków antyretrowirusowych i ponowne sformułowanie ich w postaci nanocząsteczek, możemy być w stanie poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych oraz pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.

Witam, jestem dr Howard Gendelman. Jestem lekarzem-naukowcem, profesorem oraz kierownikiem Katedry Farmakologii i Neuronauki Eksperymentalnej tutaj, w University of Nebraska Medical Center. Naszym ogólnym celem jest uproszczenie leków antyretrowirusowych, aby uczynić je łatwo dostępnymi oraz poprawić ich biodystrybucję i farmakokinetykę.

Przekazuję teraz głos Ari i Seanowi, którzy zaprowadzą Państwa do laboratorium badawczego i zaprezentują proces wytwarzania oraz opracowywania tych nanocząsteczek. Użyteczność kliniczna i opracowanie tutaj, w University of Nebraska Medical Center. Aby wytworzyć nano-formuły metodą mielenia na mokro, należy najpierw odważyć kryształy leku oraz poszczególne surfaktanty, które zostaną wykorzystane do przygotowania nano-formułacji, a następnie zmieszać je z 10 mM buforem HEPS o pH 7,8. Do całkowitego rozproszenia należy użyć mieszalnika T 18 ultra Turrax; w przypadku mielenia ciągłego zawartość leku w formulacji powinna wynosić od 1 do 2%.

Upewnij się, że chłodziarka i kompresor są włączone, a ciśnienie wyjściowe wynosi około 100 PSI. Następnie przygotuj urządzenie tak, aby można było załadować materiał mielący do zbiornika i dodaj 50 mililitrów kulek do komory mielącej. Używając lejka, upewnij się, że w gwintach lub poza komorą mielącą nie znajdują się żadne kulki, aby uniknąć wycieków z uszczelnienia mechanicznego. Teraz sprawdź, czy pierścień O-ring znajduje się na swoim miejscu w komorze mielącej.

Następnie należy wybrać odpowiednią wielkość oczek sita i zabezpieczyć pokrywy, dokręcając nakrętki. Wielkość oczek sita powinna wynosić co najmniej połowę rozmiaru kulek. Należy zastosować sito o dużych oczkach, aby zapobiec zapchaniu filtra przez produkt podczas ciągłego mielenia.

Po opuszczeniu komory mielącej, do wlotu produktu należy dodać zawiesinę leku z różnymi ilościami surfaktantów. Minimalna objętość zawiesiny powinna wynosić 100 mililitrów. Zapobiegnie to przegrzaniu komory mielącej, a także pozwoli uniknąć zanieczyszczenia kulek dzięki mniejszemu zużyciu części.

Następnie uruchom pompę. Przy użyciu jednostki sterującej należy dostosować szybkość przepływu do wymaganej dla danej formulacji. Następnie włącz mieszadło i ustaw prędkość na jednostce sterującej.

Prędkość może zostać zwiększona z 600 obrotów na minutę do 4 320 obrotów na minutę. W przypadku urządzenia micro sur monitoruj temperaturę za pomocą miernika temperatury zamontowanego na górze komory mielącej, aby upewnić się, że nie dochodzi do przegrzania. Następnie zmiel próbkę przy różnych prędkościach i natężeniach przepływu, pobierając małe alikwoty formulacji o objętości około one milliliter w celu pomiaru wielkości i ładunku za pomocą dyfrakcyjnego rozpraszania światła przy użyciu malvern zeta sizer.

Po uzyskaniu pożądanego rozmiaru zatrzymaj mielenie za pomocą jednostki sterującej i, gdy pompa wciąż pracuje, zbierz próbkę do kolby, pozwalając na całkowite spłynięcie leku. Pamiętaj, aby po zakończeniu wyłączyć pompę oraz wyjąć i wyczyścić kulki. Następnie przenieś zawiesinę z młyna do probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów i ustaw wirówkę na 10 000 obrotów na minutę przez 30 minut.

Po zakończeniu cyklu wirowania zmierz ilość nadsączu i zastąp ją taką samą ilością świeżego roztworu surfaktanta. Po całkowitym resuspensowaniu przenieś zawiesinę do komory mielącej i miel przez 10 minut. Pobierz alikwot o objętości około jednego mililitra i ponownie zmierz rozmiar oraz ładunek próbki za pomocą analizatora Zeta sizer.

Na koniec zmierz stężenie formulacji nano-sztuki za pomocą HBLC, aby wytworzyć nano-sztukę poprzez homogenizację. Używając Avastin Emulex C five, przygotuj kryształy leku oraz różne surfaktanty zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie przenieś zawiesinę do naczynia homogenizującego i rozpocznij recyrkulację. Przed rozpoczęciem homogenizacji próbki upewnij się, że chiller jest włączony.

Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż manometr wskaże 20 000 ± 2000 PSI, i kontynuuj homogenizację do momentu uzyskania docelowej wielkości cząstek. Zazwyczaj trwa to od 45 do 60 minut. Okresowo pobieraj próbkę Eloqua o objętości około jednego mililitra i mierz wielkość oraz ładunek zhomogenizowanej zawiesiny za pomocą wirówki zeta sizer, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Następnie, po zawieszeniu Resus, przenieść zawiesinę do homogenizatora C five. Ponownie uruchomić cyrkulację, przywrócić ciśnienie homogenizacji do 20,000 ± 2000 PSI i homogenizować przez 30 minut, aby przeprowadzić wytwarzanie poprzez sonikację przy użyciu procesora ultradźwiękowego Cold Palmer. Wlać roztwór chlorometanu, PLGA i leku do 1% roztworu surfaktantu PVA, a następnie umieścić w kąpieli lodowej w urządzeniu ultradźwiękowym.

Rozpocznij sonikację przy amplitudzie 50%, choć w przypadku mniejszych partii próbek amplitudę sonikatora można zmniejszyć do około 30%amplitude; sonikuj próbkę przez 10 minut. Pobierz małą alikwot do analizy wielkości cząstek. Jeśli wielkość cząstek przekracza 1,5 mikrona, sonikuj próbki w odstępach dwuminutowych do maksymalnego łącznego czasu 16 minut.

Próbki należy obserwować pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu i udokumentować obserwacje. Za pomocą mieszadła magnetycznego należy stworzyć odpowiedni wir dla zawiesiny, a następnie kontynuować mieszanie przez noc w temperaturze pokojowej. Po 24 godzinach należy zebrać zawiesinę i przelać ją do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.

Odwiruj próbki z prędkością 8 000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 5 °C. Zlej naddatek, a następnie resuspender połowę próbki w 75 ml filtrowanej wody z odwrócenia osmozy, a drugą połowę w 75 ml 0,5% surfaktantu CTAB (bromku trimetyloamoniowego). Ponownie odwiruj próbki z prędkością 8 000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 5 °C i resuspender każdy z osadów w łącznie 20 ml roztworu mannitolu. Na koniec, w przypadku cząstek otrzymanych poprzez homogenizację lub sonikację, zmierz wielkość cząstek za pomocą Zeta Sizer oraz zmierz stężenie próbek za pomocą HPLC.

Aby przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, należy pobrać przygotowane zawiesiny nano art i poddać je sonikacji przez 10 s. Przy amplitudzie 20% z użyciem sondy sonikacyjnej należy wziąć szkiełko nakrywki i umieścić je na mikroskopie odwróconym. Na szkiełku nakrywce.

Wymieszaj 15 µL zawiesiny nano art z 100 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym, mieszając poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Następnie zwizualizuj nanocząstki, używając obiektywu 20x, aby ocenić ich morfologię. Próbki można również przygotować do wizualizacji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Tutaj widzimy obrazy uzyskane za pomocą niskonapięciowego skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F po wyizolowaniu monocytów z krwi poprzez wirowanie oczyszczonych monocytów w stężeniu 1×10⁶ komórek/ml w pożywce DMEM uzupełnionej o następujące dodatki. Następnie wysiano 2×10⁶ komórek na studzienkę w płytkach 6-studzienkowych w atmosferze nawilżonej, z dodatkiem 5% carbon dioxide, i inkubowano przez siedem dni, aby umożliwić różnicowanie się monocytów w makrofagi w celu analizy poboru i gromadzenia komórkowego. Wymieszano nano art z pożywką hodowlaną do końcowego stężenia 100 µM i dodano 1 ml medium z preparatem do każdej studzienki w wybranym punkcie czasowym lub gdy komórki zostały w pełni nasycone nano art.

Usunąć całe medium hodowlane i przemyć komórki trzykrotnie 1 ml PBS, aby usunąć wszystkie cząstki, które nie zostały pobrane przez komórki w 1 ml PBS. Zebrać komórki przylegające z dna dołka za pomocą scrapra do komórek i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml. Następnie odwirować komórki przy 1000 RCF w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Usunąć nadsącz i dodać 200 µL 100% metanolu do lizy komórek, a następnie rozpuścić nano art, krótko poddając pellety sonikacji za pomocą sondy ultradźwiękowej przy amplitudzie 20% przez dwie do pięciu sekund. Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu analizy zawartości leku. Wewnątrzkomórkowa retencja nano art może być również wizualizowana przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego po przygotowaniu przekrojów za pomocą mikrotomu, jak pokazano tutaj.

Szczegółowe informacje dotyczące analizy uwalniania nano arch oraz traktowania komórek należy znaleźć w tekście towarzyszącym do niniejszego artykułu, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą analizy pobierania i zbierania komórek. Jednak zamiast zbierania komórek po przemyciu, należy zastąpić PBS dwiema mililitrami pożywki do hodowli komórkowej bez MCSF i bez nano art w wyznaczonych dniach lub w momencie, gdy pożywka zmieni kolor na żółty. W wybranym dniu należy wymienić połowę pożywki. Należy pobrać jeden mililitr pożywki komórkowej wraz z powtórzonymi próbkami komórek i poddać je analizie zawartości leku.

Aby zobrazować w czasie rzeczywistym pobieranie nano art za pomocą mikroskopii bifokalnej, należy najpierw przygotować barwnik fluorescencyjny, taki jak Vibrant, i dodać go do pożywki. Zgodnie z instrukcjami producenta, dodaj pożywkę zawierającą barwnik do dojrzałych makrofagów pochodzenia monocytarnego, a następnie trzy razy opłucz komórki, używając 1 mL pożywki hodowlanej, aby usunąć nadmiar barwnika. Następnie wymieszaj nano art z pożywką hodowlaną, używając nano art znakowanego fluorescencyjnie, i dodaj pożywkę z nanartem znakowanym do hodowli. Bezpośrednio przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykonuj zdjęcia co 30 sekund przez cztery godziny, używając obiektywu 60x.

Na koniec można przeprowadzić testy infekcji i zakaźności HIV-1. Najpierw należy potraktować komórki zgodnie z opisem dla wizualizacji uwalniania art. Następnie w wybranych dniach usunąć całe medium i zastąpić je medium bez MCSF, zawierającym HIV-1 a A z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 0,01 cząsteczek wirusa na komórkę, a następnie inkubować przez 24 godziny.

Następnie należy usunąć medium wirusowe i zastąpić je świeżym wirusem, a następnie hodować komórki w medium wolnym od wirusa przez 10 dni, wymieniając połowę medium co drugi dzień lub w razie potrzeby, aby utrzymać żywotność komórek przez 10 dni po infekcji. Należy pobrać 10 µL medium z każdej studni umieszczonej na płytce 96-dołkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia analizy odwrotnej transkrypcji. Można również przeprowadzić następujące detekcje HIV-1 p24.

Tutaj możemy wyraźnie zobaczyć morfologię komórek poddanych działaniu wirusa przy mnożności infekcji (MOI) 0,01 w 1. dniu po zastosowaniu nano art. W tych makrofagach pochodzących z monocytów nie ma oznak infekcji wirusowej, a nanocząsteczki są wyraźnie widoczne w cytoplazmie komórek. W tym przypadku komórki poddano działaniu wirusa 10 dni po zastosowaniu nano art.

Niektóre z tych komórek zostały zainfekowane, co wskazywało barwienie P 24 oraz tworzenie się wielojądrowych komórek olbrzymich, jednak nadal odnotowano znaczną ochronę w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Należy zauważyć, że nanocząstki są nadal widoczne w cytoplazmie komórek w B, lecz w mniejszym stopniu niż w a; struktury te nie występują w komórkach, których nie poddano działaniu nano art. Na tych konfokalnych filmach z żywych komórek widzimy makrofagi znakowane na zielono oraz nano art znakowany na czerwono.

Tutaj możemy zauważyć, że komórki kumulują bardzo mało nanocząsteczek. W tym przypadku szybko kumulują one cząsteczki, co wskazuje zwiększona czerwona fluorescencja. Różnice te są analogiczne do wyników uzyskanych podczas analizy poboru leku za pomocą HPLC; ponadto możemy zaobserwować, że komórki aktywnie pobierają cząsteczki.

Różnica w szybkości akumulacji komórkowej nano art odzwierciedla wpływ charakterystyki fizycznej, takiej jak rozmiar, kształt i ładunek, na zdolność makrofagów do pobierania i zatrzymywania nano art. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób wytwarzania nano art przy użyciu technik homogenizacji przez mielenie na mokro oraz sonikacji. Są to skuteczne metody wytwarzania nanocząsteczek antyretrowirusowych.

Mielenie na mokro i homogenizacja służą do frakcjonowania większych kryształów leku na mniejsze nanocząstki w surfaktantach lipidowych, natomiast technika sonikacji pozwala na wytworzenie pojedynczych kropli leku o rozmiarach nanometrycznych wewnątrz polimeru. W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy również sposób wykorzystania makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów jako platformy testowej do oceny transportu nanocząstek. Nasza metoda testowania umożliwia bardzo proste przesiewowe badanie zdolności cząsteczek do bycia pochłanianymi, zatrzymywanymi i uwalnianymi przez komórki, a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusów.

Pozwala to badaczowi zidentyfikować nanostruktury artystyczne, które mogą mieć największe szanse na powodzenie in vivo i ostatecznie na zastosowanie u zainfekowanych ludzi. Pełne wyniki tych eksperymentów zostały opublikowane w naszym artykule Online Nano. Artykuł zatytułowany Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics ukazał się w czasopiśmie Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Dziękujemy bardzo.