Name: Opracowanie metod przenoszenia makrofagów przenoszonych przez krew nanoformułowanych leków antyretrowirusowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 46 s
Description: Poznaj metody produkcji nanoformułowanych leków antyretrowirusowych i ich pobierania przez makrofagi. Techniki mielenia mokrego, homogenizacji oraz sonifikacji umożliwiają ocenę właściwości fizycznych cząsteczek i ich skuteczności przeciwwirusowej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana z grantów 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 oraz P01 NS43985 (przyznanych H.E.G.) z National Institutes of Health. Autorzy dziękują pani Robin Taylor za krytyczne przeczytanie manuskryptu oraz wyjątkowe wsparcie graficzne i literackie. Chcielibyśmy podziękować Steve'owi Grzelakowi za wiedzę ekspercką w zakresie mielenia na mokro. Chcielibyśmy również podziękować dr. Han Chenowi z jednostki mikroskopii elektronowej University of Nebraska-Lincoln za dostarczenie obrazów z transmisyjnego i skaningowego mikroskopu elektronowego. Na koniec dziękujemy Megan Marquart za wiedzę ekspercką w zakresie konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

<ol><li>Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+and+propagation+of+human+immunodeficiency+virus+on+recombinant+colony-stimulating+factor+1-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes.</a> J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+macrophage-based+nanoparticle+platform+for+antiretroviral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery.</a> Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+investigations+for+the+morphologic%2C+pharmacokinetic%2C+and+anti-retroviral+properties+of+indinavir+nanoparticles+in+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 358, 148-158 (2007).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+delivery+of+nanoformulated+antiretroviral+drug+to+the+brain+in+a+murine+model+of+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS.</a> J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulated+Antiretroviral+Drug+Combinations+Extend+Drug+Release+and+Antiretroviral+Responses+in+HIV-1-Infected+Macrophages%3A+Implications+for+NeuroAIDS+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics.</a> J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoART+synthesis%2C+characterization%2C+uptake%2C+release+and+toxicology+for+human+monocyte-macrophage+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed%22%5BJournal%5D)">NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery.</a> Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).</li>
<li>Kalter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HIV+replication+in+macrophage+colony-stimulating+factor-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes.</a> J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

NanoART zostały zaprojektowane w celu usprawnienia terapii HIV-1. Zaproponowaliśmy system dostarczania leków oparty na monocytach i makrofagach jako pierwszy krok w stronę opracowania takich technologii do zastosowań klinicznych oraz jako laboratoryjny system testowy do rozwoju leków w formie nanoformułacji. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że system ten nadaje się do takiego zastosowania5,6.
W niniejszym opracowaniu przedstawiono metody syntezy NP powszechnie stosowanych leków przeciwko HIV-1 (indynawiru, IDV; rytonawiru, RTV; efawiirenzu, EFV oraz atazanawiru, ATV). Osiągnięto to poprzez mielenie na mokro, homogenizację i sonikację. Co istotne, nasze podejście pozwala na modyfikację charakterystyk fizycznych nanoART, takich jak rozmiar, kształt i ładunek 5,6. Poprzez staranny dobór surfaktantów można kontrolować ładunek cząsteczki w zakresie od silnie ujemnego, przez neutralny, aż po silnie dodatni. Poprzez zmianę czasu i intensywności procesu można kontrolować rozmiar, uzyskując cząsteczki o wielkości od ≤ 200 nm do ≥ 3 μm. Kształt cząsteczki również można kontrolować, choć w mniejszym stopniu niż pozostałe charakterystyki fizyczne. Na przykład cząsteczki sferyczne można wytworzyć poprzez sonikację z polimerami, natomiast wieloboczne kształty geometryczne można uzyskać za pomocą mielenia na mokro lub homogenizacji. Mielenie na mokro i homogenizacja dają cząsteczki o różnych kształtach, jednak proces ten zależy od metody frakcjonowania i nie może być bezpośrednio kontrolowany. Właściwości tych metod wytwarzania mogą umożliwić badaczom łatwe otrzymywanie nanoART zgodnie z dokładnymi specyfikacjami projektowymi. Jest to niezwykle ważne, ponieważ właściwości fizykochemiczne nanoART mają silny wpływ zarówno na ich stabilność, jak i na sposób oddziaływania z komórkami. Wykazaliśmy na przykład, że nanoART o rozmiarze około 1 μm, silnym ładunku dodatnim i wielobocznym kształcie geometrycznym są szybciej pobierane przez makrofagi, są bardziej stabilne po dostaniu się do wnętrza komórek i uwalniane w dłuższym okresie czasu 6.
Opracowano metodę testowania nanoART, która umożliwia proste badanie zdolności cząsteczek do być pobieranych, zatrzymywanych i uwalnianych przez makrofagi — jedne z głównych komórek docelowych HIV-1 — a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusa. Pozwala to na łatwe różnicowanie nanoART na podstawie ich wydajności i zidentyfikowanie tych, które mają największą szansę na sukces w modelu in vivo, co zwiększa zarówno efektywność, jak i szybkość opracowywania nanoART do zastosowań u ludzi.
Wykazano, że makrofagi z szpiku kostnego myszy, załadowane ex vivo preparatem nanoART i przeniesione adoptywnie poprzez wtryskiwanie dożylne do myszy zhumanizowanych zainfekowanych HIV-1, mogą przemieszczać się do miejsc aktywnej infekcji, w tym do ośrodkowego układu nerwowego, i uwalniać leki przez okres do 2 tygodni w celu zahamowania replikacji wirusa2-4. Ponadto komórki załadowane nanoART były w stanie skutecznie zredukować liczbę zainfekowanych wirusem komórek w osoczu, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie i płucach, a także chronić komórki CD4+2. Badania te, choć wstępne, dowodzą, że komórkowy system dostarczania nanoART może rozprowadzić klinicznie istotne ilości leku zarówno do krwi, jak i do zainfekowanych tkanek. Ze względu na obiecujące wstępne wyniki badań na myszach zainfekowanych HIV-1, obecnie opracowujemy model makaków zainfekowanych wirusem niedoboru odporności u naczelnych, aby dalej testować potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

<table><tbody><tr><td>&lt;silny&gt;Produkcja nanoART&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan indynawiru</td><td>Odczynnik</td><td>Longshem Co., Szanghaj, Chiny</td><td>CAS nr 157810-81-6</td><td></td></tr><tr><td>Rytonawir</td><td>Odczynnik</td><td>China Shengda Pharmaceutical Company, Chiny</td><td>Nr CAS 155213-67-5</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan atazanawiru</td><td>Odczynnik</td><td>Gyma Laboratories of America INC</td><td>Nr CAS 198904-31-3</td><td></td></tr><tr><td>Efavirenz</td><td>Odczynnik</td><td>Hetero Labs LTD, Indie</td><td>Nr CAS 154598-52-4</td><td></td></tr><tr><td>PVA</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8136</td><td></td></tr><tr><td>Karta charakterystyki bezpieczeństwa</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Odczynnik</td><td>Fluka</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>P188</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 1300</td><td></td></tr><tr><td>mPEG 2000-DSPE</td><td>Odczynnik</td><td>Genzyme</td><td>LP-R4-039</td><td></td></tr><tr><td>Dotap</td><td>Odczynnik</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>890890 P</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 75:25</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1941</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td>75-09-2</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>CTAB</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 9151</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Narzędzie</td><td>Denver Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik T-18</td><td>Narzędzie</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonikator</td><td>Narzędzie</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mielenie na mokro, MicroCer</td><td>Narzędzie</td><td>Netzsch Fine Particle Technology, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator, EmulsiFlex-C5</td><td>Narzędzie</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetapotencjometr</td><td>Narzędzie</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System rozdzielczy gazów</td><td>Narzędzie</td><td>Victor Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Badania in vitro&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Cyprofloksacyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki MCSF</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-964</td><td></td></tr><tr><td>Zbiór normalnej surowicy ludzkiej</td><td>Odczynnik</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-88061-68</td><td></td></tr><tr><td>płytki do hodowli tkankowej z 6 dołkami</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>metanol (klasa HPLC)</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml</td><td>Narzędzie</td><td>Krajowa Firma Naukowa</td><td>CN1700GT</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glutaraldehydu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49632</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czterotlenku osmu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5417R</td><td>Narzędzie</td><td>Eppendorf</td><td>022621807</td><td></td></tr><tr><td>rotor z kątem stałym F-45-30-11</td><td>Narzędzie</td><td>Eppendorf</td><td>022636006</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;ADA&lt;/sub&gt;</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysi przeciwciało monoklonalne przeciwko białku p24 HIV-1</td><td>Odczynnik</td><td>Dako</td><td>M0857</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do preparatów mikroskopowych</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Gdy tylko go otrzymam, przygotuję profesjonalne tłumaczenie na język polski, zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru naukowego i terminologii JoVE.&quot;&gt;Skróty użyte w tabeli: IDV: indynawir; RTV: rytonawir; ATV: atazanawir; EFV: efawirenz; PVA: poliwinyloalkohol; SDS: dodecylsiarczan sodu; P188: poloksamer 188 (nazywany również Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metylo-poli(glikol etylenowy)1,2-distearoilowo-fosfatydyloetanoloamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6-[(7-nitro-2&amp;#8211;1,3-benzoksadiazol-4-ylo) amino]heksanoylo]-3-trimetyloamoniowy propan); PLGA: kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego; CTAB: bromek cetylotrimetyloamoniowy; DMEM: pożywka Dulbecco&amp;rsquo;s Modyfikowane Podłoże Eagle; MCSF: czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów; HPLC: wysokosprawna chromatografia cieczowa; HIV-1: ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Leki w formie nanoformułacji mogą poprawić farmakodynamikę i biodostępność, służąc jednocześnie redukcji toksyczności leków w terapii antiretroviralnej (ART). W tym celu nasze laboratorium zastosowało zasady nanomedycyny w celu uproszczenia schematów leczenia ART, a tym samym zmniejszenia toksyczności przy jednoczesnej poprawie przestrzegania zaleceń terapeutycznych oraz farmakokinetyki leków. Przedstawiono proste i niezawodne metody wytwarzania nanoformułowanych leków ART (nanoART). Cząsteczki czystego leku są enkapsulowane w cienkiej warstwie powłoki lipidowej z surfaktantu i wytwarzane poprzez frakcjonowanie większych kryształów leku na mniejsze, wykorzystując mielenie na mokro lub homogenizację wysokociśnieniową. W alternatywnej metodzie wolny lek jest zawieszony w kropli polimeru. W tym przypadku lek rozpuszczany jest w polimerze, a następnie poddawany sonikacji do momentu utworzenia się pojedynczych kropli o rozmiarach nanometrycznych. Dynamiczne rozpraszanie światła oraz badanie mikroskopowe służą do charakterystyki właściwości fizycznych cząsteczek (rozmiaru cząstek, ładunku i kształtu). Ich właściwości biologiczne (wychwyt i retencja komórkowa, cytotoksyczność oraz skuteczność antiretroviralna) są określane z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów (MDM). MDM pochodzą z monocytów krwi obwodowej człowieka, izolowanych z leukopaków przy użyciu elutracji odśrodkowej w celu oczyszczenia. Takie makrofagi pochodzenia krwi mogą być wykorzystywane jako transportery komórkowe do dystrybucji nanoART do organów zainfekowanych wirusem niedoboru odpornościowego (HIV). Zakładamy, że ponowne sformułowanie dostępnych klinicznie leków antiretroviralnych w postaci nanocząsteczek do leczenia HIV-1 może poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych i pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.

Nanocząsteczki indynawiru, rytonaviru, efawirenzu i atazanawiru zostały wytworzone przy użyciu mokrego mielenia, homogenizacji i sonikacji. Te nanoformulacje, określane wspólnie jako nanoformułowana terapia antyretrowirusowa (nanoART), posłużyły do oceny dostarczania leków za pomocą makrofagów. Określono stopień pobierania, retencji i przedłużonego uwalniania nanoART przez makrofagi pochodzące z monocytów. Te wstępne badania sugerują potencjał nanoART do zastosowań klinicznych.

Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Leki w nanoformułowaniach mogą poprawić farmakodynamikę i biodostępność, służąc jednocześnie redukcji toksyczności leków stosowanych w terapii antyretrowirusowej (ART). Aby ...

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie oraz przetestowanie poboru komórkowego, sekrecji i właściwości przeciwwirusowych krystalicznych nanocząsteczek leków przeciwwirusowych, które określamy mianem nano art. Jest to realizowane poprzez wstępne przetwarzanie leków przeciwwirusowych za pomocą homogenizacji sonicznej lub mielenia na mokro. Drugim krokiem procedury jest charakterystyka właściwości fizycznych cząsteczek nano art po izolacji pierwotnych monocytów metodą przeciwprądowej wirowki.Są one hodowane przez siedem dni w pożywce DMEM zawierającej czynnik stymulujący kolonie makrofagów (MCSF), który indukuje ich różnicowanie w makrofagi pochodzące z monocytów. Trzecim krokiem jest zbadanie poboru, retencji i uwalniania nano art w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów. Ostatnim etapem procedury jest przetestowanie in vitro skuteczności antyretrowirusowej nano art w makrofagach pochodzących z monocytów.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące ułatwiony pobór oraz powolne uwalnianie nano-sztuki z komórek oraz wysoką skuteczność przeciwwirusową. Są one określane poprzez pomiary stężeń leku za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz poprzez badanie materiałów z nadsączu hodowli zainfekowanej za pomocą pomiaru aktywności odwrotnej transkryptazy. Cześć, nazywam się Hanta Aldi i jestem pracownikiem naukowym na stopniu postdoc w laboratorium dr. Howarda Gelmana na University of Nebraska Medical Center.Przedstawione przez nas metody mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nanomedycyny, w tym w kwestii wykorzystania systemów dostarczania leków opartych na komórkach do rozwoju działań w badaniach translacyjnych. Może to zostać osiągnięte poprzez zastosowanie nanoformułowanej terapii antyretrowirusowej o przedłużonym okresie półtrwania. Nasze badania potwierdzają potencjał wykorzystania nano art w zastosowaniach klinicznych.Witam, nazywam się Ari Noche i jestem doktorantem w programie MD PhD, pracującym w Laboratorium Neurologii Wschodzącej im. Carol Schwartz. Pod kierunkiem dr. Gendelmana zastosowania technik, które tutaj prezentujemy, rozszerzają się na terapię antyretrowirusową, ponieważ związki w formulacjach nanometrycznych mogą jednocześnie poprawiać biodostępność i farmakokinetykę, redukując przy tym skutki uboczne związane z przyjmowaniem leków. Dzięki wykorzystaniu dostępnych klinicznie leków antyretrowirusowych i zamknięciu ich w nanocząsteczkach, możemy poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych oraz pozytywnie wpłynąć na wyniki leczenia choroby.Witam, jestem dr Howard Gendelman. Jestem lekarzem-naukowcem, profesorem oraz kierownikiem Katedry Farmakologii i Neurobiologii Eksperymentalnej na University of Nebraska Medical Center. Naszym ogólnym celem jest uproszczenie leków antyretrowirusowych, aby uczynić je łatwiej dostępnymi oraz poprawić ich biodystrybucję i farmakokinetykę.Przekazuję teraz państwa pod opiekę Ari i Seana, którzy zaprowadzą państwa do laboratorium badawczego i zaprezentują proces wytwarzania oraz opracowywania tych nanocząsteczek. Użyteczność kliniczna i rozwój tutaj, w University of Nebraska Medical Center. Aby wytworzyć nanoart metodą mokrego mielenia, najpierw należy odważyć kryształy leku oraz różne surfaktanty, które zostaną użyte do przygotowania nanoformulacji, a następnie zmieszać je z 10 mM buforem HEES o pH 7,8. Używa się do tego mieszadła T 18 ultra Turrax aż do całkowitego rozproszenia; stężenie leku w formulacji powinno wynosić od 1% do 2% w przypadku mielenia ciągłego.Upewnij się, że chłodziarka i kompresor są włączone, a ciśnienie wyjściowe wynosi około 100 PSI. Następnie przygotuj urządzenie do załadowania mediów mielących do zbiornika i dodaj 50 ml kulek do komory mielącej. Używając lejka, upewnij się, że w gwintach lub poza komorą mielącą nie znajdują się żadne kulki, aby uniknąć wycieków z uszczelnienia mechanicznego. Na koniec sprawdź, czy oring znajduje się na swoim miejscu w komorze mielącej.Następnie należy wybrać odpowiednią wielkość oczek sita i zabezpieczyć pokrywy, dokręcając nakrętki. Wielkość oczek sita powinna wynosić co najmniej połowę średnicy kulek. Należy zastosować sito o dużych oczkach, aby zapobiec zapychaniu się filtra podczas ciągłego mielenia.Po opuszczeniu komory mielącej, należy wprowadzić do wlotu produktu zawiesinę leku z różnymi ilościami środków powierzchniowo czynnych. Minimalna objętość zawiesiny powinna wynosić 100 milliliters. Zapobiegnie to przegrzaniu komory mielącej, a także ograniczy zanieczyszczenie kulek dzięki mniejszemu zużyciu części.Następnie uruchom pompę. Używając jednostki sterującej, należy ustawić szybkość przepływu wymaganą dla danej formulacji. Następnie włącz mieszadło i dostosuj prędkość obrotową na jednostce sterującej.Prędkość można zwiększyć od 600 obrotów na minutę do 4 320 obrotów na minutę. W przypadku mikro-młyna kulowego należy monitorować temperaturę za pomocą wskaźnika temperatury przymocowanego na górze komory mielącej, aby upewnić się, że nie dochodzi do przegrzania. Następnie należy zmielić próbkę przy różnych prędkościach i przepływach, a następnie pobrać niewielkie alikwoty formulacji o objętości około 1 ml w celu pomiaru wielkości i ładunku przy użyciu dyfrakcyjnego rozpraszania światła w urządzeniu Malvern Zeta Sizer.Po uzyskaniu pożądanej wielkości cząstek należy zatrzymać mielenie za pomocą jednostki sterującej i, przy wciąż włączonej pompie, zebrać próbkę do kolby, pozwalając na całkowite spłynięcie leku. Należy pamiętać o wyłączeniu pompy po zakończeniu procesu oraz o wyjęciu i oczyszczeniu kulek. Następnie zawiesinę z młyna należy przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów i ustawić wirówkę na 10 000 obrotów na minutę na 30 minut.Po zakończeniu cyklu wirowania zmierz objętość nadsączu i zastąp go taką samą ilością świeżego roztworu surfaktantu. Po zakończeniu resuspensji przenieś zawiesinę do komory mielącej i miel przez 10 minut. Pobierz alikwot o objętości około jednego mililitra i ponownie zmierz rozmiar oraz ładunek próbki za pomocą analizatora Zeta sizer.Na koniec, za pomocą HPLC zmierz stężenie preparatów nano art, aby wytworzyć nano art poprzez homogenizację. Używając Avastin Emulex C five, przygotuj kryształy leku oraz różne surfaktanty zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie przenieś zawiesinę do naczynia homogenizującego i rozpocznij recyrkulację. Przed rozpoczęciem homogenizacji próbki upewnij się, że chiller jest włączony.Stopniowo zwiększaj ciśnienie, aż miernik wskaże 20 000 ± 2000 PSI, a następnie kontynuuj homogenizację do momentu uzyskania docelowej wielkości cząstek. Zazwyczaj trwa to od 45 do 60 minut. Okresowo pobieraj próbkę o objętości około 1 ml i mierz wielkość oraz ładunek zhomogenizowanej zawiesiny przy użyciu zeta sizer centrifuge, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.Następnie, po zawieszeniu Resus, przenieś zawiesinę do homogenizatora C five. Ponownie uruchom obieg, przywróć ciśnienie homogenizacji do 20 000 ± 2000 PSI i homogenizuj przez 30 minut, aby przeprowadzić proces za pomocą sonikacji przy użyciu procesora ultradźwiękowego cold Palmer. Wlej roztwór chlorometanu, PLGA i leku do 1% roztworu surfaktanta PVA i umieść w kąpieli lodowej w urządzeniu ultradźwiękowym.Rozpocznij sonikację przy amplitudzie 50%, choć dla mniejszych partii próbek amplitudę można zmniejszyć do około 30%; sonikuj próbkę przez 10 minut. Pobierz niewielką alikwot do analizy wielkości cząstek. Jeśli wielkość cząstek przekracza 1,5 mikrona, sonikuj próbki w odstępach dwuminutowych do maksymalnie 16 minut łącznie.Próbki należy obserwować pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu i udokumentować obserwacje. Za pomocą mieszadła magnetycznego należy wytworzyć odpowiedni wir w zawiesinie i kontynuować mieszanie przez noc w temperaturze pokojowej. Po 24 godzinach należy zebrać zawiesinę i przelać ją do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.Odwiruj próbki z prędkością 8,000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 5 °C, odlej nadsącz i resuspenduj połowę próbki w 75 ml filtrowanej wody z odwróconej osmozy, a drugą połowę w 75 ml 0,5% surfaktantu CTAB (bromku cetylotrimetyloamoniowego). Ponownie odwiruj próbki z prędkością 8,000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 5 °C i resuspenduj każdy z osadów w łącznej objętości 20 ml roztworu mannitolu. Na koniec, w przypadku cząstek otrzymanych metodą homogenizacji lub sonikacji, zmierz wielkość cząstek za pomocą analizatora ZetaSizer oraz zmierz stężenie próbek metodą HPLC.Aby przygotować próbki do wizualizacji mikroskopowej, należy wziąć przygotowane zawiesiny nano art i poddać je sonikacji przez 10 s. Przy amplitudzie 20% z użyciem sondy sonikacyjnej, należy wziąć szkiełko nakrywkowe i umieścić je na mikroskopie odwróconym. Na szkiełku nakrywkowym.Wymieszać 15 µL zawiesiny nano-art z 100 µL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, mieszając roztwór poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Następnie nanocząsteczki należy zobrazować przy użyciu obiektywu 20x w celu oceny morfologii. Próbki można również przygotować do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.Tutaj widzimy obrazy uzyskane za pomocą niskonapięciowego skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F po izolacji monocytów z krwi poprzez wirowanie, a następnie przeskalowaniu oczyszczonych monocytów do stężenia 1×10⁶ komórek/mL w pożywce DMEM uzupełnionej o następujące dodatki. Następnie wysiewamy 2×10⁶ komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 i inkubujemy przez siedem dni, aby umożliwić różnicowanie monocytów w makrofagi w celu analizy poboru i zbierania komórek. Mieszamy nano art z pożywką hodowlaną do stężenia końcowego 100 µM i dodajemy 1 mL medium terapeutycznego do każdego dołka w wybranym punkcie czasowym lub gdy komórki zostaną całkowicie nasycone nano art.Usunąć całe medium hodowlane i przemyć komórki trzykrotnie 1 mL PBS, aby usunąć wszystkie cząsteczki, które nie zostały pobrane przez komórki. Usunąć komórki przylegające z dna dołka za pomocą scrapra do komórek (cell lifter) i przenieść je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. Następnie odwirować komórki przy 1000 RCF w temperaturze 4 °C przez 10 minut.Odrzuć nadsącz i dodaj 200 µL 100% metanolu, aby zlizować komórki i rozpuścić nano art, krótko sonikując osad za pomocą sondy sonikacyjnej przy amplitudzie 20% przez dwie do pięciu sekund. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu analizy zawartości leku. Retencję wewnątrzkomórkową nano art można również zwizualizować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej po przygotowaniu skrawków za pomocą mikrotomu, jak pokazano tutaj.Szczegóły dotyczące analizy uwalniania nano arch i traktowania komórek należy znaleźć w tekście towarzyszącym do niniejszego artykułu, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą analizy pobierania i zbierania komórek. Jednak zamiast zbierać komórki po przemyciu, należy zastąpić PBS dwiema mililitrami pożywki do hodowli komórkowej bez MCSF i bez nano art w wyznaczone dni lub w momencie, gdy pożywka zmieni kolor na żółty; w wybranym dniu należy wymienić połowę pożywki. Należy pobrać jeden mililitr pożywki komórkowej wraz z powtórzonymi próbkami komórek i poddać je analizie leku.Aby zwizualizować w czasie rzeczywistym pobieranie nanocząsteczek za pomocą mikroskopii bifokalnej nano art, najpierw należy przygotować barwnik DRE, taki jak vibrant, i dodać go do medium. Zgodnie z instrukcjami producenta, należy dodać medium zawierające barwnik do dojrzałych makrofagów pochodzenia monocytarnego, a następnie trzykrotnie wypłukać komórki, używając 1 mL medium hodowlanego, aby usunąć nadmiar barwnika. Następnie należy wymieszać nano art z medium hodowlanym, używając nano art znakowanego fluorescencyjnie, i dodać medium do traktowania z oznakowanym nano art. Bezpośrednio przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy rejestrować obrazy co 30 sekund przez cztery godziny, używając obiektywu 60x.Na koniec można przeprowadzić testy infekcji i zakaźności HIV-1. Najpierw należy potraktować komórki zgodnie z opisem dla wizualizacji uwalniania art. Następnie, w wybranych dniach, należy usunąć całe medium i zastąpić je medium bez MCSF, zawierającym HIV-1 AA z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 0,01 cząsteczek wirusa na komórkę, i inkubować przez 24 godziny.Następnie usunąć medium wirusowe i zastąpić je świeżym wirusem, a następnie hodować komórki w medium wolnym od wirusa przez 10 dni, wymieniając połowę medium co drugi dzień lub w razie potrzeby, aby utrzymać żywotność komórek przez 10 dni po infekcji. Pobrać 10 µL medium z każdej studzienki i przenieść do płytki 96-dołkowej, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy odwrotnej transkrypcji. Można również przeprowadzić późniejsze oznaczenia białka p24 wirusa HIV-1.Tutaj możemy wyraźnie zobaczyć morfologię komórek eksponowanych na wirusa przy mnożniku infekcji 0,01 w 1. dniu po zastosowaniu nano art. W tych makrofagach pochodzenia monocytarnego nie ma oznak infekcji wirusowej, a nanocząstki są wyraźnie widoczne w cytoplazmie komórek. W tym przypadku komórki zostały eksponowane na wirusa 10 dni po zastosowaniu nano art.Niektóre z tych komórek zostały zainfekowane, co wskazywało barwienie P 24 oraz tworzenie się wielojądrowych komórek olbrzymich, jednak w porównaniu z komórkami nieleczonymi nadal odnotowano znaczną ochronę. Należy zauważyć, że nanocząsteczki są nadal widoczne w cytoplazmie komórek w B, lecz w mniejszym stopniu niż w a; struktury te nie występują w komórkach, które nie zostały poddane działaniu nano art. Na tych konfokalnych filmach z żywych komórek widzimy makrofagi oznakowane na zielono i nano art oznakowane na czerwono.Tutaj widzimy, że komórki kumulują bardzo mało nanocząsteczek. W tym przypadku cząsteczki są szybko gromadzone, co wskazuje zwiększona czerwona fluorescencja. Różnice te są zgodne z wynikami uzyskanymi podczas analizy poboru leku. Korzystając z HPLC, możemy dodatkowo zaobserwować, że komórki aktywnie pobierają cząsteczki.Różnica w tempie akumulacji nano art w komórkach odzwierciedla wpływ charakterystyki fizycznej, takiej jak rozmiar, kształt i ładunek, na zdolność makrofagów do wychwytu i zatrzymania nano art. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wytwarzania nano art przy użyciu technik homogenizacji przez mielenie na mokro oraz sonikacji. Są to skuteczne metody produkcji nanocząsteczek antyretrowirusowych.Mielenie na mokro i homogenizacja służą do frakcjonowania większych cząsteczek kryształów leku na mniejsze nanocząsteczki w surfaktantach lipidowych, natomiast technika sonikacji pozwala na wytworzenie pojedynczych kropel leku o rozmiarach nano w polimerze. W niniejszym materiale zaprezentowaliśmy również sposób wykorzystania makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów jako platformy testowej do oceny transportu nanocząsteczek. Nasza metoda testowania umożliwia bardzo proste badanie zdolności cząsteczek do bycia pochłanianymi, zatrzymywanymi i uwalnianymi przez komórki, a także ich zdolności do hamowania replikacji wirusów.Pozwala to badaczowi zidentyfikować nanostruktury artystyczne, które mogą mieć największą szansę na powodzenie in vivo, a ostatecznie na zastosowanie u zainfekowanych ludzi. Pełne wyniki tych eksperymentów zostały opublikowane w naszym artykule Online Nano. Artykuł zatytułowany Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics ukazał się w czasopiśmie Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.Bardzo dziękuję.

methods-development-for-blood-borne-macrophage-carriage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowanie metod przenoszenia leków antyretrowirusowych w nanoformach przez makrofagi we krwi

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Przewidywanie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 jest niezbędne do podania nowej klasy leków antyretrowirusowych, mianowicie antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env i późniejszą interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego (geno2pheno[coreceptor]).

Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego

Ten film demonstruje test oceniający skuteczność doustnej terapii antyretrowirusowej (oral cART) w humanizowanym modelu myszy zakażonym ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 (HIV-1). Kombinacja leków ukierunkowanych na HIV-1, w tym nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy i inhibitory transferu nici integrazy, jest podawana wraz z suplementem diety i antybiotykami. Po spożyciu tej mieszaniny przez humanizowane myszy zakażone wirusem HIV-1, skuteczne tłumienie replikacji wirusa ocenia...

Doustna skojarzona terapia przeciwretrowirusowa w leczeniu zakażenia HIV-1 w humanizowanym modelu myszy

Opisujemy metodę pomiaru prędkości fagosomów przemieszczających się w kierunku centrum komórki w żywych komórkach zakażonych lub bez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) typu 1, używając konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem do identyfikacji fluorescencyjnych zakażonych komórek i mikroskopii jasnego pola do wykrywania fagosomów.

Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

Ten protokół opisuje nowatorską metodę dostarczania doustnych leków antyretrowirusowych, które skutecznie hamują replikację RNA HIV-1 u humanizowanych myszy.

Doustne skojarzone leczenie przeciwretrowirusowe u humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV-1

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

W tym badaniu wykorzystano strategie in-silico, aby zidentyfikować enumerowaną etrawirynę jako obiecujący środek terapeutyczny dla HIV. Nasze odkrycia dotyczące interakcji molekularnych i dynamiki wspierają racjonalne projektowanie nowych NNRTI jako możliwych alternatyw leczenia HIV.

Ilościowa zależność struktura-aktywność, przewidywanie aktywności i dynamika molekularna nienukleotydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy

Poznaj metody produkcji nanoformułowanych leków antyretrowirusowych i ich pobierania przez makrofagi. Techniki mielenia mokrego, homogenizacji oraz sonifikacji umożliwiają ocenę właściwości fizycznych cząsteczek i ich skuteczności przeciwwirusowej in vitro.

Opracowanie metod badania transportu nanoformułowanych leków antyretrowirusowych przez makrofagi w krwiobiegu

Przeglądaj więcej filmów