Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe aktywności celulazy biogórniczej z bibliotek metagenomicznych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja klonów wykazujących ekspresję celulazy z biblioteki metagenomicznej. Osiąga się to poprzez replikację wcześniej utworzonej biblioteki metagenomicznej za pomocą robota, a następnie inkubację replikowanej biblioteki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Mierzy się wzrost klonów E. coli, następnie dodaje się lizę, bufor i substrat do replikowanej biblioteki.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują aktywność celulazy poprzez pomiary absorbancji kolormetrycznej za pomocą czytnika płytek. Cześć, jestem Keith i pracuję w laboratorium Stevena Hallama na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę wysokoprzepustowych funkcjonalnych badań przesiewowych bibliotek metagenomicznych.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania aktywności biominy celulazy z bibliotek metagenomicznych. Więc zacznijmy. Przed rozpoczęciem tego protokołu należy przygotować bibliotekę metagenomiczną przechowywaną w formacie płytki 384-dołkowej.

W badaniu tym wykorzystano wektor SMID PCC one copy control w połączeniu z komórkami Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli jako hosta biblioteki, aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij płytki zawierające bibliotekę z minus 80 stopni Celsjusza i rozmrażaj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 20 minut. W międzyczasie użyj funkcji sterylizacji światłem UV w QIX two, aby sterylizować robota przez 15 minut. Ustaw Q fill three zgodnie z instrukcjami producenta z butelką z mediami podłączoną do kolektora za pomocą programu sterylnych przewodów.

Q napełnij trzy dla odpowiedniej ilości pożywki i ustaw go na wypełnienie objętości 45 mikrolitrów. W każdym z nich dobrze usuń powietrze z rurki i kolektora za pomocą funkcji przedmuchiwania robota, aż media będą widoczne. Na każdym sworzniu kolektora napełnij żądaną liczbę płytek mediami LB za pomocą Q fill three.

Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund. Następnie załaduj płyty biblioteczne i świeże talerze do odpowiednich obszarów picków Q. Aby zrobotyzować, napełnij kąpiele czyszczące odpowiednimi odczynnikami.

2% mikro 90 w tylnej kąpieli, woda destylowana w autoklawie w środkowej kąpieli i 80% etanol w przedniej kąpieli. Korzystając z programu replikującego qix two, wybierz odpowiednią głowicę, a także liczbę i typy płyt źródłowych i docelowych. Skonfiguruj również głowicę do czyszczenia między replikacjami.

Zwykle wystarczy sześć cykli w każdej kąpieli. Wydajność maszyny to jednorazowo 10 talerzy. Ustaw maszynę tak, aby działała.

Replikacja zajmie około 15 minut. Pełna pojemność z głowicą 384 pin. Po zreplikowaniu płytek hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w pojemniku nawilżającym.

Długi czas inkubacji jest konieczny, ponieważ z dodatkiem arabinozy indukowana jest duża liczba kopii smidu. W międzyczasie wyczyść robota Q fill three zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Po inkubacji wyjąć płytki z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odłóż pokrywy na bok i umieść talerze na platformie załadowczej magazynu wyposażonej w szybki stos. Pamiętaj, aby śledzić kolejność płyt, ponieważ oprogramowanie tego nie robi. Tabliczki na dole stosu zostaną odczytane.

Najpierw wyjmij jeden magazynek z szybkiego stosu. Upewnij się, że jest pusty i wepchnij go na stos płytek do odczytania. Chwyć magazynek za uchwyt, a płytka powinna załadować się do magazynka.

Załaduj magazynek do szybkiego stosu we właściwej orientacji. Otwórz skanuj jego program na podłączonym komputerze. Wybierz nową sesję i nazwij ją odpowiednio.

Wybierz wywołanie płaskiego dna 384 Well plate jako płyty. Wpisz tekst w obszarze układu płyty. Wybierz przycisk kreatora i wybierz go, aby dodać 384 niewiadome do tabliczki.

W obszarze protokołu wybierz opcję pętli studni i wprowadź dla 384 studni. Ikona pętli studni pojawi się w drzewie przepływu po lewej stronie ekranu. Wybierz ikonę i kliknij, aby dodać pomiar fotometryczny.

Ustaw go na odczyt przy 600 nanometrach. Zapisz protokół z unikalną nazwą i zamknij skanowanie jego ponownego programu. Następnie otwórz program polara RS.

Na stronie głównej znajduje się tabela z listą instrumentów podłączonych do urządzenia szybkiego stosu pod nagłówkiem skanowania VARI, kliknij opcję uruchom sesję. Następnie powinno pojawić się okno testu ze schematem blokowym pośrodku. Wybierz element uruchamiania sesji, a następnie znajdź nazwę zapisanego skanowania.

Jest ponownie uruchamiany w menu rozwijanym, które pojawia się po prawej stronie ekranu. Po wybraniu protokołu kliknij przycisk Uruchom. W tym teście pojawi się okno z pytaniem, którego magazynka użyć jako źródła i który magazynek jest pusty.

Dolna ramka na ekranie odpowiada przedniej części magazynka. Upewnij się, że zarówno szybki stos, jak i skanowanie Vario są włączone, a następnie kliknij przycisk start. Szybki stos automatycznie załaduje płytki do czytnika płytek, co pozwoli na ciągłe pomiary płytek.

Obserwuj załadowanie pierwszej płytki do skanera Vario, aby zapewnić prawidłowe ustawienie maszyn do odczytu. 25 płyt zajmuje około 50 minut. Po zakończeniu skanowania Barrios wyjmij pełny magazynek i umieść go na platformie ładowania magazynka.

Podnieś zewnętrzny prostokąt platformy, a magazynek powinien się zsunąć, pozostawiając talerze stojące w stosie pośrodku. Na koniec załóż pokrywki na płytkach, aby uzyskać ekran oparty na roztworze. Aby uzyskać aktywność celulozy, najpierw przygotuj mieszaninę testową, używając wstępnie przygotowanego 10-krotnego zapasu lizy.

Zmieszać z 50-milimolowym buforem octanu potasu o pH 5,5, jak opisano w pisemnym protokole. Następnie przygotuj zapas do 75 miligramów na mililitr, chromogenny substrat biobójczy DIFENYL lub DNP w DMSO, upewniając się, że substrat jest całkowicie rozpuszczony. Dodać roztwór podstawowy biocydu z komórek DNP do mieszanki testowej do końcowego stężenia 0,1 miligrama na mililitr.

Należy pamiętać, że każda płytka zużywa około 20 mililitrów roztworu i konieczne jest dodatkowe 50 mililitrów, aby umożliwić uzyskanie martwej objętości. Ustaw Q fill three, tak jak poprzednio, w mieszance testowej do każdej płytki, używając Q fill three. Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund.

Po dodaniu mieszanki testowej inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. W pojemniku na wilgoć wyjmij płytki z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odłóż pokrywy na bok i umieść talerze na platformie załadowczej magazynu wyposażonej w szybki stos w taki sam sposób, jak poprzednio.

Otwórz program skanowania i ustaw go tak, jak poprzednio, z wyjątkiem pomiaru fotometrycznego, który powinien być ustawiony na odczyt na 400 nanometrów. Następnie wprowadź parametry do programu POLARA RS. Jak wykazano wcześniej.

Poczekaj, aż skaner Vario odczyta płyty. Po zakończeniu pracy wyjmij i wyrzuć płytki. Aby wyeksportować odczyty absorbancji w sposób otwarty, zeskanuj je ponownie oprogramowanie i wybierz.

Otwórz istniejący plik. Wybierz katalog, w którym sesja została zapisana, i kliknij ikonę plusa, aby rozwinąć listę. Pod nagłówkiem tytułu będą znajdować się opcje oznaczone jako kontener pierwszy do kontenera N. W zależności od liczby tablic wybierz pierwszą płytę do analizy na pasku menu u góry strony, wybierz eksport raportu danych.

Wybierz opcje eksportu, takie jak układ płyty i dane fotometryczne. Kliknij wyświetl raport, a następnie zapisz plik. Wybierz żądany katalog.

Formatem wyjściowym jest arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel. Tutaj odczyty absorbancji z pojedynczego 384. Studzienka zawierająca dodatni klon, jak pokazano, dodatnie klony wykazują wyraźny wzrost absorbancji w porównaniu z klonami niewyrażającymi aktywności celulazy.

Różnice w czasie testu, no cóż, lokalizacja na płytce lub stężenie DNP mogą wpływać na odczyty absorpcji bezwzględnej. Odczyty absorbancji względnej, takie jak różnica absorbancji powyżej średniej płytowej lub średniej kolumnowej, są bardziej niezawodną metodą identyfikacji klonów dodatnich pod względem celulazy. Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować klony z dodatnim wynikiem celulazy w bibliotece metagenomicznej.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o rozpuszczeniu strony biologicznej komórek DNP w DMSO i inkubacji płytek w komorze wilgotnościowej. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.