Ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest modelowanie ostrego zawału mięśnia sercowego u szczurów w celu badania mechanizmów sygnalizacji sercowej związanych z natychmiastową odpowiedzią mięśnia sercowego na niedokrwienie serca, a następnie uszkodzenie reperfuzyjne. Reakcje te obejmują wielkość zawału, obszar zagrożony oraz śmierć komórkową. Pierwszym krokiem jest odsłonięcie lewej komory poprzez wykonanie niewielkiego nacięcia w czwartej przestrzeni międzyżebrowej po lewej stronie klatki piersiowej i rozszerzenie żeber po ich odseparowaniu.

Lewą tętnicę wieńcową przednią (LAD) podwiązuje się przejściowo na 30 minut po okresie niedokrwienia. Po czterogodzinnym okresie reperfuzji podwiązanie LAD zostaje zwolnione, umożliwiając reperfuzję serca. Przed wycięciem serca i zbadaniem wielkości obszaru zawału mięśnia sercowego w strefie zagrożenia (area at risk) oraz poza nią, LAD zostaje podwiązana po raz kolejny.

Ostatecznie wyniki oceny histologicznej zawałowianego mięśnia sercowego mogą zostać wykorzystane do badania strategii terapeutycznych w leczeniu niewydolności serca. Technika ta pozwala na uzyskanie wglądu w mechanizmy sygnalizacyjne związane z bezpośrednimi odpowiedziami na niedokrwienie, a następnie w obszarze powstałych uszkodzeń, takich jak wielkość zawału, obszar zagrożony oraz śmierć komórek.

Ten model może być wykorzystany do oceny nowych strategii terapeutycznych w leczeniu niedokrwiennej choroby serca. Procedurę zademonstruje starszy pracownik naukowy oraz X, starszy stażysta podoktorski z laboratorium dr. Bradleya McConnella w Katedrze Nauk Farmakologicznych i Farmaceutycznych na Uniwersytecie w Houston, który jest członkiem instytucjonalnym Texas Medical Center. Przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej powierzchnia operacyjna musi zostać zdezynfekowana 70% ethanol.

Przed każdym zabiegiem chirurgicznym należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze kulkowym. Wymagane narzędzia obejmują dwie nożyczki chirurgiczne, jedną pęsetę, jedną pęsetę zakrzywioną, dwa igłotrzymacze oraz rozszerzacz klatki piersiowej. Należy ustawić temperaturę systemu koca homeotermicznego tak, aby utrzymywał on temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 ± 1 °C.

Wielkość obszaru zawału zależy od czasu trwania niedrożności oraz od temperatury ciała. Należy przygotować gazę bawełnianą i aplikatory, aby móc opanować krwawienie. W badaniach tych wykorzystuje się wyłącznie zwierzęta, które przeszły badanie fizykalne obejmujące inspekcję wizualną, pomiar tętna, częstości oddechów, temperatury ciała oraz masy ciała.

Dzień przed operacją należy zapisać masę ciała oraz cechy identyfikacyjne zdrowych zwierząt, które zostaną poddane zabiegowi. Podać dawkę buprenorfiny. Przez cały czas trwania procedury należy nosić fartuchy i rękawiczki, a rękawiczki muszą być wymieniane pomiędzy poszczególnymi operacjami.

Aby rozpocząć, należy poddać szczura znieczuleniu i przygotować miejsce operacji, dokładnie goląc futro z okolic szyi i klatki piersiowej. Odkaź ogolone obszary roztworem Betadinu, a następnie 70% etanolem. Powtórz tę procedurę trzykrotnie.

Umieść zwierzę na systemie koca homeotermicznego w celu zapewnienia prawidłowego utrzymania temperatury ciała. Zwierzę powinno leżeć na prawym boku. Skośne ścięcie końcówki rurki polietylenowej ułatwia jej wprowadzenie do krtani.

Wprowadź rurkę endotrachealną przy użyciu chirurgicznego mikroskopu stereoskopowego, delikatnie manipulując językiem w razie potrzeby i utrzymując tchawicę w polu widzenia. Podłącz rurkę endotrachealną do respiratora z częstotliwością 80 oddechów na minutę i objętością oddechową 1,2 ml na 100 g masy ciała.

Po uzyskaniu wentylacji mechanicznej przykryj szczura jałową draperią, pozostawiając odsłonięty jedynie obszar operacyjny. Po ustabilizowaniu oddechu otwórz klatkę piersiową na wysokości czwartego odstępu międzyżebrowego po lewej stronie. Ogranicz zakres nacięć tkanek do minimum, aby zmniejszyć ryzyko krwawienia.

Umieść rozwieracz klatki piersiowej w czwartej przestrzeni międzyżebrowej i rozsuń żebra, aby odsłonić lewą komorę (LV), zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić płuca. Następnie otwórz osierdzie, pozostawiając je na miejscu. Jeśli to możliwe, zidentyfikuj proksymalny odcinek lewej tętnicy wieńcowej zstępującej (LAD) przy użyciu chirurgicznego stereomikroskopu.

Przejściowo podwiązać, zligować lub zawiązać węzłem poślizgowym LAD, aby wywołać niedokrwienie. Należy uważać, aby nie zewnętrzniać właściwie serca. Podwiązanie LAD potwierdza się poprzez obserwację bladości tkanki mięśnia sercowego dystalnie względem szwu, a także dysfunkcję ściany przedniej w okresie niedokrwiennym.

Po 30-minutowym okresie niedokrwienia należy rozpocząć reperfuzję serca poprzez przecięcie lub zwolnienie podwiązki wokół LAD za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych. Reperfuzję potwierdza powrót czerwonego koloru tkanki mięśnia sercowego oraz stwierdzenie częściowego powrotu ruchomości przedniej ściany, obserwowane bezpośrednio po zwolnieniu podwiązania LAD. Procedura w przypadku szczurów w grupie kontrolnej (sham) jest identyczna, z wyjątkiem tego, że nie wykonuje się przejściowego podwiązania LAD.

Usuń rozwierak klatki piersiowej i zbliż żebra, stosując szew przerywany. Po zamknięciu żeber wytwórz ujemne ciśnienie w klatce piersiowej, aby zapewnić prawidłowe oddychanie, odsysając powietrze z jamy klatki piersiowej. Na koniec zamknij skórę szwem ciągłym. Po operacji umieść szczura w klatce z podkładką grzewczą i wodą; monitoruj temperaturę ciała za pomocą termometru rektalnego, częstotliwość oddechów poprzez obserwację wizualną, tętno poprzez palpację oraz niepokojące objawy bólowe, aż zwierzę odzyska zdolność poruszania się.

Należy podać jałową sól fizjologiczną. W przypadku zaobserwowania oznak odwodnienia, bezpośrednio po zabiegu należy podać buprenorfinę. Po czterogodzinnym okresie reperfuzji ponownie znieczulonego szczura należy umieścić w polu operacyjnym.

Zwizualizuj lewą komorę zgodnie z wcześniejszą instrukcją i przeprowadź drugie podwiązanie LADA lub ponownie zawiąż węzeł poślizgowy. Wstrzyknij jeden mililitr 5% Evans blue w soli fizjologicznej do prawej komory i pozwól na perfuzję przez dwie minuty. Po tym czasie wstrzyknij jeden mililitr nasyconego roztworu chlorku potasu do prawej komory, aby zatrzymać bicie serca, następnie szybko wypreparuj serce i zanurz je w ogrzanym 2% roztworze soli fosforanowej (agro phosphate buffered saline).

Po zestaleniu się agaru w temperaturze pokojowej, należy pokroić serce na sekcje o grubości od jednego do dwóch milimetrów. Żywe mięsień sercowy należy barwić 2% chlorkiem 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) przez 20 minut, a następnie wykonać zdjęcie każdego otrzymanego przekroju. Poniżej przedstawiono reprezentatywny obraz serca szczura.

Po czterech godzinach reperfuzji obszar zaznaczony na niebiesko reprezentuje nieokluzowany obszar perfuzji, który nie był zagrożony. Obszary czerwone wskazują obszar zagrożony zawałem, a obszary biało-żółte oznaczają zawał mięśnia sercowego w obrębie obszaru zagrożonego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak wywołać ostry zawał mięśnia sercowego u szczurów oraz jak wykorzystać model zwierzęcy do symulacji ludzkiej niedokrwiennej choroby serca.

Ten model może być wykorzystany do badania bezpośrednich reakcji na niedokrwienie, a następnie następującego po nim uszkodzenia reperfuzyjnego w ciągu pierwszych kilku godzin, takich jak wielkość zawału, obszar zagrożony i śmierć komórek. Tak jak zobaczysz w tym filmie, życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.