Name: Bezpośrednie dostarczanie MIF morpholinos do otocysty danio pręgowanego za pomocą iniekcji i elektroporacji wpływa na rozwój ucha wewnętrznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę dostarczania morpholinos do otocysty danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji i elektroporacji. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie rozwoju ucha wewnętrznego z minimalnym wpływem na mózg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów przyznanych przez Deafness Research Foundation dla Y-c S oraz przez NSF (IOS 0930096) dla KFB. KFB: NIH/NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a>, NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096

1. Przygotowanie elektrod do elektroporacji
<ol>
<li>Odetnij kawałek drutu wolframowego o średnicy 75 μm (A-M Systems, Inc. Carlsborg, WA) o odpowiedniej długości (około 3-5 cm)</li>
<li>Wprowadź drut wolframowy do złącza kabla Molex (stemplowany mosiężny pin)</li>
<li>Owiń druty wolframowe i złącze kabla Molex rurką termokurczliwą (SPC Technology, Chicago, IL), a następnie podgrzej palnikiem Bunsena lub opalarką, aby uszczelnić rurkę na drucie</li>
<li>Aby zaostrzyć końcówkę drutu wolframowego, zanurz go w 1,0 N wodorotlenku sodu (Conrad et al. 1993) i, używając spinacza do papieru jako drugiej elektrody, przeprowadź elektrolizę drutu za pomocą elektroporatora falowego. Stosowane warunki to 5 impulsów o napięciu 50 V, z których każdy trwa 100 ms, z odstępami 50 ms między impulsami. Elektrody powinny zostać zaostrzone do średnicy 15-20 μm</li>
<li>Przed użyciem w procesie elektroporacji przechowuj druty w tacy w rowkach odciśniętych w glinie modelarskiej</li>
</ol>
2. Przygotowanie stanowiska do elektroporacji
<ol>
<li>Przymocuj taśmą zaostrzone elektrody wolframowe o średnicy 75μm do mikromanipulatorów (World Precision instruments).</li>
<li>Umieść mikromanipulatory po obu stronach stolika mikroskopu sekcyjnego (Leica).</li>
<li>Podłącz elektrody do elektroporatora kwadratowej fali Protect CUY-21 Edit (Rycina 1).</li>
<li>Włącz elektroporator i ustaw parametry elektroporacji, w tym napięcie, czas trwania impulsu oraz liczbę impulsów. Ustalono, że najskuteczniejszymi parametrami dla tego eksperymentu były trzy impulsy o napięciu 13 V, z których każdy trwał 5,0ms, z odstępami 100ms pomiędzy impulsami. Jeśli w wyniku elektroporacji w embrionie powstają pęcherzyki powietrza, należy skrócić czas trwania impulsu.</li>
</ol>
3. Mikrowstrzykiwanie morfolino do pęcherzyka słuchowego rybki zebrafish
<ol>
<li>Zbierz zarodki danio pręgowanego z zbiornika hodowlanego. Inkubuj zarodki w medium do hodowli zarodków z dodatkiem 0,3 PPM błękitu metylenowego (Westerfield, 2005) w temperaturze 28,5°C przez noc.</li>
<li>Wytwórz szklane igły za pomocą wyciągacza elektrod Sutter P-97</li>
<li>Podgrzej podkład z żelu agarozy (1% agaroza w wodzie dla ryb w 10 mm szalce Petriego) do 37°C w kąpieli wodnej</li>
<li>Podgrzej 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMPA) w wodzie dla ryb aż do stopienia, a następnie utrzymuj ją w ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
<li>Napełnij szklaną igłę roztworem morfolino (GeneTools, Corvallis, OR) i przytnij końcówkę do odpowiedniej średnicy. Zamocuj igłę do wtryskiwania w mikromanipulatorze (Kuhn).</li>
<li>Przytnij końcówkę igły do około 10 μm i wstrzyknij do oleju mineralnego, aby upewnić się, że końcówka umożliwia dostarczenie odpowiedniej ilości roztworu morfolino.</li>
<li>Usuń otoczki z zarodków w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf) i znieczul je za pomocą MS222 (trykaina, Sigma) w wodzie dla ryb z 0,3 PPM błękitu metylenowego.</li>
<li>Ułóż 3 do 5 znieczulonych zarodków na podkładzie z żelu agarozy prawą stroną do góry w celu zapewnienia wygodnej i jednolitej analizy</li>
<li>Nanieś 1 do 2 kropli 1% LMPA na każdy zarodek i poczekaj do zastygnięcia, aby utrwalić zarodek w miejscu</li>
<li>Obróć szalkę Petriego tak, aby pęcherzyk słuchowy znajdował się po prawej stronie</li>
<li>Wprowadź igłę do światła pęcherzyka słuchowego i wstrzyknij roztwór morfolino za pomocą pneumatycznej mikropompki PV820 Pneumatic PicoPump (World Precision Instruments) z podłączonym zbiornikiem azotu (Rycina 2)</li>
</ol>
4. Procedura elektroporacji
<ol>
<li>Przenieś zamontowane embriony do stacji elektroporacji natychmiast po wstrzyknięciu</li>
<li>Umieść elektrodę dodatnią na tkance bezpośrednio za pęcherzykiem słuchowym, ale nie przebijaj jej; wprowadź elektrodę ujemną do mózgu bezpośrednio przed pęcherzykiem słuchowym</li>
<li>Przyłoż prąd za pomocą pedału nożnego lub naciskając przełącznik.</li>
<li>Wlej wodę dla ryb na agarozę i usuń embriony z agarozy, delikatnie zamieszałszy i używając szklanej pipety. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić embrionów. W przypadku embrionów trudnych do usunięcia, użyj igły, aby delikatnie odłupać LMPA otaczający embrion.</li>
<li>Umieść embriony w płytce z wodą dla ryb z błękitem metylenowym i hoduj je do etapów wymaganych do analizy (analizy morfologicznej, immunohistochemicznej, hybrydyzacji in situ itp. oraz analizy mikroskopowej).</li>
</ol>

5. Reprezentatywne wyniki: 

<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Konfiguracja mikroskopu sekcyjnego do analizy komórkowej, obejmująca szalkę Petriego z próbką i soczewki optyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Stanowisko do elektroporacji. Elektrody wykonano z zaostrzonych drutów wolframowych o średnicy 75μm i połączono przewodami z elektroporatorem Protect CUY-21 Edit Square Wave. Elektrody te zostały przymocowane taśmą do mikromanipulatorów.
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Układ mikroskopowy do eksperymentu elektrofizjologicznego, rozmieszczenie elektrod do rejestracji aktywności neuronalnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Stanowisko do iniekcji. Wszystkie embriony otrzymywały iniekcje do prawego ucha w celu standaryzacji.
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej porównujące efekty iniekcji morpholino i elektroporacji u danio pręgowanego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Barwienie filamentów aktynowych falloidyną w embrionach w 3 dpf. (A) Embrion w 3 dpf po iniekcji kontrolnego MO wykazuje silne barwienie falloidyną w tylnej plamce (pm). (B) Embrion, który został poddany iniekcji kontrolnego MO, a następnie elektroporacji, wykazywał poziom barwienia falloidyną w pm podobny do embrionów poddanych tylko iniekcji. (C) Sama iniekcja mif MO do pęcherzyka słuchowego nie spowodowała zmniejszenia barwienia falloidyną, podczas gdy iniekcja mif MO wraz z elektroporacją spowodowała drastyczne zmniejszenie barwienia falloidyną w pm (D). am, przednia plamka.
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej, zebrafish w 5 dpf, regiony pm/am, warunki kontrolne/elektroporacji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Barwienie filamentów aktynowych falloidyną u larw w 5 dpf. Nie stwierdzono różnic między samą injekcją (A) a injekcją z elektroporacją przy zastosowaniu standardowego kontrolnego morfolino (B). Jednakże larwy w 5 dpf, którym wstrzyknięto morfolino mif i poddano elektroporacji, wykazały osłabione barwienie falloidyną w tylnej plamce (pm) (D), choć efekt był mniej gwałtowny niż w 3 dpf, w porównaniu z embrionem, któremu wstrzyknięto jedynie morfolino mif (C). am, przednia plamka.
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Mikroskopia embrionów zebrafish; obszary pm; efekty elektroporacji; analiza obrazowania fluorescencyjnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Barwienie acetylowanej tubuliny w embrionach w 3 dpf. Embrion na zdjęciu (A) nie został poddany żadnej iniekcji ani elektroporacji. Embrion na zdjęciu (B) został poddany elektroporacji, ale nie otrzymał iniekcji. Embriony, które otrzymały zarówno iniekcję, jak i elektroporację (C, D) z morfolinami mif, wykazały widocznie zmniejszone barwienie tubuliny w porównaniu z grupą kontrolną. (pm, plamka tylna).
<img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna rybek zebrafish; porównanie obszarów pm i am przy różnych zabiegach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Barwienie acetylowanej tubuliny w embrionach w 3 dpf z kontrolnym morfolino. (A) Embrion bez żadnego zabiegu wykazał silne barwienie acetylowanej tubuliny w tylnej plamce (pm) oraz rozległą unerwienie. (B) Embrion po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino. (C) Embrion poddany wyłącznie elektroporacji. (D) Embrion kontrolny po wstrzyknięciu kontrolnego morfolino i elektroporacji wykazuje poziom acetylowanej tubuliny w tylnej plamce i stopień unerwienia zbliżony do grupy kontrolnej bez zabiegów.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

Produkcja artykułu została sfinansowana przez Gene Tools, LLC, producenta odczynników wymienionych w filmie i tekście.

Pomyślnie wprowadziliśmy oligosomowe morfolino (MO) antysensowne do ucha zarodka zebrafish w 24 hpf. Zarodki hodowane po wstrzyknięciu i elektroporacji pozostały żywotne. W przypadku zarodków, które przeżyły elektroporację, tempo ich wzrostu było prawidłowe w porównaniu z zarodkami niepoddanymi żadnej procedurze, a także z zarodkami, którym wykonano jedynie wstrzyknięcie lub jedynie elektroporację.
Obserwowaliśmy efekty działania MO przeciwko mif i mif-like po wstrzyknięciu do ucha i elektroporacji, wykorzystując znakowanie faloidyną oraz acetylowaną tubuliną. Barwienie filamentów aktynowych faloidyną w komórkach rzęsnych sensorycznych tylnej plamki wskazuje, że elektroporacja MO przeciwko mif i mif-like w stadium 24-hpf spowodowała zmiany w liczbie komórek rzęsnych i/lub stereocilii w porównaniu z embrionami, którym wstrzyknięto jedynie MO (Rysunek 3). Ten spadek liczby komórek rzęsnych jest zgodny z wynikami Shen et al. (w recenzji), wykazującymi, że MO przeciwko mif i mif-like powodują redukcję liczby komórek rzęsnych w plamce woreczka. Zmniejszenie liczby komórek rzęsnych u embrionów, którym wstrzyknięto MO i poddano elektroporacji, dowodzi, że elektroporacja może wspomagać transport MO przez błonę komórkową, zwiększając tym samym zakres efektów morfologicznych w porównaniu z embrionami, w których wstrzyknięto MO jedynie do pęcherzyka słuchowego. Zmiany w morfologii zwoju przedsionkowo-ślimakowego zaobserwowano poprzez barwienie acetylowaną tubuliną. Zakres unerwienia przez zwój przedsionkowo-ślimakowy uległ zmianie, ponieważ embriony poddane wstrzyknięciu i elektroporacji wykazały zmniejszone rozgałęzianie się neurytów (Rysunek 5). Może również występować zmniejszona kondensacja komórek zwojowych i/lub zmniejszona liczba komórek zwojowych, ponieważ barwienie acetylowaną tubuliną jest znacznie słabsze u embrionów, które zostały zarówno wstrzyknięte, jak i poddane elektroporacji. Ponieważ wykazano, że mif jest kluczowy dla rozwoju układu nerwowego (Suzuki et al., 2004), zmiany zaobserwowane po elektroporacji mogą być wynikiem zwiększonej transfekcji roztworu MO przeciwko mif i mif-like do komórek neuroblastów.
Elektroporacja oligos morfolin antysensownych bezpośrednio do rozwijającej się tkanki jest użytecznym narzędziem do kontrolowania ekspresji genu podczas rozwoju tej tkanki w zarodku, zarówno przestrzennie, jak i czasowo. Elektroporacja MO przeciwko mif oraz mif-like do tkanek ucha wewnętrznego doprowadziła do nieprawidłowej morfologii zarówno plamki tylnej, jak i zwoju statakoakustycznego. Odnotowano zmniejszenie liczby komórek rzęskowych sensorycznych w plamce tylnej u zarodków poddanych iniekcji i elektroporacji w porównaniu z zarodkami niepoddanymi żadnej procedurze lub zarodkami, u których zastosowano wyłącznie iniekcję lub wyłącznie elektroporację. Zaobserwowano również zmniejszenie stopnia unerwienia tylnej plamki sensorycznej przez zwój statakoakustyczny oraz zmniejszenie rozmiaru SAG. Elektroporacja jest cenną metodą transfekcji makrocząsteczek do konkretnych tkanek, co pozwala na obserwację pierwotnych efektów działania danego DNA, RNA lub MO w pożądanej tkance i odróżnienie ich od efektów wtórnych w innych tkankach, w tym w mózgu, grzebieniu neuralnym i mezenchymie periotycznym, wpływających na rozwój ucha wewnętrznego (Barald and Kelley, 2004).

<table><tbody><tr><td>wyciągacz elektrod Sutter P-97</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna mikropompka PV820 PicoPump</td><td>Sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manualny mikromanipulator M3301L</td><td>Sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stereomikroskop Leica S6D</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zabezpieczenie elektroporatora prostokątnych impulsów CUY-21 Edit</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny Olympus FV500</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>drut platynowy 0,01 cala</td><td>Zaopatrzenie</td><td>A-M Systems</td><td>711000</td><td></td></tr><tr><td>Rurki termokurczliwe</td><td>Materiały i odczynniki</td><td>Newark Inc</td><td>03F3172</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk krimpujący gniazdowy</td><td>Materiały i odczynniki</td><td>Digi-Key</td><td>82PECT-ND</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia włosowate</td><td>Zaopatrzenie</td><td>Stoelting Co.</td><td>50613</td><td></td></tr><tr><td>Plastyczna masa modelarska</td><td>Odczynniki i materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petri 100 mm</td><td>Materiały</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastikowe płytki 6-dołkowe</td><td>Materiały i odczynniki</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">&lt;Jeśli ten tekst jest skrótem od „ol” w kontekście chemicznym (np. końcówka w nazewnictwie alkoholi), należy go zostawić w formie oryginalnej. Jeśli jednak jest to błąd w treści źródłowej lub fragment słowa, proszę o podanie pełnego kontekstu w celu dokładnego przetłumaczenia.&gt;&lt;li&gt;MO: 0,3 mM kombinacji dla &lt;em&gt;mif&lt;/em&gt;, &lt;em&gt;podobny do MIF&lt;/em&gt; MO1, oraz &lt;em&gt;podobny do MIF&lt;/em&gt; Zastosowano MO2.&lt;br/&gt;MO przeciwko Mif jest komplementarne do kodonu startowego ryby danio przebrzuchłej &lt;em&gt;mif&lt;/em&gt; mRNA: 5&amp;rsquo;-acatcggcatgactgcgacagagat-3&amp;rsquo;Użyto dwóch mikroorganizmów do &lt;em&gt;podobny do MIF&lt;/em&gt;. &lt;em&gt;podobny do MIF&lt;/em&gt; MO1 jest komplementarny do miejsca startu translacji: 5&amp;rsquo;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3&amp;rsquo;podczas gdy &lt;em&gt;podobny do MIF&lt;/em&gt; MO2 pochodząca z sekwencji AS na granicy intronu 1/eksonu 2: 5&amp;rsquo;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3&amp;rsquo;Kontrolnym MO była sekwencja nukleotydowa typu scrambled firmy Gene Tools: 5&amp;rsquo;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3&amp;rsquo;.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;błękit metylenowy (0,3 ppm) w wodzie dla ryb&lt;/li&gt;&lt;li&gt; MS222 (trikaina, Sigma; 0,64 mM w wodzie dla ryb)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; agaroza niskotopliwa (LMPA; Roche)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; czerwień fenolowa (Sigma)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Przeciwciało przeciwko acetylowanej tubulinie (Sigma)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Alexa Fluor&amp;#174; 488 kozie przeciwciało przeciwko mysim przeciwciałom wtórnym (Molecular probes)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Texas red-falloidyna (Molecular Probes)&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie dostarczenie morfolin mif do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

W ostatnich latach elektroporacja stała się popularną techniką transfekcji in vivo DNA, RNA oraz morfolino do różnych tkanek, w tym do oka, mózgu i somytów danio-ostrobramkowego. Przewagą elektroporacji nad innymi metodami manipulacji genetycznej jest możliwość celowania w konkretne tkanki, zarówno przestrzennie, jak i czasowo, w celu wprowadzenia makrocząsteczek poprzez przyłożenie prądu elektrycznego. W niniejszym opisie przedstawiamy zastosowanie elektroporacji do transfekcji morfolino mif oraz mif-like do tkanek rozwijającego się ucha wewnętrznego danio-ostrobramkowego. W poprzednich badaniach wstrzyknięcie morfolino mif do embrionów w stadium od 1 do 8 komórek skutkowało rozległymi zmianami morfologicznymi w układzie nerwowym, oku, a także w uchu. Celując w tkanki ucha wewnętrznego w późniejszych etapach rozwoju, możemy określić pierwotne efekty MIF w rozwijającym się uchu wewnętrznym, w przeciwieństwie do efektów wtórnych, które mogą wynikać z wpływu innych tkanek. Wykorzystując barwienie faloidyną i acetylowaną tubuliną do badania morfologii neuronów, wypustek neuronalnych i komórek rzęsek związanych z tylną plamką, byliśmy w stanie ocenić skuteczność elektroporacji jako metody ukierunkowanej transfekcji w uchu wewnętrznym danio-ostrobramkowego. Do pęcherzyków słuchowych embrionów w wieku 24hpf wstrzyknięto morfolino i przeprowadzono elektroporację, a następnie porównano je z embrionami, które nie otrzymały żadnej terapii lub zostały poddane jedynie wstrzyknięciu bądź elektroporacji. Embriony, u których zastosowano wstrzykiwanie i elektroporację, wykazały spadek liczby komórek rzęsek, zmniejszoną innowację zrazu statoakustycznego (SAG) oraz mniejszą liczbę neuronów SAG w porównaniu z grupami kontrolnymi. Nasze wyniki wykazały, że bezpośrednie dostarczenie morfolino do otocyst w późniejszych etapach pozwala uniknąć niespecyficznych efektów w układzie nerwowym i grzebieniu neuralnym, które występują przy dostarczaniu morfolino w stadium 1-8 komórek. Pozwala to również na badanie efektów skierowanych bezpośrednio do ucha wewnętrznego, a nie efektów wtórnych w uchu wynikających z pierwotnego wpływu na mózg, grzebień neuralny lub mezenchymę periotyczną.

Opracowano metodę bezpośredniego dostarczania morfolino do otocysty ryby zebrafish w 24hpf. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji morfolino do światła pęcherzyka słuchowego oraz elektroporacji w celu umożliwienia penetracji, udało się ominąć wpływ morfolino na mózg i uzyskać efekty specyficzne dla ucha wewnętrznego.

Bezpośrednie dostarczenie morfolin MIF do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

W ostatnich latach elektroporacja stała się popularną techniką transfekcji in vivo DNA, RNA oraz morfolino do różnych tkanek, w tym do ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wprowadzenie antysensownych oligonukleotydów, morfolino lub innych cząsteczek zaburzających rozwój bezpośrednio do otocyst zebrafish w pierwszej dobie lub w 24. godzinie po zapłodnieniu. W tym przykładzie stosujemy morfolino przeciwko najwcześniejszemu neurotrofinie odpowiedzialnemu za rozwój zwoju słuchowego, cytokinie układu odpornościowego nazywanej czynnikiem hamującym migrację makrofagów (MIF), aby ustalić, czy morfolino przeciwko tej cząsteczce wpływa na rozwój ucha wewnętrznego lub neurogenezę. Osiąga się to poprzez najpierw wprowadzenie morfolino do światła pęcherzyka słuchowego za pomocą mikroiniekcji, a następnie przeprowadzenie elektroporacji, która ułatwia przenikanie morfolino ze światła do komórek otocyst.Następnie zarodki są hodowane w temperaturze 28.5 °C, aby zaobserwować wpływ morphino na rozwój ucha wewnętrznego i neurogenezę. W ciągu kolejnych kilku dni uzyskuje się wyniki wykazujące spadek liczby komórek rzęsek sensorycznych ucha wewnętrznego, a także zmniejszenie unerwienia przez zwoj statoakustyczny w badaniu immunohistochemicznym oraz barwieniu, w których odpowiednio znakowano acetylowaną tubulinę w kinociliach oraz aktynę w stereociliach na powierzchni komórki rzęsistej. Metodę wstrzykiwania i elektroporacji morphino w zarodku kurczaka opracowaliśmy pierwotnie wspólnie z bardzo utalentowanym studentem studiów licencjackich z naszego laboratorium.Katie Holmes z sukcesem dostosowała tę metodę do wymiarów danio pręgowanego. Obecny zespół badawczy, w skład którego wchodzą Yuchi, stażystka podoktorska, Matt Wyatt, doktorant, oraz była stażystka podoktorska w laboratorium, Deb Thompson, udoskonalił tę technikę dla danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii rozwoju i badań nad słuchem, w tym w kwestii tego, czy specyficzne efekty morfogenów na system organów, taki jak ucho, można odróżnić od uogólnionych efektów rozwojowych, które wpływają na wiele systemów organów i mają charakter wtórny w obrębie ucha, na przykład efektów wpływających na mózg, które wtórnie oddziałują na ucho.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak mikroiniekcje na etapie od jednej do czterech komórek, jest to, że metoda ta wprowadza morfos bezpośrednio do ucha na późniejszych etapach. Dzięki temu można uniknąć wtórnych efektów oddziaływania morfos na mózg, skupiając się na bezpośrednich efektach w uchu wewnętrznym. Aby wykonać elektrody, należy najpierw odciąć kawałek drutu wolframowego o średnicy 75 µm i długości od trzech do pięciu centymetrów. Następnie należy przełożyć drut wolframowy przez złącze kabla Molex.Następnie owiń druciki wolframowe i złącze kabla Molex rurką termokurczliwą, a następnie podgrzej je palnikiem Bunsena lub opalarką, aby uszczelnić rurkę na drucie. Aby zaostrzyć końcówkę drutu wolframowego, zanurz go w roztworze wodorotlenku sodu i, używając spinacza do papieru jako drugiej elektrody, przeprowadź elektrolizę drutu za pomocą generatora fal prostokątnych. Zastosowane warunki to pięć impulsów o napięciu 50 V, z których każdy trwa 100 ms, z 50 ms przerwy między impulsami.Wykonaj trzy powtórzenia z końcówką elektrody zanurzoną w roztworze wodorotlenku sodu o normalnym stężeniu. Wsuń elektrodę nieco głębiej do wodorotlenku sodu i wykonaj jeszcze jedno powtórzenie. Wsuń elektrodę jeszcze głębiej, za każdym razem przesuwając ją o w przybliżeniu tę samą odległość, i wykonaj ostatnie powtórzenie.Takie stopniowe ostrzenie pozwala uzyskać bardzo cienki czubek elektrody, co umożliwia dokładniejszą i mniej inwazyjną aplikację elektrod do rozwijającego się zarodka zebrafish. Przed użyciem do elektroporacji w celu mikroiniekcji morphino w pęcherzyki słuchowe zebrafish, należy przechowywać druty wciśnięte w plastelinę w kuwecie. W pierwszej kolejności należy przygotować zbiorniki hodowlane z plastikową przegrodą, aby wieczorem oddzielić samce od samic.Umieść cztery samce i cztery samice w zbiorniku i pozostaw go na noc w pomieszczeniu inkubacyjnym z cyklem światła i ciemności 14 do 10. Następnego ranka, po zapaleniu świateł, wyciągnij przegrodę i pozostaw ryby w spokoju na około 20 do 30 minut. Oddziel samce od samic i usuń osobników hodowlanych ze zbiornika tarłowego.Przenieś je do zbiorników zawierających świeżą wodę dla ryb. Zbierz embriony ze zbiornika hodowlanego, przelewając wodę z ikrą przez sitko. Kilkukrotnie opłucz ikrę w sitku świeżą wodą dla ikry, a następnie przelej ją do szalki Petriego.Usuń wszystkie niezapłodnione lub nieprzezroczyste jaja i inkubuj embriony przez noc w pożywce do hodowli embrionów z dodatkiem 0,3 PP m błękitu metylenowego w temperaturze 28,5 °C. Bezpośrednio przed iniekcją wyciągnij szklane igły za pomocą wyciągacza elektrod Sutter P 97. Podgrzej w kąpieli wodnej do 37 °C bazę żelu AROS składającą się z 1% agrosy w wodzie dla ryb w 10 mm szalce Petriego; podgrzej 1% agrosę o niskiej temperaturze topnienia (LMPA) w wodzie dla ryb do momentu stopienia i utrzymuj ją w ciepłe w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Napełnij szklaną igłę roztworem morpholino i odetnij końcówkę do odpowiedniej średnicy, wynoszącej około 10 do 15 mikronów. Zamocuj igłę do iniekcji na mikromanipulatorze podłączonym do pneumatycznej pompki pikolitrowej PV eight 20 z butlą azotową. Odchorionuj zarodki 24 godziny po zapłodnieniu i znieczul je tricainem w wodzie dla ryb z dodatkiem 0,3 PPM błękitu metylenowego.Następnie ułóż od trzech do pięciu znieczulonych embrionów na podstawie żelowej AROS prawą stroną do góry, aby umożliwić wygodną i jednolitą analizę, nanieś jedną lub dwie krople 1% LMPA na każdy embrion i poczekaj, aż stężeje, aby unieruchomić embrion w miejscu. Obróć szalkę Petriego tak, aby pęcherzyk słuchowy znajdował się po prawej stronie. Następnie wprowadź igłę do światła pęcherzyka słuchowego i wstrzyknij roztwór morpho za pomocą pedału sterującego.Bezpośrednio po mikroiniekcji przenieś zamontowane embriony na stanowisko do elektroporacji w celu przygotowania urządzenia. Najpierw przymocuj za pomocą taśmy zaostrzone elektrody wolframowe o średnicy 75 µm do mikromanipulatorów. Następnie umieść mikromanipulatory po obu stronach stolika mikroskopu sekcyjnego.Włącz urządzenie do elektroporacji i ustaw parametry procesu. Najskuteczniejsze parametry dla tego eksperymentu to trzy impulsy o napięciu 13 V i czasie trwania 2 ms, z odstępem 100 ms pomiędzy każdym impulsem.Wprowadź elektrody w taki sposób, aby pęcherzyk słuchowy znajdował się równomiernie pomiędzy nimi, z jedną elektrodą powierzchownie, a drugą głęboko względem pęcherzyka słuchowego. Następnie podaj prąd za pomocą pedału lub naciskając przełącznik, po czym zakończ proces elektroporacji. Wlej wodę dla ryb na agar i usuń embriony za pomocą szklanej pipety, delikatnie zakręcając płytką.W przypadku embrionów, które trudno usunąć, należy zachować ostrożność, aby ich nie uszkodzić. Użyj igły, aby delikatnie odłupać otaczającą je LMPA. Przenieś embriony do płytki z wodą dla ryb z błękitem metylenowym i hoduj je do pożądanych stadiów w celu przeprowadzenia immunohistochemii morfologicznej.W analizie hybrydyzacji in situ i analizie mikroskopowej przedstawiono reprezentatywne wyniki wstrzykiwania do ucha i elektroporacji morphino. Tylna plamka słuchowa, oznaczona jako PM, jest jednym z organów słuchu u ryb, gdy zostanie znakowana Phin red. Na tej fotografii wiązki aktyny w stereorzęskach komórek rzęsatych sensorycznych widoczne są jako czerwone kropki na tle.Plamka o kształcie łopatki, uwidoczniona za pomocą znakowania fluorescencyjnego Phalloidiną w embrionie trzech dni po zapłodnieniu wstrzykniętym wyłącznie z morphino MIF, wykazuje więcej filamentów aktynowych w stereociliach komórek rzęskowych w porównaniu z embrionami w tym samym wieku, które zostały poddane zarówno wstrzyknięciu, jak i elektroporacji. Jednakże wstrzyknięcie i elektroporacja standardowym morphino kontrolnym nie spowodowały zmniejszenia zabarwienia F w porównaniu do samego wstrzyknięcia morphino. Wyniki są podobne w tylnej części plamki, choć mniej spektakularne po pięciu dniach u larw, które zostały poddane wstrzyknięciu i elektroporacji, w porównaniu z embrionem, w który wstrzyknięto wyłącznie morphino MIF.Nie stwierdzono różnicy między samą injekcją a injekcją z elektroporacją przy zastosowaniu standardowego morpho kontrolnego. Zarodek ten, wybarwiony przeciwciałem przeciwko acetylowanej tubulinie, nie został poddany żadnej injekcji ani elektroporacji morpho MIF. Ten zarodek został poddany elektroporacji, lecz nie otrzymał injekcji.Oba embriony wykazują prawidłowe barwienie acetylowanej tubuliny. Oba te embriony zostały poddane iniekcji i elektroporacji. Wykazywały one widocznie osłabione barwienie tubuliny w porównaniu z grupą kontrolną oraz znacznie mniej wypustek neuronalnych związanych z uchem, jak i z otaczającymi go zwojami.W przypadku zastosowania kontrolnego morpho do wstrzyknięcia i elektroporacji nie zaobserwowano zmniejszenia zakresu barwienia acetylowanej tubuliny ani spadku unerwienia przez zwoj słuchowy w porównaniu z samym wstrzyknięciem morpho. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w około dwie godziny, pod warunkiem właściwego wykonania. Najtrudniejszym elementem techniki do opanowania jest elektroporacja; należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mózgu, a zastosowanie ostrych elektrod pomoże zniwelować ten problem.

direct-delivery-mif-morpholinos-into-zebrafish-otocyst-injection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednia dostawa MIF Morpholinos do Otocyst rybki zebry poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Opisujemy metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego podczas regeneracji płetwy u dorosłych ryb zebrafish. Technika ta polega na mikroiniekcji i elektroporacji antysensownych oligonukleotydów morpholino do tkanki płetwy, co pozwala na badanie roli białka w różnych etapach regeneracji płetwy, w tym podczas gojenia rany, tworzenia blastemy oraz regeneracyjnego wzrostu.

In vivo elektroporacja morfolin do regenerującej płetwy ogonowej dorosłego zebrafisha

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Protokół opisuje celowe obniżenie ekspresji genów u danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie morfoliny w ogon.

Wstrzyknięcie morfolino: metoda obniżania docelowej ekspresji genów w celu zbadania funkcji u danio pręgowanego

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Wewnątrzmaciczna iniekcja in vivo oraz elektroporacja nowokory embrionalnego szczura stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi...

Wewnątrzkomorowe wstrzykiwanie i elektroporacja in utero embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16)

Poznaj metodę dostarczania morpholinos do otocysty danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji i elektroporacji. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie rozwoju ucha wewnętrznego z minimalnym wpływem na mózg.

Bezpośrednie dostarczanie MIF morpholinos do otocysty danio pręgowanego za pomocą iniekcji i elektroporacji wpływa na rozwój ucha wewnętrznego (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednie dostarczenie morfolin MIF do otocysty rybki danio poprzez wstrzyknięcie i elektroporację wpływa na rozwój ucha wewnętrznego

Przeglądaj więcej filmów