Name: Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną przy użyciu komórek wyrażających endogenne BRCA1 typu dzikiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę testowania wariantów BRCA1 w naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną z użyciem RNAi i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie funkcji mutacji w komórkach HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Ohio State University Comprehensive Cancer Center za sfinansowanie tych badań.

1. Linia komórkowa zintegrowanym substratem rekombinacyjnym
<ol>
<li>Komórki HeLa zostały stabilnie przetransformowane plazmidem pDR-GFP (plazmid7 otrzymany od M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) i utrzymywane w obecności puromycyny w celu selekcji transformantów.</li>
<li>Komórki pasażowane są w pożywce DMEM/FBS zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM GlutaMAX, 1 mM pirogronianu sodu, penicylinę/streptomycynę (10 U/ mL/0.1 mg/ mL) oraz 1.5 ug/ mL puromycyny.</li>
</ol>
Podłoże rekombinacyjne w plazmidzie pDR-GFP oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP (Rysunek 1). Jeden allel jest nieaktywny z powodu obecności 18 bp sekwencji rozpoznawania enzymu restrykcyjnego I-SceI w jego sekwencji kodującej. Ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje powstanie pęknięcia dwuniciowego DNA (DSB). W tym DNA znajduje się drugi nieaktywny allel GFP, jednak fragment jego sekwencji odpowiadający miejscu I-SceI w pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może pełnić rolę donora sekwencji dla naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną, co prowadzi do powstania aktywnego allelu GFP, który jest łatwo wykrywalny za pomocą cytometrii przepływowej. Alternatywnie, DSB może zostać naprawione przez niehomologiczne łączenie końców, co zniszczyłoby miejsce restrykcyjne I-SceI i doprowadziło do powstania komórek GFP-ujemnych. Poziom rekombinacji homologicznej w komórce określa się poprzez obliczenie procentowej liczby komórek GFP-dodatnich.
Linia komórkowa ta, pHeLa-DR13-9, została wybrana spośród wszystkich klonów ze względu na brak sygnału GFP w tle oraz stosunkowo wysoki odsetek komórek GFP-dodatnich po transfekcji plazmidem pCBASce wykazującym ekspresję I-SceI. (Plazmid pCBASce oraz jego kontrola wektorowa, pCAGGS, zostały dostarczone przez M. Jasina z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center). 
Linia komórkowa HeLa-DR13-9 jest dostępna od autorów na żądanie.

2. Transfekcja w celu wyczerpania endogennego BRCA1 i wprowadzenia zmutowanego BRCA1.
<ol>
<li>Dzień przed pierwszą transfekcją (zazwyczaj we wtorek): Przygotuj komórki HeLa-DR13-9 w szalce 10 cm o stopniu konfluencji co najmniej 90%.</li>
<li>Przeprowadź trypsynizację w 1 mL i zatrzymaj reakcję, dodając 9 mL DMEM/FBS, a następnie dokładnie wymieszaj za pomocą pipety.</li>
<li>Do każdej studzienki płytki 24-dołkowej w 0,5 mL DME/FBS dodaj 40 μL trypsynizowanych komórek.</li>
<li>Dzień 1 transfekcji (środa): Komórki powinny osiągnąć konfluencję na poziomie ~40-50%; jeśli jest ona znacznie niższa, należy powtórzyć procedurę. Wykonaj transfekcję, mieszając: 5 pmol siRNA + 0,3 ug plazmidowego DNA wykazującego ekspresję zmutowanego BRCA1 w 12,5 μL Opti-MEM oraz 0,5 μL Lipofectamine 20 w 12,5 μL Opti-MEM. Kontynuuj transfekcję zgodnie z protokołem Lipofectamine (Invitrogen).</li>
<li>Wymień medium po 4-6 godzinach. Stosowane przez nas siRNA do wyciszenia BRCA1 opiera się na sekwencji GCUCCUCACUCUUCAGU, specyficznej dla sekwencji 3'-UTR BRCA1 od 80 780 do 80 798 (numer dostępu AY273801).</li>
<li>Dzień 2: Przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej poprzez trypsynizację.</li>
<li>Dzień 3 transfekcji: 25 pmol siRNA + 0,75 ug plazmidowego DNA wykazującego ekspresję zmutowanego BRCA1 + 0,75 ug pCBASce (lub kontrolny wektor pCAGGS) w 62,5 μL Opti-MEM oraz 2,5 μL Lipofectamine 20 w 62,5 μL Opti-MEM. Wymień medium po 4-6 godzinach.</li>
</ol>
3. Analiza transfektantów.
<ol>
<li>W 6. dniu przeprowadź trypsynizację komórek z każdej studzienki i zatrzymaj proces w 1 mL DMEM/FBS. Analizę ekspresji GFP w komórkach można przeprowadzić w 5. lub 7. dniu, jednak najlepiej sprawdza się 6. dzień.</li>
<li>Przeanalizuj 10 0 komórek na studzienkę za pomocą cytometrii przepływowej. Wykorzystano instrument Becton Dickinson FACSCalibur w zasobach współdzielonych Analytical Cytometry w Ohio State University Comprehensive Cancer Center. Pojedyncze, żywe komórki wyodrębniono za pomocą parametrów rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC). Komórki GFP-dodatnie wykryto za pomocą detektora fluorescencji GFP (FL1), a wyniki przedstawiono w formie histogramu (Rysunek 2, dół).</li>
<li>Pozostałe komórki można wysiać ponownie w celu wykonania fotografii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli jest to wymagane.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:

BRCA1 reguluje szlak naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez rekombinację homologiczną6,1. Komórki, w których doszło do naprawy poprzez rekombinację homologiczną, są łatwo wykrywalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 2, góra). Wyciszenie BRCA1 prowadzi do zmniejszenia liczby wykrytych komórek GFP-dodatnich (Rysunek 2, prawo). Wynikiem z analizatora FACSCalibur jest histogram z intensywnością GFP na pojedynczą komórkę na osi X oraz liczbą komórek na osi Y (Rysunek 2, dół). W typowym zestawie wyników z jednego eksperymentu, 15,5% komórek było GFP-dodatnich po ekspresji I-SceI i kontrolnym wyciszeniu RNAi (Rysunek 3). Dla porównania, wyciszenie BRCA1 i wprowadzenie pustego wektora zredukowało konwersję GFP do 0,7%. Ponowne wprowadzenie BRCA1 typu dzikiego lub BRCA1(I21V) w pełni przywróciło rekombinację homologiczną, co potwierdzono poprzez uzyskanie 15-16% komórek GFP-dodatnich. Wprowadzenie mutanta BRCA1(M18T) (Rysunek 3, ścieżka 5) miało efekt podobny do wprowadzenia kontrolnego wektora. Ponieważ wariant ten był ekspresowany na poziomach zbliżonych do białka endogennego9, interpretujemy to tak, że wariant BRCA1(M18T) jest niefunkcjonalny w procesie rekombinacji homologicznej.
Zazwyczaj po transfekcji plazmidu ekspresyjnego I-SceI od 10-20% komórek ulega konwersji do fenotypu GFP-dodatniego. Deplecja BRCA1 powtarzalnie zmniejsza konwersję komórek GFP-dodatnich około 8-10 krotnie. Choć rzeczywiste wartości procentowe komórek GFP-dodatnich mogą różnić się między poszczególnymi eksperymentami, stosunek komórek GFP-dodatnich po deplecji BRCA1 w stosunku do deplecji kontrolnej w obrębie jednego eksperymentu jest dość spójny. Wyniki normalizujemy, przyjmując stopień konwersji bez inhibicji jako 10%, a wyniki dla deplecji BRCA1 oraz tzw. add-backów przedstawiamy w procentach. W ten sposób możemy łączyć wyniki z wielu eksperymentów, a zmienność eksperymentalna nie jest wysoka.
Wprowadzenie mutantów BRCA1 dostarczyło dotychczas jednoznacznych wyników: każdy wariant BRCA1 albo w pełni przywracał aktywność rekombinacji homologicznej, albo nie wywierał żadnego wpływu. Istotnym aspektem przy uzyskiwaniu tych wyników jest fakt, że nasze warunki transfekcji zapewniają poziomy białka BRCA1 w przybliżeniu równoliczne z koncentracją białka endogennego w komórkach niepoddanych leczeniu. Zbyt silna nadekspresja, nawet w przypadku wadliwego mutantu BRCA1, może prowadzić do wystąpienia pewnej dodatniej aktywności rekombinacji homologicznej.
Problemem, który musieliśmy rozwiązać, była toksyczność transfekcji. Samo usunięcie BRCA1 może spowolnić wzrost komórek, dlatego należy utrzymać stałą proporcję Lipofectamine-200 i plazmidowego DNA w stosunku do liczby komórek na płytce. Nadmiar Lipofectamine lub plazmidowego DNA zredukuje liczbę komórek, co sprawi, że będzie ona niewystarczająca do uzyskania wiarygodnych wyników cytometrii przepływowej. Zachowanie odpowiedniej równowagi między odczynnikami plazmidowymi a Lipofectamine a liczbą transfekowanych komórek jest kluczowe dla utrzymania ich żywotności.

 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="Schemat rekombinacji homologicznej; enzym I-SceI; naprawa GFP; proces pęknięcia dwuniciowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Substrat do rekombinacji. Strategia opracowana przez grupę M. Jasina7,12 przedstawiono. Plazmid pDR-GFP zawiera dwa wadliwe allele GFP, z których jeden zawiera miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną I-SceI. Linia komórkowa pochodząca z komórek HeLa zawiera ten substrat DNA zintegrowany w jednym miejscu w genomie9or aktywna naprawa pęknięcia dwuniciowego DNA w miejscu I-SceI poprzez rekombinację homologiczną prowadzi do konwersji jednego allelu na GFP-dodatni.
 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="Analiza efektu RNAi; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, histogram z cytometrii przepływowej, wpływ wyciszania genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Wykrywanie komórek GFP-dodatnich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki badano zgodnie z niniejszym protokołem; komórki kontrolne (bez wyciszenia genów) wykazywały aktywność w procesie rekombinacji homologicznej, co potwierdzono wysokim odsetkiem komórek wykazujących ekspresję GFP (lewa strona). Wyciszenie BRCA1 za pomocą RNAi prowadzi do gwałtownego spadku liczby komórek GFP-dodatnich (prawa strona).
 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy procentowej zawartości komórek GFP-dodatnich; warianty plazmidu BRCA1, wpływ RNAi; eksperyment genetyczny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Wyniki testu add-back dla mutantów missense białka BRCA1. Na tym histogramie przedstawiono wyniki pojedynczego eksperymentu. W przypadku braku transfekcji plazmidem wykazującym ekspresję I-SceI (ścieżka 1) nie wykryto komórek GFP-dodatnich. Wyniki w ścieżkach 2–6 uzyskano z komórek, w których plazmid wykazujący ekspresję I-SceI został przetransfekowany w 3. dniu. W komórkach z wyczerpaniem nieistotnego genu (lucyferazy) i add-backiem wektora 15,5% komórek było GFP-dodatnich (ścieżka 2). Wyczerpanie BRCA1 i add-back wektora ujawnia wpływ utraty BRCA1 na rekombinację homologiczną (ścieżka 3). Przedstawiono efekty wyczerpania BRCA1 i add-backu BRCA1 typu dzikiego (ścieżka 4), BRCA1(M18T) (ścieżka 5) oraz BRCA1(I21V) (ścieżka 6). Wyniki te pochodzą z jednego eksperymentu i zostałyby połączone z co najmniej dwoma kolejnymi powtórzeniami eksperymentalnymi w celu uzyskania pomiaru rekombinacji homologicznej wspieranej przez dane białko mutant BRCA1.

<ol><li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epidemiology+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li>
<li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li>
<li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1%3A+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li>
<li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li>
<li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li>
<li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li>
<li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li>
<li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genetic+assessment+of+1%2C433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li>
<li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li>
<li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li>
<li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li>
<li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zaletą tej metody jest możliwość badania funkcji białka BRCA1 w regulacji naprawy DNA poprzez rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego. W celu opracowania nowej metody testowania funkcji wariantów BRCA1 w naprawie DNA, zaadaptowaliśmy dwie oddzielne, uznane metody badania procesu rekombinacji homologicznej oraz wykorzystania deplecji za pośrednictwem RNAi. Kluczem do sukcesu tej metody było stworzenie łatwo transfektowalnej linii komórkowej, takiej jak HeLa, z substratem rekombinacyjnym w genomie, co pozwoliło na uzyskanie bardzo wysokiego poziomu konwersji GFP. Przeskanowaliśmy wiele klonów z pierwotnej transformacji, aby uzyskać taki, który nie wykazywał wykrywalnego sygnału tła GFP, lecz po transfekcji plazmidem ekspresyjnym I-SceI wykazywał bardzo wysoki poziom konwersji GFP.
Za pomocą tej metody badamy obecnie inne specyficzne reszty aminokwasowe BRCA1 pod kątem ich funkcji w rekombinacji homologicznej. Wraz z biologicznymi spostrzeżeniami wynikającymi z niniejszej pracy, wnioski te mogą zostać zastosowane w klinicznej genetyce nowotworów. Wysoki odsetek mutacji typu missense w genie BRCA1 ma nieznane znaczenie kliniczne, ponieważ istnieje wiele rzadkich wariantów i brakuje wystarczających informacji dla wielu z nich, aby określić związek z nowotworem na podstawie analizy segregacji genetycznej3,10,13,14. Wykorzystując tę metodę, można określić wpływ konkretnego wariantu na biologiczną funkcję BRCA1 w regulacji rekombinacji homologicznej, co mogłoby posłużyć do informowania kobiet posiadających jeden z tych wariantów w swoim genomie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja wpływu mutacji brca1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję brca1 typu dzikiego

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

Analiza funkcjonalna mutacji typu missense może być utrudniona przez obecność białka endogennego w komórce. Analizy strukturalno-funkcjonalne BRCA1 były komplikowane przez brak wiarygodnego testu dla pełnowymiarowego białka BRCA1 oraz trudności związane z pracą z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję hypomorficznego białka BRCA11,2,3,4,5. Opracowaliśmy system, w którym endogenne białko BRCA1 w komórce było gwałtownie usuwane za pomocą RNAi celującego w 3'-UTR mRNA BRCA1 i zastępowane poprzez kotransfekcję plazmidu wykazującego ekspresję wariantu BRCA1. Jedną z zalet tej procedury jest to, że gwałtowne wyciszenie BRCA1 i jednoczesne zastąpienie pozwalają komórkom rosnąć bez wtórnych mutacji lub adaptacji, które mogłyby pojawić się z czasem w celu skompensowania utraty funkcji BRCA1. Ta procedura usuwania i przywracania (depletion and add-back) została przeprowadzona w linii komórkowej pochodzącej z komórek HeLa, która była łatwo testowana pod kątem aktywności rekombinacji homologicznej. Test rekombinacji homologicznej opiera się na wcześniej opublikowanej metodzie, w której substrat rekombinacyjny jest zintegrowany z genomem (Rysunek 1)6,7,8,9. Ten substrat rekombinacyjny posiada miejsce rozpoznawane przez rzadko tnący enzym restrykcyjny I-SceI wewnątrz nieaktywnego allelu GFP, a poniżej znajduje się drugi nieaktywny allel GFP. Transfekcja plazmidu wykazującego ekspresję I-SceI prowadzi do pęknięcia obu nici DNA, które może zostać naprawione poprzez rekombinację homologiczną; jeżeli rekombinacja homologiczna naprawi to pęknięcie, powstaje aktywny allel GFP, który jest łatwo oceniany za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji białka GFP. Usunięcie endogennego BRCA1 spowodowało 8-10-krotny spadek aktywności rekombinacji homologicznej, a przywrócenie plazmidu typu dzikiego w pełni odtworzyło funkcję rekombinacji homologicznej. Gdy specyficzne mutanty punktowe pełnowymiarowego BRCA1 były wyrażane z kotransfekowanych plazmidów, można było ocenić efekt konkretnego mutantu missense. Przykładowo, ekspresja białka BRCA1(M18T), wariantu o nieznanym znaczeniu klinicznym10, w tych komórkach nie przywróciła zależnej od BRCA1 rekombombinacji homologicznej. W przeciwieństwie do tego, ekspresja innego wariantu, również o nieznanym znaczeniu, BRCA1(I21V), w pełni przywróciła funkcję zależnej od BRCA1 rekombinacji homologicznej. Tę strategię testowania funkcji mutacji missense BRCA1 zastosowano w innym systemie biologicznym badającym funkcję centrosomów (Kais i wsp., niepublikowane obserwacje). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to jest odpowiednie do analizy mutantów missense w każdym genie, który musi być analizowany recesywnie.

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Analiza funkcjonalna mutacji typu missense może być utrudniona przez obecność w komórce białka endogennego. Analizy strukturalno-funkcjonalne ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przetestowanie specyficznych wariantów białka BRCA1 z wykorzystaniem in vitro testu rekombinacji homologicznej. Osiąga się to poprzez zastąpienie endogennego białka BRCA1 typu dzikiego testowanym wariantem za pomocą transfekcji zarówno krótkiego interferującego RNA specyficznego dla BRCA1, jak i plazmidu służącego do reekspresji testowanych białek wariantowych BRCA1 w komórkach; w drugim kroku, oprócz plazmidu do ekspresji białka ICN1, który wywołuje uszkodzenia DNA w specyficznym miejscu genomu DNA komórki testowej, wprowadzane są krótki interferujący RNA oraz plazmid do ekspresji zmutowanego BRCA1. Następnie komórki inkubuje się przez dwa do trzech dni, aby umożliwić wystąpienie uszkodzeń DNA i ich naprawę; wyniki uzyskane na podstawie analizy cytometrycznej przepływowej komórek wykazujących ekspresję GFP wskazują, czy specyficzne warianty białka BRCA1 funkcjonują w naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną.Technika ta łączy dwie uznane metody w celu stworzenia wszechstronnego systemu do analizy specyficznych wariantów białek w procesie naprawy uszkodzeń DNA poprzez rekombinację homologiczną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że wcześniejsze podejścia opierały się na liniach komórkowych z genetycznym nokautem BRCA1. Wykorzystujemy łatwiejszą w obsłudze linię komórkową pochodzącą z komórek HELOC, która umożliwia wyciszenie BRCA1 poprzez interferencję RNA endogennego białka oraz ponowne wprowadzenie białka testowego do tych komórek.Po ekspresji wariantu białka BRC1 możemy przeprowadzić test rekombinacji homologicznej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na nadmierną śmierć komórek podczas procedury. Ważne jest, aby starannie dobrać warunki transfekcji, tak aby zmaksymalizować efekt reakcji rekombinacji przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności.Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu linia komórkowa hela DR 13 została utworzona poprzez transfekcję komórek hela plazmidem P-D-R-G-F-P. Linię komórkową utrzymywano na 10 centymetrowych szalkach Petriego w pożywce z purmycyną w celu selekcji stabilnie transfektowanych komórek. Substrat rekombinacyjny w plazmidzie P-D-R-G-F-P oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP. Jeden allel jest nieaktywny ze względu na obecność 18 par zasad stanowiących miejsce rozpoznawania przez enzym restrykcyjny I-SceI.W swojej sekwencji kodującej ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje powstanie pęknięcia dwuniciowego DNA (DSB) w drugim allelu nieaktywnego GFP. Fragment jego sekwencji skorelowany z miejscem I-SceI w pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może pełnić funkcję donora sekwencji dla naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną, co prowadziłoby do powstania aktywnego allelu GFP, który jest łatwo wykrywalny za pomocą cytometrii przepływowej w dniu poprzedzającym pierwszą transfekcję.Przygotować szalkę o średnicy 10 cm z komórkami HeLa DR 13 o konfluencji co najmniej 90%. Potraktować komórki trypsyną w ilości 1 ml przez 2 do 3 minut. Przerwać reakcję poprzez dodanie 9 ml DMEM-FBS i dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety. Przenieść 40 µL trypsynizowanych komórek do każdego dołka płytki 24-dołkowej w 0,5 ml DMEM-FBS. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.W pierwszym dniu komórki powinny osiągnąć od 40 do 50% konfluencji. Transfekcję należy rozpocząć od wymieszania siRNA służącego do wyciszenia endogennego b RCA one oraz plazmidu ekspresyjnego mutant b RCA one w podłożu Optimum.Przeprowadzić transfekcję lipofektową zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie inkubować komórki. Po czterech do sześciu godzinach wymienić medium na takie, które nie zawiera antybiotyków.W drugim dniu inkubuj komórki przez noc. Aby zneutralizować komórki, dodaj 0,3 ml odczynnika TrypLE Trypsin do każdej studzienki. Po krótkiej inkubacji w temperaturze 37 °C odklej komórki, pipetując je w górę i w dół w odczynniku trypsynowym. Gdy trypsyna zadziała, przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej zawierającej 2 ml DMEM-FBS, aby zatrzymać działanie trypsyny.Inkubować płytkę sześciodołkową przez noc w tych samych warunkach co wcześniej, dwa dni po początkowej transfekcji. Przygotować SIR A, plazmid DNA wykazujący mutację BRCA1 oraz plazmid wykazujący ISCE1 w 62,5 µL Optum. Wymieszać ten roztwór z 2,5 µL LIPECTOMY 2060 oraz 2,5 µL Optum.Przystąp do transfekcji komórek po czterech do sześciu godzinach inkubacji. Wymień medium na D-M-E-M-F-P-S pozbawiony antybiotyków. W szóstym dniu przenieś komórki z powrotem do inkubatora.Potraktuj komórki w każdej studni, dodając 0,5 ml odczynnika trypsyny. Przerwij reakcję poprzez dodanie dwóch ml D-M-E-M-F-B-S. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Resuspenduj komórki w jednym ml świeżego D-M-E-M-F-B-S i przeanalizuj 10 000 komórek na studnię pod kątem ekspresji GFP.Za pomocą cytometrii przepływowej pojedyncze żywe komórki są selekcjonowane (gatowane) przy użyciu parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz bocznego (side scatter). Komórki wykazujące ekspresję GFP są wyodrębniane za pomocą detektora fluorescencji GFP, a wyniki przedstawione są w formie histogramu. Pozostałe komórki mogą zostać ponownie wysiane w celu wykonania zdjęć fluorescencyjnych.Mikroskopia pożądanych komórek BRCA1 regulujących szlak naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez rekombinację homologiczną. Komórki, które przeszły naprawę drogą rekombinacji homologicznej, są łatwo wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wyciszenie BRCA1 za pomocą RNAi prowadzi do gwałtownego spadku liczby wykrytych komórek pozytywnych pod kątem GFP.Wynikiem analizy FCA jest histogram z intensywnością GFP na jedną komórkę na osi X oraz liczbą komórek na osi Y. W przypadku braku transfekcji plasmidu ekspresyjnego w komórkach SCE nie wykryto komórek GFP-dodatnich.Wyniki w kolumnach od drugiej do szóstej uzyskano z komórek, w których w trzecim dniu przeprowadzono transfekcję plazmidu wykazującego ekspresję I SCE one. W typowym zestawie wyników z pojedynczego eksperymentu, 15,5% komórek jest pozytywnych pod kątem GFP po ekspresji I SCE one i kontrolnym wyciszeniu RNAi nieistotnego genu; w porównaniu z tym, wyciszenie BRCA one i dodanie pustego wektora plazmidowego zmniejszyło konwersję GFP do 0,7%. Dodanie egzogennego BRCA one typu dzikiego w pełni przywróciło rekombinację homologiczną, co wykryto poprzez uzyskanie 15 do 16% komórek pozytywnych pod kątem GFP.Podobnie, ekspresja innego wariantu o nieznanym znaczeniu, mutacji BRCA1 21B, w pełni przywróciła zależną od BRCA1 funkcję rekombinacji homologicznej. Ponowne wprowadzenie mutanta BRCA1 M18T wywołało efekt podobny do kontroli wektorowej.Ponieważ wariant ten był wyrażany na podobnym poziomie co białko endogenne, sugeruje to, że wariant BRCA1 M18T jest niefunkcjonalny w procesie rekombinacji homologicznej. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o monitorowaniu wzrostu komórek, uwzględniając fakt, że rosną one powoli i przy niskiej konfluencji, co wymaga zmniejszenia ilości użytej mieszaniny do transfekcji. Ważne jest również terminowe usunięcie medium do transfekcji.Stwierdziliśmy, że w dniach następujących po transfekcji występuje wysoki stopień cytotoksyczności, jeśli w pożywce znajdują się antybiotyki. Z tego powodu we wszystkich pożywkach po pierwszym dniu rozwoju pominięto antybiotyki. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka piersi do eksploracji genetyki wariantów BRC1 o nieznanym znaczeniu klinicznym w klinikach onkologicznych.Mamy nadzieję, że opracowany w niniejszej pracy funkcjonalny test BRC one pozwoli na lepsze przewidywanie wpływu wariantów BRC one na predyspozycje do nowotworów.

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną przy użyciu komórek ekspresujących endogenną, dzikotypową BRCA1

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Wyciszanie genów przez siRNA stanowi wygodną strategię eksperymentalną do analizy funkcji biologicznych zależnych od BRCA2 z natychmiastowymi implikacjami dla lepszego zrozumienia biologii raka. Przedstawiono metodę skutecznego wyciszania BRCA2 wraz z eksperymentalną procedurą wykrywania i ilościowego określania zmian w ekspresji białka BRCA2 poprzez immunoblotting w ludzkich liniach komórkowych.

Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Ten protokół jest przeznaczony do badania zakresu uszkodzeń DNA występujących podczas replikacji DNA. W neutralnych warunkach indukcję pęknięć DNA można łatwo ocenić w krótkim czasie. Dodatkowo protokół można dostosować do innych typów komórek i różnych odczynników stresu replikacyjnego.

Wykrywanie pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety

Poznaj metodę testowania wariantów BRCA1 w naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną z użyciem RNAi i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia badanie funkcji mutacji w komórkach HeLa.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Przeglądaj więcej filmów