Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną przy użyciu komórek wyrażających endogenne BRCA1 typu dzikiego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przetestowanie określonych wariantów białka BRCA one za pomocą testu rekombinacji homologicznej in vitro. Osiąga się to poprzez zastąpienie endogennego białka BRCA one typu dzikiego wariantem testowanym poprzez transfekcję zarówno krótkiego interferującego RNA, specyficznego dla BRCA jeden, jak i plazmidu do reekspresji testowych białek wariantu BRCA one do komórek w drugim etapie, krótki interferujący RNA i plazmid do ekspresji zmutowanego BRCA jeden jest recięty RET wraz z plazmidem do ekspresji białka ISCE one, który powoduje uszkodzenie DNA w określonym miejscu w genomie DNA komórki testowej. Następnie komórki są inkubowane przez dwa do trzech dni, aby umożliwić uszkodzenie i naprawę DNA, uzyskuje się wyniki, które pokazują, czy określone warianty białka BRCA one działają w naprawie DNA przez rekombinację homologiczną na podstawie analizy cytometrii przepływowej komórek eksprymujących GFP.

Technika ta łączy dwie uznane metody w celu stworzenia wszechstronnego systemu do analizy określonych wariantów białek w naprawie uszkodzeń DNA przez rekombinację homologiczną. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że wcześniej stosowane metody opierały się na liniach komórkowych, które miały genetyczny nokaut BRCA. Używamy łatwiejszej w zarządzaniu linii komórkowej pochodzącej z komórek HELOC, która umożliwia BRC zubożenie o jeden przez interferencję RNA endogennego białka i dodanie białka testowego w tych komórkach.

Teraz, gdy ulegnie ekspresji wariantu białka BRC, możemy przetestować rekombinację homologiczną. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą zmagać się z nadmierną śmiercią komórek podczas zabiegu. Ważne jest, aby warunek przecięcia był starannie ustawiony, maksymalizując efekt reakcji rekombinacji przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności.

Przed rozpoczęciem tego protokołu dziewięciokomórkowa linia hela DR 13 została utworzona przez transekcję komórek hela za pomocą P-D-R-G-F-P Utrzymuj linię komórkową na 10-centymetrowych szalkach Petriego w pur mycynie w celu selekcji stabilnie transfekowanych komórek. Substrat rekombinacyjny w plazmidzie P-D-R-G-F-P oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP. Jeden allel jest nieaktywny ze względu na włączenie miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego 18 par zasad dla ISCE one.

W swojej sekwencji kodującej ekspresję ISCE jedna z tych komórek tworzy dwuniciowe pęknięcie DNA lub DSB na drugim allelu nieaktywnego GFP. Część jego sekwencji skorelowana z I SCE E jedno miejsce na pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może funkcjonować jako dawca sekwencji do naprawy rekombinacji homologicznej DSP i skutkowałby aktywnym allelem GFP, który jest łatwo wykrywany przez cytometrię przepływową na dzień przed pierwszą transfekcją.

Zaopatrz się w 10-centymetrowe naczynie z dziewięcioma komórkami hela DR 13, które składają się w co najmniej 90% z trypsyny, obserwuj komórki w jednym mililitrze przez dwie do trzech minut. Zatrzymaj reakcję, dodając dziewięć mililitrów D-M-E-M-F-B-S i dobrze wymieszaj zawiesinę komórek przez pipetowanie. Dodaj 40 mikrolitrów komórek inizowanych trypsem na dołek 24-dołkowej płytki w 0,5 mililitra D-M-E-M-F-B-S, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc.

Pierwszego dnia komórki powinny składać się w 40 do 50%. Rozpocznij transfekcję od zmieszania zarówno irna w celu zubożenia endogennego b RCA jeden, jak i B RCA jednego mutanta eksprymującego plazmid w optymalnym podłożu. Następnie połącz kwasy nukleinowe z wargą w optymalnym pożywce.

Kontynuuj transfekcję lipektomii zgodnie z instrukcjami producenta po transfekcji. Zwróć komórki do inkubacji. Zastąp pożywkę cztery do sześciu godzin później pożywką, która nie zawiera antybiotyków.

Drugiego dnia należy zwrócić komórki do inkubacji przez noc. Trypsyna to komórki, dodając 0,3 mililitra odczynnika trypsyny do każdej studzienki po krótkiej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, poluzuj komórki, pipetując komórki w górę iw dół w odczynniku trypsyny. Po zastosowaniu trypsyny przenieś komórki z płytki 24-dołkowej na płytkę sześciodołkową zawierającą dwa mililitry D-M-E-M-F-B-S, aby zatrzymać aktywność tripyny.

Pozostawić płytkę sześciodołkową do inkubacji przez noc w tych samych warunkach, co przed dwoma dniami od początkowej transfekcji. Przygotować SIR A, BRCA jeden mutant eksprymujący DNA osocza i jeden ISCE eksprymujący plazmid w 62,5 mikrolitrach Optum. Wymieszać ten roztwór z 2,5 mikrolitra LIPECTOMY 2060 2,5 mikrolitra Optum.

Przystąp do transfekcji komórek po cztero- lub sześciogodzinnej inkubacji. Zastąp pożywkę na D-M-E-M-F-P-S bez antybiotyków. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze w szóstym dniu.

Trypsyna to komórki w każdej studzience przez dodanie 0,5 mililitra odczynnika trypsyny trip e. Zatrzymaj reakcję, dodając dwa mililitry D-M-E-M-F-B-S, zbierz komórki przez odwirowanie przy 1000 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżego D-M-E-M-F-B-S przeanalizować 10 000 komórek na studzienkę pod kątem ekspresji GFP.

Za pomocą cytometrii przepływowej pojedyncze żywe komórki są bramkowane przy użyciu parametrów rozpraszanych do przodu i wielkości. Komórki GFP dodatnie są kierowane za pomocą detektora fluorescencji GFP, a wyniki są prezentowane w postaci histogramu. Pozostałe komórki można ponownie platerować do fotografii za pomocą fluorescencji.

Mikroskopia pożądanego genu BRCA reguluje szlak naprawy pęknięć dwuniciowego DNA przez rekombinację homologiczną. Komórki, które uległy naprawie przez rekombinację homologiczną, są łatwo wykrywane przez mikroskopię fluorescencyjną. Zubożenie BRCA one przez RNAi powoduje gwałtowny spadek wykrywanych komórek GFP-dodatnich.

Dane wyjściowe z FCA to histogram z intensywnością GFP na komórkę na osi x i liczbą komórek na osi Y. W przypadku braku transfekowanego, SCE jeden plazmid eksprymujący się. Nie wykryto komórek GFP dodatnich.

Wyniki w kolumnach od drugiej do szóstej zostały pobrane z komórek, w których w trzecim dniu transfekowano plazmid z ekspresją ISC jeden. W typowym zestawie wyników z pojedynczego eksperymentu, 15,5% komórek jest dodatnich pod względem GFP po I SCE jednej ekspresji i kontroli wyczerpania RNAi dla nieistotnego genu poprzez porównanie zubożenia BRCA jeden i dodanie z powrotem pustego wektora plazmidowego. Zmniejsz konwersję GFP do 0,7%Dodanie egzogennego BRCA typu dzikiego Jedna w pełni przywrócona rekombinacja homologiczna, wykryta przez uzyskanie od 15 do 16% komórek GFP.

Podobnie wyrażenie innego wariantu o nieznanym znaczeniu. Mutacja BRCA one I 21 B w pełni przywrócona. Dodanie BRCA do jednej zależnej od homologicznej funkcji rekombinacji mutanta BRCA one M 18 T miało podobny efekt jak kontrola wektorowa.

Ponieważ wariant ten ulega ekspresji na podobnych poziomach jak białko endogenne, sugeruje to, że wariant BRCA one M 18 T jest niefunkcjonalny w rekombinacji homologicznej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o monitorowaniu wzrostu komórek, ponieważ komórki rosną powoli i z niską płynnością konfuzji, a ilość użytej mieszanki do transfekcji musi zostać zmniejszona. Ważne jest również, aby usunąć podłoże transfekcyjne w odpowiednim czasie.

Stwierdzamy, że w dniach po transfekcji występuje wysoka ilość cytotoksyczności, jeśli antybiotyki są zawarte w pożywce. Z tego powodu cała pożywka po dniu brakuje antybiotyków Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem piersi do zbadania genetyki wariantów BRC one o nieznanym znaczeniu klinicznym w klinikach onkologicznych.

Mamy nadzieję, że opracowany w tej pracy funkcjonalny test BRC one umożliwi lepsze przewidywanie wpływu wariantów BRC one na predyspozycje do nowotworów.