Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przetestowanie specyficznych wariantów białka BRCA1 przy użyciu in vitro testu rekombinacji homologicznej. Osiąga się to poprzez zastąpienie endogennego białka BRCA1 typu dzikiego testowanym wariantem za pomocą transfekcji zarówno krótkich interferujących RNA specyficznych dla BRCA1, jak i plazmidu do reekspresji testowych białek wariantów BRCA1 w komórkach; w drugim kroku krótkie interferujące RNA oraz plazmid do ekspresji zmutowanego BRCA1 są wprowadzane dodatkowo wraz z plazmidem do ekspresji białka ICN1, które wywołuje uszkodzenie DNA w specyficznym miejscu w genomie DNA komórki testowej. Następnie komórki inkubuje się przez dwa do trzech dni, aby umożliwić wystąpienie uszkodzenia i naprawy DNA; wyniki uzyskane na podstawie analizy cytometrii przepływowej komórek wykazujących ekspresję GFP wskazują, czy specyficzne warianty białka BRCA1 funkcjonują w naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną.

Technika ta łączy dwie uznane metody w celu stworzenia wszechstronnego systemu analizy specyficznych wariantów białek w procesie naprawy uszkodzeń DNA poprzez rekombinację homologiczną. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że poprzednie podejścia opierały się na liniach komórkowych z genetycznym nokautem BRCA1. Wykorzystujemy łatwiejszą w obsłudze linię komórkową pochodzącą z komórek HELOC, która umożliwia deplecję BRCA1 poprzez interferencję RNA białka endogennego oraz ponowne wprowadzenie białka testowego do tych komórek.

Ekspresując teraz wariant białka BRC1, możemy przeprowadzić test rekombinacji homologicznej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na nadmierną śmierć komórek podczas procedury. Ważne jest, aby starannie dobrać warunki transfekcji, tak aby zmaksymalizować efekt reakcji rekombinacji przy jednoczesnym ograniczeniu cytotoksyczności.

Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu linię komórkową hela DR 13 utworzono poprzez transfekcję komórek hela plazmidem P-D-R-G-F-P. Linię komórkową utrzymywano na 10 centymetrowych szalkach Petriego w pożywce z puromycyną w celu selekcji stabilnie transfektowanych komórek. Substrat rekombinacyjny w plazmidzie P-D-R-G-F-P oraz w stabilnych transformantach zawiera dwa nieaktywne allele GFP. Jeden allel jest nieaktywny ze względu na obecność 18 par zasad stanowiących miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego ISCE one.

W jego sekwencji kodującej ekspresja I-SceI w tych komórkach powoduje pęknięcie dwuniciowe DNA lub DSB w drugim allelu nieaktywnego GFP. Fragment jego sekwencji odpowiadający miejscu I-SceI w pierwszym allelu jest typu dzikiego. Ten drugi allel GFP może pełnić rolę donora sekwencji dla naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną, co prowadziłoby do powstania aktywnego allelu GFP, który jest łatwo wykrywany za pomocą cytometrii przepływowej w dniu poprzedzającym pierwszą transfekcję.

Przygotować 10-centymetrową szalkę z komórkami HeLa DR 13 o konfluencji co najmniej 90%. Potraktować komórki 1 ml trypsyny przez 2–3 minuty. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 9 ml DMEM-FBS i dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej przenieść 40 µL trypsynizowanych komórek w 0,5 ml DMEM-FBS. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.

W pierwszym dniu komórki powinny osiągnąć stopień konfluencji od 40 do 50%. Transfekcję należy rozpocząć od zmieszania irna służącej do wyciszenia endogennego b RCA one oraz plazmidu wyrażającego mutant B RCA one w pożywce optimum.

Przeprowadź transfekcję lipektomią zgodnie z instrukcjami producenta po przeprowadzeniu transfekcji. Przenieś komórki do inkubacji. Po czterech do sześciu godzinach wymień pożywkę na taką, która nie zawiera antybiotyków.

W drugim dniu oddaj komórki do inkubacji na noc. Aby odszczepić komórki trypsyną, dodaj 0,3 ml odczynnika TrypLE Trypsin do każdej studni; po krótkiej inkubacji w temperaturze 37 °C poluzuj komórki, pipetując je w górę i w dół w odczynniku z trypsyną. Po zadziałaniu trypsyny przenieś komórki z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej zawierającej 2 ml DMEM-FBS, aby zatrzymać aktywność trypsyny.

Inkubuj płytkę sześciodołkową przez noc w tych samych warunkach co wcześniej, dwa dni po początkowej transfekcji. Przygotuj SIR A, plazmid DNA wykazujący mutację BRCA one oraz plazmid ISCE one w 62,5 µL Optum. Wymieszaj ten roztwór z 2,5 µL LIPECTOMY 2060 i 2,5 µL Optum.

Przejdź do transfekcji komórek po czterech do sześciu godzinach inkubacji. Wymień pożywkę na D-M-E-M-F-P-S bez antybiotyków. W szóstym dniu przenieś komórki z powrotem do inkubatora.

Zneutralizuj trypsynę w każdej studzience, dodając 0,5 ml odczynnika trypsynowego. Przerwij reakcję, dodając 2 ml DMEM-FBS. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 1000 RPM przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Resuspenduj komórki w 1 ml świeżego DMEM-FBS i przeanalizuj 10 000 komórek na studzienie w kierunku ekspresji GFP.

Za pomocą cytometrii przepływowej pojedyncze żywe komórki są selekcjonowane (gate’owane) przy użyciu parametrów rozproszenia światła w przód (FSC) oraz prostopadle (SSC). Komórki wykazujące fluorescencję GFP są wyodrębniane przy użyciu detektora GFP, a wyniki przedstawione są w formie histogramu. Pozostałe komórki mogą zostać ponownie wysiane w celu wykonania zdjęć fluorescencyjnych.

Mikroskopia wykazuje, że pożądane białko BRCA1 reguluje szlak naprawy dwuniciowych pęknięć DNA poprzez rekombinację homologiczną. Komórki, w których doszło do naprawy przez rekombinację homologiczną, są łatwo wykrywalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wyciszenie BRCA1 za pomocą RNAi skutkuje gwałtownym spadkiem liczby wykrytych komórek wykazujących pozytywną ekspresję GFP.

Wynikiem analizy FCA jest histogram z intensywnością GFP na komórkę na osi X oraz liczbą komórek na osi Y. W przypadku braku transfekcji plazmidem ekspresyjnym I SCE, nie wykryto komórek GFP-dodatnich.

Wyniki w kolumnach od drugiej do szóstej pochodzą z komórek, w których w trzecim dniu przeprowadzono transfekcję plazmidu wykazującego ekspresję ISC jeden. W typowym zestawie wyników z pojedynczego eksperymentu, 15,5% komórek jest GFP-dodatnich po ekspresji I SCE jeden i kontrolnym wyciszeniu RNAi nieistotnego genu; dla porównania, wyciszenie BRCA jeden i wprowadzenie pustego wektora plazmidowego redukuje konwersję GFP do 0,7%. Dodanie egzogennego BRCA jeden typu dzikiego w pełni przywróciło rekombinację homologiczną, co stwierdzono uzyskując 15 do 16% komórek GFP-dodatnich.

Podobnie, ekspresja innego wariantu o nieznanym znaczeniu. Mutacja BRCA1 21B w pełni przywróciła funkcję. W przypadku powrotu funkcji rekombinacji homologicznej zależnej od BRCA1, mutant BRCA1 M18T wywołał efekt podobny do kontroli wektorowej.

Ponieważ wariant ten był eksprymowany na poziomach zbliżonych do białka endogennego, sugeruje to, że wariant BRCA1 M18T jest niefunkcjonalny w procesie rekombinacji homologicznej. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o monitorowaniu wzrostu komórek, gdyż rosną one powoli i przy niskiej konfluencji, w związku z czym należy zmniejszyć ilość użytej mieszaniny do transfekcji. Ważne jest również, aby w odpowiednim czasie usunąć medium do transfekcji.

Stwierdzono, że w dniach następujących po transfekcji występuje wysoki poziom cytotoksyczności, jeśli w pożywce znajdują się antybiotyki. Z tego powodu we wszystkich pożywkach stosowanych po pierwszym dniu hodowli nie zawarto antybiotyków. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu raka piersi do eksploracji genetyki wariantów BRC1 o nieznanym znaczeniu klinicznym w klinikach onkologicznych.

Mamy nadzieję, że opracowany w niniejszej pracy funkcjonalny test BRC one pozwoli na lepszą przewidywalność wpływu wariantów BRC one na predyspozycje do nowotworów.