Oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych przy użyciu zestawu Qiagen Miniprep Kit

Nazywam się Mike Halen, pracuję w laboratorium w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak używać zestawu collagen mini fabricate do oczyszczania DNA z bakterii. Wykonuję tę czynność jako jeden z etapów eksperymentu z mutagenezą celowaną.

Po otrzymaniu plazmidu przeprowadzę sekwencjonowanie wstawki, aby zweryfikować, czy wybrane klony zawierają pożądane mutacje. Przed przystąpieniem do mini-preparacji krótko omówię czynności wykonane wczoraj. Aby wyhodować bakterie, muszę najpierw zaszczepić 5 mL LB w oddzielnych probówkach.

Jak widać, przed wprowadzeniem bakterii do probówki medium jest klarowne. Następnie za pomocą pipety przenoszę pojedynczą kolonię z płytki agarowej, wymieniając końcówkę przy każdej operacji, aby uniknąć kontaminacji. Następnie umieszczam probówki w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 RPM, aby hodowla rosła przez co najmniej osiem godzin, a zazwyczaj pozostawiamy ją na całą noc.

Z zestawu do minipreparacji kolagenu pochodzą trzy ważne bufory: P1, P2 oraz N3. Bufor P1 przechowujemy zazwyczaj w temperaturze 4°C, ponieważ zawiera on RNA; bufor P2 pozostawiamy w temperaturze pokojowej, natomiast bufor N3 przygotowujemy bezpośrednio przed eksperymentem, po ośmiu godzinach.

Jak widać, pożywka jest teraz mętna, ponieważ wewnątrz rosną bakterie; przeniosę 5 µL pożywki na inną płytkę. Dzięki temu, po zweryfikowaniu klonów, będę mógł powrócić bezpośrednio do bakterii bez konieczności przeprowadzania kolejnej transformacji. Po odwirowaniu pożywki na dnie probówki widoczny jest wyraźny osad bakteryjny; zniesiemy nadsącz do wybielacza, aby zapobiec skażeniu środowiska, podczas gdy osad pozostanie w probówce.

Teraz dodaję bufor P1 do płytek z bakteriami. Bufor P1 jest buforem resuspensyjnym służącym do resuspensji bakterii. Następnie będę pipetować roztwór w górę i w dół, aby wymieszać bakterie z buforem.

Na tym etapie w roztworze nie powinno być widocznych żadnych grudek bakterii. Teraz przeniosę resuspensowane bakterie do nowej probówki typu Eppendorf. Zawsze etykietuję swoje probówki, aby móc je odróżnić i wiedzieć, który roztwór pochodzi z którego klonu.

Teraz dodałem bufor P2 do każdej probówki; bufor P2 jest buforem lizującym służącym do lizy bakterii. Po dodaniu buforu P2 widać, że roztwór nadal nie jest klarowny. Teraz odwracam wszystkie probówki kilka razy, aby roztwór dobrze się wymieszał.

W tej chwili widać, że roztwór staje się klarowny. Teraz dodaję bufor N3 – do każdej probówki dodawany jest bufor M3, który jest buforem neutralizacyjnym. Natychmiast po dodaniu buforu N3 obserwuję wytrącanie białek, jednak mimo to kilkakrotnie odwracam probówki, aby dokładnie wymieszać roztwór.

Po dokładnym wymieszaniu roztworu. Tak powinien wyglądać preparat po dodaniu buforu nr 3. Teraz użyję wirówki do osadzenia wytrąconego białka; odwirowywanie będzie trwało 10 minut. Użyłem zestawu Cal VAC 6 s.

Łączę wszystkie elementy w odpowiedniej kolejności, a następnie podłączam je do układu próżniowego. Teraz mocuję zestaw do przygotowania kalibracji, czyli pasek do kolektora. Dzisiaj wykonamy tylko jedną próbę, więc blokuję pozostałe gniazda.

Mamy zatem odpowiednią próżnię. Jak widać, oznaczyłem pasek zgodnie z moimi probówkami i po włączeniu pompy próżniowej uzyskałem odpowiednią próżnię. Dobrze, po wirowaniu probówki widać osad białkowy na dnie, a DNA powinno pozostać rozpuszczone w nadosadzie.

Teraz przenosimy nadsącz, który zawiera DNA, na paski do przygotowania DNA; muszę wspomnieć, że zawsze musimy zmienić końcówki, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej. Teraz włączam odsysanie. Teraz wyłączam odsysanie i dodaję bufor PB, aby wypłukać pasek, który w tej chwili zawiera DNA w filtrze.

Teraz dodaję do paska roztwór PB, aby go przemyć; na filtrze wciąż znajduje się DNA. Tym razem nie muszę wymieniać końcówek, o ile nie dotknę paska. Teraz dodaję do paska bufor P w ten sam sposób, w jaki zrobiłem to z buforem PB.

Powtórzę tę czynność dwukrotnie po włączeniu pompy próżniowej. Jak widać, roztwór P przechodzi obecnie przez pasek; pozostawimy uruchomioną próżnię przez kolejne pięć minut, aby upewnić się, że filtr będzie całkowicie suchy. Po pięciu minutach próżni wyjmij pasek z pudełka, a następnie owiń go papierem Kimwipe. Uderz nim o stół, aby usunąć pozostałości buforu P.

W tym momencie widać, że nie pozostało wiele kropli buforu P, a DNA powinno wciąż znajdować się w filtrze. Oto probówki mikroodśrodkowe do zbierania materiału. Oznaczyłem je zgodnie z paskiem.

Teraz otwieram odkurzacz samochodowy i ponownie go montuję wraz z mikroprobówkami do zbierania, upewniając się, że pasek odpowiada mikroprobówkom. Tak powinien w tej chwili wyglądać kolektor. Oto widok kolektora próżniowego, który został przygotowany do elucji DNA z paska do mikroprobówki.

Pasek znajduje się na górze, a bezpośrednio pod nim znajduje się probówka, oznakowana w ten sam sposób. Teraz należy nalać sterylną wodę na pasek bez stosowania próżni i odczekać minutę. W tym przypadku, gdy próżnia jest utrzymywana dłużej, jak widać, woda przechodzi przez pasek i przedostaje się do mikroprobówek zbiorczych.

Woda zawiera DNA. Pozostawiam również włączoną pompę próżniową przez pewien czas, aby upewnić się, że cała woda zostanie zebrana. Oto mikroprobówki z roztworem DNA po zakończeniu tego etapu.

Witajcie, właśnie pokazałem wam, jak użyć zestawu do minipreparacji wapniowej w celu oczyszczenia DNA z bakterii. Następnie zsekwencjonowano wstawkę, aby zweryfikować prawidłowe klony, i powinienem wspomnieć o zastosowaniu tej metody. Ilość DNA zazwyczaj oscyluje w granicach mikrograma.

Życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów. Dziękujemy za oglądanie.