Name: Oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych za pomocą zestawu Qiagen Miniprep Kit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Naucz się oczyszczania plazmidowego DNA z bakterii metodą minipreparacji w celu mutagenezy z ukierunkowaniem miejscowym. Technika ta umożliwia przygotowanie próbek do sekwencjonowania i weryfikacji mutacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

oczyszczanie plazmidowego dna z kolonii bakteryjnych przy użyciu zestawu qiagen miniprep kit

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Oczyszczanie plazmidowego DNA z E. coli jest podstawową techniką w klonowaniu molekularnym. Oczyszczanie w małej skali (miniprep) z mniej niż 5 ml hodowli bakteryjnej jest szybką metodą weryfikacji klonów lub izolacji DNA, po której następują dalsze reakcje enzymatyczne (reakcja łańcuchowa polimerazy oraz trawienie enzymami restrykcyjnymi). W niniejszym materiale wideo zarejestrowano ogólne procedury miniprepu z wykorzystaniem zestawu QIAprep 8 Miniprep Kit firmy QIAGEN, w celu zaprezentowania tej wysoce wydajnej techniki osobom rozpoczynającym naukę technik biologii molekularnej. Cała procedura opiera się na alkalicznej lizie komórek E. coli, a następnie adsorpcji DNA na krzemionce w obecności wysokiego stężenia soli. Składa się ona z trzech etapów: 1) przygotowanie i klarowanie lizatu bakteryjnego, 2) adsorpcja DNA na membranie QIAprep, 3) przemywanie i elucja plazmidowego DNA. Wszystkie etapy są wykonywane bez użycia fenolu, chloroformu, CsCl i bromku etydyny oraz bez wytrącania alkoholem. Cała procedura zajmuje zazwyczaj mniej niż 2 godziny.

Oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych przy użyciu zestawu Qiagen Miniprep Kit

Oczyszczanie plazmidowego DNA z E. coli jest podstawową techniką w klonowaniu molekularnym. Oczyszczanie w małej skali (miniprep) z mniej niż 5 ml hodowli bakteryjnej...

Nazywam się Mike Halen, pracuję w laboratorium w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak używać zestawu collagen mini fabricate do oczyszczania DNA z bakterii. Wykonuję tę czynność jako jeden z etapów eksperymentu z mutagenezą celowaną.Po otrzymaniu plazmidu przeprowadzę sekwencjonowanie wstawki, aby zweryfikować, czy wybrane klony zawierają pożądane mutacje. Przed przystąpieniem do mini-preparacji krótko omówię czynności wykonane wczoraj. Aby wyhodować bakterie, muszę najpierw zaszczepić 5 mL LB w oddzielnych probówkach.Jak widać, przed wprowadzeniem bakterii do probówki medium jest klarowne. Następnie za pomocą pipety przenoszę pojedynczą kolonię z płytki agarowej, wymieniając końcówkę przy każdej operacji, aby uniknąć kontaminacji. Następnie umieszczam probówki w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 RPM, aby hodowla rosła przez co najmniej osiem godzin, a zazwyczaj pozostawiamy ją na całą noc.Z zestawu do minipreparacji kolagenu pochodzą trzy ważne bufory: P1, P2 oraz N3. Bufor P1 przechowujemy zazwyczaj w temperaturze 4°C, ponieważ zawiera on RNA; bufor P2 pozostawiamy w temperaturze pokojowej, natomiast bufor N3 przy

purifying-plasmid-dna-from-bacterial-colonies-using-qiagen-miniprep

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie DNA plazmidowego z kolonii bakterii za pomocą zestawu Qiagen Miniprep

Niniejszy protokół stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla wydajnego równoległego klarowania i oczyszczania plazmidowego DNA z kultur E. coli. Proces AcroPrep Advance rozpoczyna się od zoptymalizowanej płyty filtracyjnej do klarowania lizatu, a następnie obejmuje oczyszczanie na płycie filtracyjnej do wiązania DNA o wysokiej pojemności wiązania.

Uproszczone oczyszczanie plazmidowego DNA z kultur prokariotycznych

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Nowatorska półautomatyczna hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do użytku z próbkami środowiskowymi z produkcji drobiu została opracowana i wykazała ulepszenia w stosunku do powszechnej metody ekstrakcji mechanicznej i enzymatycznej pod względem ilościowych i jakościowych szacunków całkowitych społeczności bakteryjnych.

Hybrydowa metoda ekstrakcji DNA do jakościowej i ilościowej oceny zbiorowisk bakteryjnych z próbek produkcyjnych drobiu

Liniowy kowalencyjnie zamknięty (LCC) miniwektor DNA (zarządzanie DNA) jest niewirusowym wektorem dostarczania genów, oferującym wysoką wydajność transfekcji i jest odpowiedni dla każdej aplikacji dostarczania DNA. System produkcyjny jest prosty, szybki i skalowalny in vivo. Poniższy protokół zawiera wizualne instrukcje krok po kroku dotyczące produkcji ministringów DNA.

Produkcja dwuniciowych ministringów DNA

Ten artykuł przedstawia czułą metodę o nazwie Circle-Seq do oczyszczania pozachromosomalnego kolistego DNA (eccDNA). Metoda obejmuje oczyszczanie kolumny, usuwanie pozostałego liniowego chromosomalnego DNA, amplifikację w okręgu toczonym i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Circle-Seq ma zastosowanie do badań przesiewowych eukariotycznego eccDNA w skali genomu oraz badania niestabilności genomu i zmienności liczby kopii.

Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Tutaj prezentujemy protokoły pracy z DSM20016 Limosilactobacillus reuteri, szczegółowo opisując wzrost, transformację plazmidu, PCR kolonii, pomiar fluorescencyjnego białka reporterowego i ograniczone mini-przygotowanie plazmidu, a także typowe problemy i rozwiązywanie problemów. Protokoły te umożliwiają pomiar białek reporterowych w DSM20016 lub potwierdzenie za pomocą PCR kolonii, jeśli nie jest zaangażowany reporter.

Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Naucz się oczyszczania plazmidowego DNA z bakterii metodą minipreparacji w celu mutagenezy z ukierunkowaniem miejscowym. Technika ta umożliwia przygotowanie próbek do sekwencjonowania i weryfikacji mutacji.

Oczyszczanie plazmidowego DNA z kolonii bakteryjnych przy użyciu zestawu Qiagen Miniprep Kit

Przeglądaj więcej filmów