Name: Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywych progenitorów miogenicznych i adipogenicznych z mięśni szkieletowych myszy przy użyciu enzymatycznej dygestii i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia badanie regeneracji tkanek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Pobieranie tkanek:
<ol>
<li>Należy użyć myszy w wieku od 7 do 12 tygodni. Zazwyczaj wykorzystuje się co najmniej dwa zwierzęta: jedno służy do przygotowania jednobarwnych kontroli FACS niezbędnych do kompensacji oraz próbek kontrolnych izotypów fluorescence-minus-one, a drugie stanowi właściwą próbkę do sortowania.</li>
<li>Myszy należy uśmiercić poprzez inhalację CO2 lub zgodnie z wybranym protokołem etycznym. Myszy należy położyć na ręczniku papierowym grzbietem do góry i dokładnie spryskać 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu futrem myszy.</li>
<li>Za pomocą pęsety należy unieść skórę w okolicy brzusznej, a następnie wykonać niewielkie cięcie podłużne ostrymi nożyczkami.</li>
<li>Dwa płaty skóry należy odsunąć w przeciwnych kierunkach (do góry i w dół), aby całkowicie odsłonić znajdujące się pod nimi mięśnie kończyn tylnych.</li>
<li>Tkankę mięśniową należy wyciąć, wkładając nożyczki i prowadząc je wzdłuż obu stron piszczeli.</li>
<li>Ten sam proces należy powtórzyć dla kości udowej w celu wycięcia tkanki mięśniowej.</li>
<li>Wszelką wyciętą tkankę mięśniową należy umieścić w 60-milimetrowych szalkach Petriego, używając osobnej szalki dla tkanki od każdej myszy.</li>
<li>Powyższe czynności należy powtórzyć dla wszystkich myszy.</li>
</ol>
2. Rozdzielenie tkanki na pojedyncze komórki poprzez trawienie enzymatyczne:
W całej tej części protokołu należy używać sterylnych odczynników i narzędzi oraz pracować w warunkach sterylnych.
<ol start="9">
<li>Do każdej płytki Petri dodać 2 mL kolagenazy II (Sigma, kat#6885, 50u/ mL) oraz 20 μL roztworu CaCl2 (250mM).</li>
<li>Rozdzielić tkankę mięśniową na małe fragmenty (około 1 mm3) za pomocą dwóch pęset (jednej ząbkowanej i jednej dwuzębnej, z Fine Science Tools, kat#1051-10, 154-10), dbając o usunięcie i odrzucenie jak największej ilości zanieczyszczonej tkanki pozamięśniowej.</li>
<li>Przykryć płytki Petri i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
<li>Wyjąć płytki Petri i za pomocą tłoka strzykawki 3 mL dokładnie rozgnieść fragmenty tkanki. Do każdej próbki należy użyć osobnego tłoka, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych.</li>
<li>Do każdej płytki Petri dodać niewielką ilość (~ 5 mL) sterylnego zimnego PBS i przenieść zawiesinę tkankową do probówki Falcon 50 mL (w razie potrzeby przepłukać płytkę Petri, aby odzyskać całą tkankę).</li>
<li>Energicznie wstrząsnąć probówką Falcon, dopełnić ją PBS, odwirować przy 80 rpm przez 5 minut (Eppendorf bench top Model: 5810R), a następnie odessać nadsącz (powtórzyć czynność 3 razy).</li>
<li>Do każdej probówki dodać 1 mL mieszaniny kolagenazy D (Roche, kat# 1088201, 1.5u/ mL) / dispazy II (Roche, kat#: 0494207801, 2.4u/ mL) oraz 10 μL CaCl2 (250mM); inkubować w temperaturze 37 °C z rotacją przez jedną godzinę.</li>
<li>Dodać 5-10 mL zimnego, sterylnego PBS, wymieszać w vortexie i dokładnie pipetować w celu homogenizacji tkanki.</li>
<li>Dopełnić probówki PBS i dobrze wymieszać.</li>
<li>Przenieść ciecz przez sitko komórkowe 40 μm umieszczone na probówce Falcon 50 mL, aby odfiltrować pozostałe duże fragmenty tkanki. Każdą próbkę podzielić równomiernie pomiędzy trzy probówki Falcon 50 mL. Dopełnić każdą z probówek PBS, a następnie odwirować przy 1600 rpm przez 5 minut w temperaturze 8 °C.</li>
<li>Odlać nadsącz i zebrać komórki do barwienia.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciałami i sortowanie:
Przez cały czas trwania tej sekcji protokołu należy używać sterylnych buforów FACS i buforów do zbierania próbek oraz pracować w warunkach sterylnych. Przeciwciała komercyjne są zazwyczaj uznawane za sterylne, pod warunkiem właściwego obchodzenia się z nimi.
<ol start="20">
<li>W przypadku próbek z kontrolą pojedynczego koloru oraz kontrolą izotypową, resuspendować próbkę w 1 ml buforu FACS, a następnie podzielić zawiesinę komórek do dziewięciu wcześniej oznakowanych probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml (100 μL do każdej probówki).
<ol>
<li>Przygotować mieszaniny do barwienia jednobarwnego zgodnie z poniższą tabelą: 
UWAGA: Końcowe stężenie przeciwciał kontrolnych izotypowych w barwieniu powinno być zgodne ze stężeniem przeciwciała pierwszorzędowego, dla którego stanowią one kontrolę. Na przykład, jeśli przeciwciało anty-Sca-1 jest stosowane dla 1 μg/106 komórek, odpowiadający mu izotyp musi być zastosowany w tym samym stężeniu. 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Probetka nr</td>
 <td>Nazwa probówki</td>
 <td>Firma</td>
 <td>Nr kat.</td>
 <td>klonować</td> 
 <td>izotyp</td>
 <td>rozcieńczanie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>Bezbarwienie</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>Hoechst 342</td>
 <td>sigma</td>
 <td>B261</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>2-5 µg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>PI (współczynnik wpływu / indeks wydajności / główny badacz)</td>
 <td>sigma</td>
 <td>P4864</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>1 µg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="2">4</td> 
 <td rowspan="2">CD31-FITC CD45-FITC</td> 
 <td>ebioscience</td>
 <td>11-0311-85</td>
 <td>390</td>
 <td>IgG2a szczura</td>
 <td>500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Własnego wykonania</td>
 <td> </td>
 <td>I3/2</td>
 <td>IgG2b szczura</td>
 <td>500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>Sca1-PECY7</td>
 <td>biowiedza</td>
 <td>25-5981-82</td>
 <td>D7</td>
 <td>IgG2a szczura</td>
 <td>5000</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>α-7 APC</td>
 <td>Własnej produkcji</td>
 <td> </td>
 <td>R2F2</td>
 <td>rat IgG2b</td>
 <td>1000</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>Przygotować mieszaniny do barwienia kontrolnego izotypowego zgodnie z poniższą tabelą: 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Probówka nr</td>
 <td>Nazwa probówki</td>
 <td>Hoechst</td>
 <td>PI</td>
 <td>CD31- FITC</td>
 <td>CD45- FITC</td>
 <td>Skal- PE-Cy7</td>
 <td>a-7- APC</td>
 <td>Szczur- IgG2b- APC</td>
 <td>Szczur- IgG2a- pecy7</td>
 <td>Szczur- IgG2a- FITC</td>
 <td>Szczur- IgG2b- FITC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>Iso- CD31 /CD45</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>Izo- Skal- pecy7</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9</td>
 <td>Izo- α-7-APC</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>Nanieś pipetą mieszaniny barwiące dla pojedynczych kolorów oraz kontroli izotopowych (zazwyczaj dostosowujemy stężenie przeciwciał tak, aby mieściło się w przedziale od 5 do 10 μL (odpowiednia objętość mieszaniny barwiącej do każdej próbki) do właściwej probówki Eppendorf z kroku 20. Dokładnie wymieszać i inkubować w lodzie przez 1 godzinę.</li></ol></li>
<li>Barw komórki z próbki myszy za pomocą 800μL koktajlu przeciwciał (poniżej) do sortowania komórek metodą FACS. Wymieszać dokładnie i inkubować w lodzie przez 1 godzinę. 
Koktajl przeciwciał: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC 
UWAGA: Optymalny stosunek przeciwciał do komórek należy określić poprzez indywidualne miareczkowanie każdego przeciwciała, ponieważ między partiami mogą występować znaczące różnice. Optymalna ilość użytego przeciwciała powinna być wyrażona w μgs przeciwciała na 106 komórki docelowe i pozostaje stała przy użyciu tej samej partii przeciwciała. Oczywiście, jeśli liczba komórek docelowych nie zmienia się znacząco między eksperymentami lub jeśli objętość barwiąca jest skalowana zgodnie z liczbą komórek, można również stosować stałe rozcieńczenie każdego przeciwciała.</li>
<li>Przemywanie: do każdej z 9 probówek kontrolnych dodać około 1 ml buforu FACS; do probówki z próbką dodać około 20 ml buforu FACS.</li>
<li>Odwiruj probówki Eppendorf przy 300 obr./min przez 5 minut (wirówka nakładkowa Eppendorf, model: 5417C). Odwiruj probówkę z próbką przy 160 obr./min przez 5 minut (wirówka nakładkowa Eppendorf, model: 5810R).</li>
<li>Odssać i usunąć nadsącz ze wszystkich probówek.</li>
<li>Resuspender komórki w buforze FACS (1 ml dla każdej z próbek kontrolnych, 4 ml dla próbki do sortowania). Przenieść komórki pipetą do „probówek FACS” przez nakrętkę z filtrem (BD Falcon nr kat. 35235, 40μm (wielkość porów), aby usunąć pozostałe aglomeraty, które mogłyby wpłynąć na pracę cytometru.</li>
<li>Skonfiguruj sorter FACS, używając kontroli dla pojedynczych barwników oraz kontroli izotypowych.</li>
<li>Należy zebrać posortowane komórki oddzielnie do 3,5 ml buforu zbierającego (95% DMEM, 5% FBS), zgodnie z poniższą tabelą. Zazwyczaj, przy pobieraniu materiału z obu kończyn tylnych, jedna mysz typu dzikiego pozwala na uzyskanie około 150 0 miogennych komórek progenitorowych lub 10 0 adipogennych komórek progenitorowych, przy przeżywalności powyżej 95%, co potwierdzono poprzez ponowną analizę posortowanych komórek metodą FACS na koniec procedury (Rysunek 1). 
Definicja progenitorów miogenicznych i adipogenicznych na podstawie barwienia powierzchniowego 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Przeciwciało/barwnik </td>
 <td>Progenitor miogenny (MP)</td>
 <td>progenitor adipogenny (AP)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hoechst</td>
 <td>+</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PI</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD31-FITC</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD45-FITC</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sca1-PECY7</td>
 <td>-</td>
 <td>+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>α-7 APC</td>
 <td>+</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
</ol>
4. Transplantacja:
<ol start="28">
<li>Odwiruj posortowane komórki przy 150rpm przez 5 minut, usuń supernatant i przenieś komórki do autoklawowanych probówek Eppendorf (1,5 mL), przepłucz komórki 50 μL sterylnego PBS (bez surowicy!), a następnie odwiruj przy 30rpm przez 5 minut. Zachowując sterylność wszystkich odczynników i pracując w dygestorze do hodowli tkanek, resuspenduj progenitory miogenne w PBS lub progenitory adipogenne w Matrigel (BD kat# 354234) w stężeniu około 106 komórek/mL.</li>
<li>Przeszczep progenitory miogenne lub adipogenne do myszy biorców.
<ol>
<li>Zanurz mysz w narkozie przy użyciu izofluranu zgodnie z procedurami Twojej instytucji.</li>
<li>Zgol sierść wokół miejsca wstrzyknięcia, a następnie zdezynfekuj skórę, przecierając ją 70% etanolem.</li>
<li>Wstrzyknij 20μL progenitorów miogennych lub adipogennych (= 20k komórek), używając strzykawki insulinowej 3/10 CC (BD kat# 309300).</li></ol></li>
<li>Po odpowiednim czasie (dobrze sprawdza się trzy tygodnie, ale włókna mięśniowe wykazujące transgeniczne markery pochodzące od dawcy są zazwyczaj widoczne w ciągu jednego tygodnia od przeszczepienia), z narkozuj myszy biorców z kroku 29 poprzezt dopaczasowe wstrzyknięcie 40 μL Avertin (Sigma Kat# T04840-2, 25 mg/mL), a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną najpierw 50mL PBS (zawierającego 10 μM EDTA), a następnie 15mL 4% PFA. Pobierz tkankę docelową, w razie potrzeby utrwal wtórnie w 4% PFA przez noc, a następnie przenieś do 20% sacharozy na noc. Zatop w OCT, zamroź i wykonaj kriosekcje.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Gdy MP zostaną przeszczepione do mięśni szkieletowych myszy, łatwo łączą się one z istniejącymi włóknami mięśniowymi. W związku z tym każda etykieta genetyczna obecna w komórkach dawcy będzie łatwo wykrywalna we włóknach, które je przyjęły. Rysunek 2 przedstawia przykład, w którym przeszczepione komórki wykazywały ekspresję ludzkiej fosfatazy zasadowej, ujawnionej histochemicznie.
 W przypadku przeszczepienia AP wynik jest w dużym stopniu zależny od środowiska miejsca transplantacji: po podaniu podskórnym komórki te różnicują się w adipocyty i myofibroblasty (patrz ryc. 2). W wielu innych miejscach, w tym w mięśniach, nie przeżywają one, chyba że uprzednio wywołano degenerację tłuszczową3.
 
 <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; FL8-A: APC vs FL6-A: PECγ; bramkowanie populacji komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rycina 1. Strategia sortowania w celu izolacji populacji progenitorowych z mięśnia szkieletowego. (A) Strategia sortowania: Żywe komórki zidentyfikowano na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) i rozproszenia światła pod kątem (side scatter). Barwienie Hoechstem zastosowano w celu wykluczenia bezzątkowych szczątków komórkowych, a barwienie jodkiem propidium (PI) w celu wykluczenia martwych komórek. Komórki krwiotwórcze (CD45) i śródbłonkowe (CD31) wykluczono z bram sortowania. α7+ Hoechst+ PI- CD45- CD31- Skalowanie- podzbiór zawiera wszystkie progenitorowe komórki miogenne (MP). Scal+ Hoechst+ PI- CD45- CD31- α7- populacja zawiera progenitory adipogenne (AP). (B) Kontrole izotypowe fluorescence-minus-one (FMO) potwierdzają swoistość barwienia. (C) Kontrola czystości subpopulacji MP i AP po sortowaniu.
 <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Przekroje histologiczne tkanek barwione w celu identyfikacji struktury komórkowej; wyniki eksperymentu mikroskopowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Reprezentatywne wyniki po transplantacji MP i AP. Przeszczepiono AP podskórnie (górny panel) oraz MP domięśniowo (dolny panel). W obu przypadkach komórki dawcy pochodziły z myszy wykazującej ekspresję transgenicznej ludzkiej fosfatazy alkalicznej, zidentyfikowanej za pomocą brunatnego barwienia.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Celem niniejszego protokołu jest osiągnięcie rozsądnego kompromisu pomiędzy wysoką wydajnością a wysoką żywotnością oczyszczonych komórek. Najbardziej krytycznym krokiem zapewniającym odzyskanie zdrowych komórek jest, jak można się spodziewać, enzymatyczna dysocjacja tkanki wyjściowej. Manipulacja tkanką powinna być szczególnie delikatna, co jest trudne do zademonstrowania lub docenienia nawet w formacie audiowizualnym. Kolejnym kluczowym czynnikiem jest czas trwania procedury. Im więcej czasu upłynie od pobrania materiału od zwierzęcia dawcy do transferu do zwierzęcia biorcy, tym niższa jest żywotność, a w konsekwencji wydajność engraftmentu. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości co do żywotności, których nie można natychmiast rozstrzygnąć na podstawie częstotliwości zdarzeń PI-dodatnich w próbkach oczyszczonych komórek po sortowaniu, sugerujemy przeprowadzenie testu rozcieńczeń ograniczających w celu pomiaru klonogenności3. Typowe sortowania z nieuszkodzonego mięśnia rutynowo dają około 1 na 15-20 komórek zdolnych do inicjowania kolonii miogennych lub fibro/adipogennych in vitro. Podczas gdy praktycznie 100% kolonii zainicjowanych z MP zawiera zróżnicowane miotuby, tylko około jednej trzeciej kolonii uzyskanych z FAP zawiera adypocyty oprócz myofibroblastów wykazujących dodatni wynik dla aktyny mięśni gładkich.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6885,</td><td>500 u/ml</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche Group</td><td>11088882001</td><td>1.5 u/ml</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Group</td><td>04942078001</td><td>2.4 u/ml</td></tr><tr><td>sitko do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Probówka z sitkiem do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>40 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>2-5 ug/ml</td></tr><tr><td>CD31-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0311-85</td><td>Klon 390</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Własne opracowanie</td><td></td><td>Klon I3/2</td></tr><tr><td>Sca1-PECY7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Klon D7</td></tr><tr><td>&amp;#945;-7 integryna APC</td><td>Własne opracowanie</td><td>Zapytaj laboratorium Rossi</td><td>R2F2</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Mięśnie szkieletowe zawierają wiele populacji progenitorów o odrębnym pochodzeniu embrionalnym i potencjale rozwojowym. Progenitory miogenne, zazwyczaj znajdujące się w „pozycji komórek satelitarnych” pomiędzy błoną plazmatyczną włókna mięśniowego a otaczającą je, bogatą w lamininę błoną podstawwną, są komórkami zdolnymi do samoodnawiania, które są ściśle przypisane do linii miogennej1,2. Opisaliśmy niedawno drugą klasę progenitorów związanych z naczyniami, które mogą generować myofibroblasty i białe adipocyty; reagują one na uszkodzenia poprzez efektywne przejście w stan proliferacji i zapewniają wsparcie troficzne komórkom miogennym podczas regeneracji tkanki3,4. Jednym z najbardziej wiarygodnych testów służących do określenia potencjału rozwojowego i regeneracyjnego danej populacji komórek jest ich izolacja i transplantacja5-7. W tym celu zoptymalizowaliśmy protokoły ich oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej z enzymatycznie rozdzielonych mięśni, które przedstawimy w niniejszym artykule. Populacje otrzymane tą metodą będą zawierać albo miogenne, albo fibro/adipogenne komórki tworzące kolonie: żadne inne typy komórek nie są zdolne do ekspansji in vitro lub przetrwania po podaniu in vivo. Należy jednak pamiętać, że gdy populacje te są wykorzystywane do analizy molekularnej (np. qRT-PCR) bezpośrednio po sortowaniu, świeżo posortowane podgrupy mogą zawierać inne komórki zanieczyszczające, które nie posiadają zdolności tworzenia kolonii ani przylegania do biorców.

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Mięśnie szkieletowe zawierają wiele populacji progenitorowych o odmiennym pochodzeniu embrionalnym i potencjale rozwojowym. Progenitory miogenne, zazwyczaj bytujące...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wyizolowanie żywotnych komórek progenitorowych miogennych i adypogennych z lustrzanych mięśni szkieletowych. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie tkanki mięśniowej od uśpionych myszy. W drugim kroku próbka jest trawiona enzymatycznie, co prowadzi do dysocjacji tkanki do pojedynczych komórek.Następnie zastosowano fluorescencyjne sortowanie komórek (fluorescence activated cell sorting, FACS) w celu wyizolowania komórek progenitorowych. Otrzymano wyniki wykazujące żywotność i różnicowanie wyizolowanych komórek po przeszczepieniu ich myszom biorcom, na podstawie barwienia histochemicznego markerem genetycznym, którym w tym przykładzie jest ludzka fosfataza zasadowa. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak prePL, jest możliwość izolowania komórek bezpośrednio z organizmu zwierzęcia w różnych punktach czasowych.Na przykład, po wywołaniu uszkodzenia tkanki, co oznacza brak selekcji populacji komórek, populację tę można analizować na poziomie molekularnym, aby zbadać poszczególne etapy, przez które przechodzą komórki w procesie regeneracji in vivo. Dzięki temu technika ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie z dziedziny regeneracji tkanek, a w szczególności: jaką rolę odgrywa każdy typ komórek podczas regeneracji in vivo i w jaki sposób typy komórek te oddziałują ze sobą, aby odbudować zdrową tkankę? Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię chorób takich jak dystrofia mięśniowa.Ponieważ badanie tych progenitorów może w przyszłości umożliwić opracowanie strategii regeneracyjnych w tego rodzaju chorobach. Ponadto zastosowanie tej techniki rozciąga się na szereg innych tkanek, od serca po tkankę tłuszczową, ponieważ progenitorzy fibro-adipogenne zostały znalezione w każdej z badanych przez nas do tej pory tkanek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, gdyż drastyczne metody dysocjacji obniżają żywotność komórek i generują zbyt wiele zanieczyszczeń, co w dalszej kolejności utrudnia czystą separację komórek.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy postanowiliśmy zastosować cytometrię przepływową, zazwyczaj wykorzystywaną dla komórek APOE, do badania komórek macierzystych w tkankach stałych. Wizualna prezentacja tej techniki jest istotna, ponieważ etapy dysocjacji tkanki są trudne do opanowania ze względu na trudności w ich prawidłowym opisaniu. Technikę tę zaprezentuje Linky, asystent badawczy w moim laboratorium, który jako pierwszy opracował i zoptymalizował tę metodę. Do przeprowadzenia tej procedury wymagane są co najmniej dwie myszy.Jedna mysz służy do pobrania komórek w celu zapewnienia niezbędnych kontroli pojedynczego koloru i izotypów przeciwciał, a druga dostarczy próbki do sortowania. Na początku należy pobrać myszy w wieku od siedmiu do 12 tygodni, które zostały wcześniej uśmiercone w sterylnej komorze laboratoryjnej. Uśmierconą mysz należy położyć na sterylnym ręczniku papierowym grzbietem do góry i dokładnie spryskać futro 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniom, trzymając w jednej ręce pęsetę, a w drugiej ostre nożyczki.Unieś skórę w okolicy brzucha i wykonaj niewielkie nacięcie wzdłużne. Chwyć skórę po obu stronach nacięcia i odsun ją, aby całkowicie odsłonić mięśnie kończyny tylnej. Następnie wycinij tkankę mięśniową, wsuwając zamknięte nożyczki pod mięsień, a nad kością piszczelową, a następnie je otwierając.Tylna krawędź ostrzy delikatnie wymusi oddzielenie mięśnia od piszczeli. Powtórz tę czynność dla obu stron piszczeli i umieść tkankę w 60 milimetrowej czaszce Petriego. Następnie w ten sam sposób wycinij tkankę mięśniową z kości udowej i dodaj ją do czaszki Petriego.Powtórz tę czynność dla każdej myszy, używając jednej płytki Petriego na mysz. Następnie rozdrabniaj tkankę do pojedynczych komórek. Do każdej płytki Petriego z tkanką mięśniową dodaj 2 mL lub 1000 jednostek kolagenazy oraz 20 µL 250 mM roztworu zapasowego chlorku wapnia.Następnie, pracując szybko i starannie, należy użyć dwóch szarych pincet — jednej ząbkowanej i jednej dwuzębnej — aby rozdrzeć tkankę na kawałki o rozmiarach jednego milimetra sześciennego. Należy usunąć i odrzucić jak największą ilość tkanki niebędącej mięśniem.Przykryć płytki Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji wyjąć płytki i przenieść je z powrotem do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Wyjąć tłok z trzymililitrowej strzykawki i użyć go do rozcierania tkanki.Używaj jednego tłoka na płytkę, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Do każdej szalki Petriego dodaj około pięciu mililitrów zimnego, sterylnego PBS, a następnie przenieś zawartość szalki do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz dodatkowymi pięcioma mililitrami PBS, aby odzyskać całą tkankę, i dodaj ją do probówki stożkowej.Próbki należy przemyć i odwirować trzykrotnie zgodnie z protokołem. Następnie do każdej probówki należy dodać jeden mililitr roztworu składającego się z kolagenazy D dys space dwa oraz chlorku wapnia i inkubować w temperaturze 37 °C w rotacji przez jedną godzinę. Po inkubacji do probówek należy dodać pięć mililitrów zimnego, jałowego PBS, krótko wymieszać próbki na wortexie i kilkakrotnie potryturować w celu rozbicia aglomeratów.Napełnić probówki roztworem PBS, dobrze wymieszać i umieścić na lodzie. Aby usunąć pozostałe duże fragmenty tkanki, umieścić sitko komórkowe 40 µm na probówce stożkowej 50 ml na lodzie i przefiltrować zawiesinę komórkową. Przelew podzielić równomiernie do trzech probówek stożkowych 50 ml wypełnionych zimnym, sterylnym PBS i wirować przy 1600 RPM przez pięć minut w temperaturze 8 °C. Po wirowaniu ostrożnie usunąć nadsad i umieścić komórki na lodzie w celu barwienia oraz sortowania progenitorowych komórek miogennych i adipogennych.W pierwszej kolejności należy przygotować sześć mieszanin kontrolnych do barwienia pojedynczego kolorem zgodnie z dołączonym protokołem pisemnym. Kontrole te obejmują: brak barwienia, barwienie hulk, jodek propidyny, przeciwciała znakowane FSE przeciwko CD 31 i CD 45, przeciwciało znakowane SC one P size seven oraz przeciwciało znakowane alpha seven A PC. Następnie należy przygotować trzy mieszaniny do barwienia kontrolą izotypową przeciwciał zgodnie z protokołem pisemnym.Po przygotowaniu mieszanin barwiących, należy opisać dziewięć probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml dla próbek z pojedynczym barwnikiem oraz próbek kontroli izotypowej. Należy resuspendować i połączyć komórki z trzech probótek stożkowych do całkowitej objętości 1 ml buforu FACS. Następnie do każdej opisanej probówki kontrolnej Eppendorf należy odpipetować 100 µL zawiesiny komórek, a następnie dodać od 5 do 10 µL odpowiedniej mieszaniny barwiącej, w zależności od stężenia przeciwciał.Resuspenduj komórki z próbki mysiej w 200 µL buforu FACS i przelej do jednej z probówek stożkowych o pojemności 50 mL. Następnie dodaj 800 µL koktajlu przeciwciał. Wymieszaj każdą z probówek kontrolnych i próbkowych.Następnie inkubujemy je na lodzie przez jedną godzinę. Po inkubacji należy wypłukać komórki, dodając 1 ml buforu FACS do każdej z dziewięciu probówek kontrolnych oraz około 20 ml buforu FACS do probówki z próbką. Wirować probówki kontrolne przy 3000 RPM przez pięć minut.Wirować probówkę stożkową z próbką przy 1600 RPM przez pięć minut. Następnie po wirowaniu odessać i usunąć nadosad. Resuspendować komórki kontrolne w każdej probówce z końcówką z jedną mililitrem buforu fax, a komórki z próbki w czterech mililitrach buforu fax.Dodaj jodek propidyny do komórek w próbkach i kontroli izotypowej, a także do probówki z kontrolą jednego koloru PI. Przenieś komórki pipetą do probówek do cytometrii przepływowej przez nakrętkę z filtrem w celu usunięcia pozostałych skupisk, które mogłyby wpłynąć na pracę cytometru.Przygotuj urządzenie do cytometrii przepływowej z jednym barwnikiem oraz kontrolami izotypowymi. Posortuj komórki z próbki zgodnie z załączonym protokołem pisemnym i zbierz każdą populację oddzielnie do probówki kolekcjonowej o pojemności 3,5 ml. Żywe progenitory mięśniowe to populacja, która jest hulked oraz alpha seven a PC pozytywna i PI CD 31 FE CD 45 FE i ska.Adipogenne komórki progenitorowe są CD105+ (rozmiar siedem), negatywne pod kątem żywotności, podczas gdy inne są CD105+ (rozmiar siedem) oraz negatywne pod kątem PE-CD31, FE-CD45 i alpha-7-APC. Pojedyncza mysz typu dzikiego może dostarczyć około 1 × 10⁵ adipogennych komórek progenitorowych oraz od 1,5 do 2 × 10⁵ miogennych komórek progenitorowych o żywotności powyżej 95%.Aby przygotować komórki do transplantacji do myszy biorców, należy je przemyć. Najpierw odwiruj komórki przy 1500 RPM przez pięć minut. Usuń nadsącz, resuspenduj komórki w 500 µL PBS i przenieś je do probówek typu einor.Wiruj probówki przy 3000 RPM przez pięć minut i usuń nadsącz. Następnie resuspenduj progenitorów mięśniowych w PBS lub progenitorów adipogennych w matrigelu w stężeniu około 10⁶ komórek na mililitr. Po przygotowaniu znieczulonych myszy biorców dla każdego typu komórek dawczych, zgodnie z pisemnym protokołem, użyj strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 cm³, aby wstrzyknąć 20 µL zawierających około 20 000 komórek progenitorów mięśniowych lub adipogennych.Należy odczekać odpowiedni czas na zróżnicowanie się przeszczepionych komórek, zazwyczaj około trzech tygodni. Następnie izoluje się docelową tkankę i przygotowuje ją do kriosekcjonowania zgodnie z opisem w protokole przedstawionym na tej figurze. Zaprezentowano strategię sortowania w celu izolacji progenitorów adipogennych i miogennych. Żywe komórki zidentyfikowano na podstawie rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w bok (side scatter). Barwienie Hoechst zastosowano w celu wykluczenia debris jądrowych, a barwienie jodeczkiem propidyny (PI) w celu wykluczenia martwych komórek. Następnie z bram sortowania wykluczono odpowiednio komórki hematopoetyczne i śródbłonkowe, czyli komórki CD 45 i CD 31. Na koniec wyizolowano subpopulację wykazującą dodatni wynik dla alfa siedem.Frakcja SKA1-ujemna zawiera wszystkie progenitory miogenne oraz populację $\alpha$7-ujemną. Frakcja SKA1-dodatnia zawiera wszystkie progenitory adipogenne; kontrole izotypowe fluorescencji minus jeden potwierdzają swoistość barwienia. Ponadto przeprowadzono kontrole czystości podzbiorów adipogennych i miogennych.Po sortowaniu w tym reprezentatywnym przykładzie, adipogenne komórki progenitorowe dawcy wykazujące ekspresję transgenicznej ludzkiej fosfatazy alkalicznej, wstrzyknięte podskórnie, mogą zostać zidentyfikowane w tkance gospodarza za pomocą histochemii, co objawia się brązowym barwieniem. Miogenne komórki progenitorowe dawcy wykazujące ekspresję transgenicznej ludzkiej fosfatazy alkalicznej, wstrzyknięte domięśniowo, zostały zidentyfikowane w tym przekroju tkankowym, co zaznaczono kolorem brązowym.Zastosowanie histochemii. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. W przypadku przetwarzania większej liczby próbek czas ten ulegnie wydłużeniu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko i delikatnie.Dlatego należy unikać przetwarzania zbyt wielu próbek jednocześnie. Przedłużenie czasu przetwarzania znacznie zmniejszy zmienność komórek po przeprowadzeniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób reakcji tych komórek progenitorowych na uszkodzenia in vivo po ich rozwoju, można również zastosować inne metody, takie jak analiza ekspresji colono SC OG za pomocą ilościowego R-T-P-C-R.Technika ta utorowała drogę innym badaczom w dziedzinie regeneracji tkanek do zbadania interakcji między komórkami progenitorowymi w uszkodzonej tkance. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić dysocjację tych tkanek bez powodowania uszkodzeń. Komórki progenitorowe są identyfikowane na podstawie ich markerów powierzchniowych, a następnie analizowany jest ich potencjał rozwojowy in vivo.Dziękujemy za obejrzenie. Powodzenia w eksperymencie.

purification-of-progenitors-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie przodków z mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i...

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje solidną, powtarzalną i prostą metodę izolacji i hodowli komórek progenitorowych mioblastów z mięśni szkieletowych osób dorosłych i starszych. Wykorzystywane tutaj mięśnie obejmują mięśnie stóp i nóg. Takie podejście umożliwia wyizolowanie wzbogaconej populacji pierwotnych mioblastów do badań funkcjonalnych.

Przygotowanie i hodowla miogennych komórek prekursorowych/pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i starszych ludzi

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Prezentujemy techniki izolacji, hodowli, charakterystyki i różnicowania ludzkich pierwotnych komórek progenitorowych mięśni (hMPC) uzyskanych z tkanki biopsji mięśni szkieletowych.  hMPC uzyskane i scharakteryzowane za pomocą tych metod mogą być wykorzystane do późniejszego rozwiązywania problemów badawczych związanych z ludzką miogenezą i regeneracją mięśni szkieletowych.

Izolacja, hodowla, charakterystyka i różnicowanie ludzkich komórek progenitorowych mięśni na podstawie procedury biopsji mięśni szkieletowych

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj metodę izolacji żywych progenitorów miogenicznych i adipogenicznych z mięśni szkieletowych myszy przy użyciu enzymatycznej dygestii i cytometrii przepływowej. Technika umożliwia badanie regeneracji tkanek in vivo.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów