Name: Nagrania całych komórek z mózgu dorosłej Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj technikę całokomórkowych nagrań z neuronów dorosłej Drosophila. Film przedstawia izolację mózgu, przygotowanie roztworu do preparacji oraz wizualizację komórek GFP podczas rejestracji aktywności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant NIH NS27501 przyznany DKOD. Dodatkowe wsparcie dla tej pracy zapewnił grant z programu HHMI Professor Program przyznany DKOD.

I. Disekcja mózgów dorosłych much
<ol>
<li>Nanieś małą kroplę (~100 µl) roztworu do sekcji na środek szalki Petriego o średnicy 35 mm.</li>
<li>Schwytaj dorosłą samicę za pomocą aspiratora. Pod mikroskopem sekcyjnym użyj dwóch igieł strzykawkowych, aby odciąć głowę muchy.</li>
<li>Umieść głowę w małej kropli soli fizjologicznej do sekcji (z dodatkiem papainy) na szalce Petriego.</li>
<li>Ustaw głowę tak, aby trąba była skierowana w stronę dna szalki.</li>
<li>Przytrzymaj kutykulę pokrywającą lewe oko złożone za pomocą igły 1. Wykonaj igłą 2 cięcie ukośne, prowadzące od powierzchni grzbietowej do brzusznej, bezpośrednio przyśrodkowo od igły 1.</li>
<li>Przytrzymaj części gębowe igłą 1 i użyj igły 2, aby wykonać cięcie poziome rozciągające się od brzusznej powierzchni lewego oka do prawego oka, na poziomie podstawy trąby.</li>
<li>Przytrzymaj kutykulę pokrywającą prawe oko złożone za pomocą igły 1. Wykonaj igłą 2 cięcie ukośne, prowadzące od powierzchni grzbietowej do brzusznej, bezpośrednio przyśrodkowo od igły 1.</li>
<li>Obróć głowę tak, aby strona rostralna spoczywała na powierzchni szalki Petriego. Wsuń igłę 1 między kutykulę rostralną a mózg, a następnie użyj igły 2, aby podążyć tą samą ścieżką co pierwsza igła. W idealnym przypadku kapsuła zostanie oddzielona od mózgu wraz z przymocowanymi oboma płatami opticznymi, ponieważ są one istotne dla stabilizacji mózgu podczas rejestracji.</li>
<li>Tchawki, worki powietrzne i inne tkanki łączności należy ostrożnie usunąć za pomocą dwóch pęset z cienkimi końcówkami.</li>
<li>Cała sekcja powinna zająć od 3 do 10 minut.</li>
</ol>
II. Montaż OUN
<ol>
<li>Mózg przenosi się do komory rejestracyjnej za pomocą pipety z żółtą końcówką.</li>
<li>W komorze rejestracyjnej mózg stabilizuje się poprzez umieszczenie platynowej ramki w taki sposób, aby dwa cienkie nitowanie stykały się z tkanką na styku płatów optycznych i centralnego regionu mózgu.</li>
<li>Każdy mózg pozostawia się w komorze rejestracyjnej przy ciągłej perfuzji natlenionym roztworem soli fizjologicznej (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 10 minut. Perfuzję komory natlenionym roztworem soli fizjologicznej kontynuuje się przez cały okres rejestracji. Preparat wizualizuje się przy użyciu mikroskopu pionowego (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Niemcy) z nieruchomym stolikiem, obiektywem imersyjnym wodnym 40x (Achroplan; apertura numeryczna 0,8; Zeiss) oraz optyką Nomarskiego. GFP obrazowano przy użyciu filtra fluorescencyjnego BP 505-530.</li>
</ol>
III. Elektrofizjologia
<ol>
<li>Do rejestracji z całej komórki (whole-cell) stosuje się pipety o oporności 8-14 Mohms</li>
<li>Rejestrację w trybie clamp prądowy (current-clamp) oraz clamp napięciowy (voltage-clamp) przeprowadza się przy użyciu wzmacniacza List EPC7 lub Axopatch 200B, przetwornika cyfrowo-analogowego Digidata 1322A (Molecular Devices, Foster City, CA), komputera Dell Dimension 8200 (Dell Computer, Round Rock, TX) oraz oprogramowania pClamp 9 (Molecular Devices).</li>
</ol>

<ol><li>Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+synaptic+transmission+in+Adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ.</a> Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
</ol>

Przedstawiona w tym filmie metoda preparowania izolowanego całego mózgu umożliwia ocenę mechanizmów komórkowych leżących u podstaw pobudliwości i przekaźnictwa synaptycznego w zidentyfikowanych neuronach, w tym w neuronach szlaków przetwarzania węchowego, w mózgu dorosłej muchy Drosophila (Gu and O Dowd, 2006). Podejście to uzupełnia badania aktywności neuronalnej w mózgu nienaruszonej dorosłej muchy Drosophila (Wilson et all 2004), w podobny sposób, w jaki rejestracje z neuronów w skrawku mózgu ssaka uzupełniają rejestr...

<table><tbody><tr><td>#5 Pincety</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr 11251-10</td><td>Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić cienkich końcówek pęsety.</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Odczynnik</td><td>Worthington Biochemical</td><td>3126</td><td>20 U/ml aktywowane przez 1 mM L-cysteiny</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Model SMZ-2B:C-PS</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Wyposażone w światłowodowe oświetlenie z gęsimi szyjami ustawionymi pod niskim kątem</td></tr><tr><td>Igła &amp;Strzykawka </td><td></td><td>PrecisionGlide&amp;#174;?, Becton Dickinson Co</td><td>305175 &amp;amp; 309602</td><td>Tanie i trwałe</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Wyposażony w nieruchomy stolik, obiektyw imersyjny wodny 40X, optykę Nomarskiego oraz lampę fluorescencyjną</td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp</td><td>200 B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik cyfrowo-analogowy Digidata </td><td>1322A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy drosophila

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

W niniejszym filmie prezentujemy procedurę izolacji całych mózgów z dorosłych osobników Drosophila w celu przygotowania do rejestracji z pojedynczych neuronów. Rozpoczynamy od opisu roztworu do sekcji oraz sposobu odłowu dorosłych samic wykorzystywanych w naszych badaniach. Przedstawiono procedurę nienaruszonego usuwania całego mózgu, obejmującą oba płaty optyczne. Pokazano również sekcję nadległych tchawek. Izolowany mózg jest nie tylko mały, ale wymaga na tym etapie szczególnej ostrożności w obchodzeniu się z nim, aby zapobiec uszkodzeniu neuronów, z których wiele znajduje się blisko zewnętrznej powierzchni tkanki. Pokazujemy, w jaki sposób opracowany przez nas specjalny uchwyt jest wykorzystywany do stabilizacji mózgu w komorze rejestracyjnej. Do rejestracji z pojedynczych neuronów lub par neuronów wykorzystuje się standardowy zestaw do elektrofizjologii. Obraz fluorescencyjny linii GAL4 wykazującej ekspresję GFP (GH146), widziany przez mikroskop rejestracyjny, ilustruje sposób identyfikacji neuronów projekcyjnych (PN) w żywym mózgu. Obraz Nomarski przy dużym powiększeniu przedstawia pojedynczy neuron, który jest celem rejestracji typu whole-cell. Gdy mózg zostanie pomyślnie usunięty bez uszkodzeń, większość neuronów wykazuje aktywność spontaniczną, generując potencjały czynnościowe i/lub przejawiając spontaniczne wejścia synaptyczne. Ta preparatyka in situ, w której rejestracja whole-cell z zidentyfikowanych neuronów w całym mózgu może być łączona z manipulacjami genetycznymi i farmakologicznymi, stanowi użyteczny model do badania fizjologii komórkowej i plastyczności w dorosłym OUN.

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę izolacji całych mózgów dorosłych muszek Drosophila w celu przygotowania do rejestracji z pojedynczych neuronów przy użyciu standardowej techniki whole-cell. Materiał zawiera obrazy komórek i neuronów znakowanych GFP, zarejestrowane podczas pomiarów.

Rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy Drosophila

W niniejszym filmie prezentujemy procedurę izolacji całych mózgów dorosłych osobników Drosophila w celu przygotowania do rejestracji aktywności pojedynczych neuronów. Zaczynamy od...

Nazywam się, jestem specjalistą asystentem w Katedrze Anatomii i Neurobiologii na uc R one. Dzisiaj wyjaśnię Państwu procedurę wykonywania rejestracji całokomórkowej w mózgu PHA; kluczowe etapy tego przygotowania obejmują sposób zdekapitacji głowy, usunięcia mózgu, a także usunięcia układu TRICARE i tkanki G clear z powierzchni mózgu. Dzisiaj zaprezentuję, jak przygotować roztwór do sekcji do rejestracji całokomórkowej w mózgu dorosłego szczura laboratoryjnego.Pierwszym krokiem jest przygotowanie drugiego roztworu, który jest niezwykle istotny i stanowi klucz do prawidłowego przygotowania tkanki dorosłego mózgu. Najpierw odmierzę 5 mL roztworu roboczego do tej probówki typu centrifuge. Następnie użyję kolejnej małej probówki.Do tej probówki dodam 1 ml przygotowanego roztworu, zamieszam go, aby uzyskać jednorodny roztwór. Będę pipetować go w górę i w dół, aby dobrze wymieszać roztwór. Następnie pobiorę 100 jednostek pepsyny z tej butelki.Następnie przelewam ten pepane do probówki typu Centrifuge. Jak widać, roztwór jest mętny, więc dodaję kolejne 100 µL cy, a następnie dokładnie mieszam. Po 10 minutach roztwór stanie się klarowny, a wszystkie kryształy znikną.W ten sposób roztwór bę

whole-cell-recordings-from-brain-of-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestrowanie całych komórek z mózgu dorosłych owocówek

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować mózg dorosłego Drosophila - procedura niezbędna do wizualizacji narządu, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez naskórek, oko i tkankę tchawicy. Przykładowy protokół przedstawia szczegółową demonstrację dającą wysokiej jakości preparaty, które można stosować do barwienia immunologicznego i metod obrazowania w neurobiologii Drosophila.

Drosophila Sekcja mózgu osoby dorosłej: metoda w neurobiologii much

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.

Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Poznaj technikę całokomórkowych nagrań z neuronów dorosłej Drosophila. Film przedstawia izolację mózgu, przygotowanie roztworu do preparacji oraz wizualizację komórek GFP podczas rejestracji aktywności neuronalnej.

Rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy Drosophila

Przeglądaj więcej filmów