Name: Opracowywanie niestandardowych testów białek komórek jajnika i gospodarza chomika chińskiego przy użyciu technologii mikrocząstek membrany akustycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj rozwój niestandardowych immunoassayów na platformie ViBE dla białek komórek jajnika chomika chińskiego. Ta metoda zapewnia wrażliwe i powtarzalne wyniki przy minimalnym czasie obsługi ręcznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie mikrocząsteczek
<ol>
	<li>Znakowanie przeciwciał z wykorzystaniem chemii biotyny NHS</li>
	<li>Oznaczenie stopnia biotinylacji</li>
	<li>Koniugacja kulek z streptawidyną z przeciwciałem biotinylowanym
 <ol>
		<li>Resuspender kulki w oryginalnej fiolce poprzez mieszanie na wirówce (vortexowaniu) przez 1-2 minuty</li>
		<li>Odmiarzyć pożądaną objętość kulek do probówki do mikrocentryfugi</li>
		<li>Przemyć kulki 3 razy buforem PBST:
			<ol>
				<li>Umieścić probówkę z kulkami na magnesie na 2 minuty</li>
				<li>Usunąć nadsącz poprzez aspirację, trzymając probówkę na magnesie. Należy uważać, aby nie zakłócić osadu kulek</li>
				<li>Zdjąć probówkę z magnesu i dodać 1 mL PBST</li>
				<li>Mieszać na wirówce przez 20 sekund w celu resuspensji kulek</li>
				<li>Wirować przez 5 sekund, aby usunąć kulki z nakrętki</li>
				<li>Powtórzyć etapy 2.3.1-2.3.5 jeszcze dwukrotnie</li>
			</ol>
		</li>
 <li>Po trzecim przemyciu umieścić probówkę na magnesie i odessać PBST</li>
		<li>Dodać przeciwciało biotinylowane do kulek i resuspender</li>
		<li>W razie potrzeby uzupełnić objętość przeciwciała biotinylowanego do 300 μL za pomocą PBS. Jeśli objętość przeciwciała jest już większa niż 300 μL, nie dodawać PBS</li>
		<li>Inkubować zawiesinę kulek z przeciwciałami przez 30 minut w RT na mieszalce wibracyjnej lub rotatorze do probówek</li>
		<li>Przemyć 3 razy PBST zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 3</li>
		<li>Zablokować kulki za pomocą biotinylowanego BSA
	<ol>
		<li>Po trzecim przemyciu dodać 10 μg/mg biotinylowanego BSA, w razie potrzeby dostosować objętość do 300 μL za pomocą PBS i inkubować z mieszaniem przez 30 minut</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć 3 razy PBST zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 3</li>
	<li>Resuspender kulki w 100 μL PBS/0,05% BSA. Do długoterminowego przechowywania można dodać azydek sodu</li>
</ol>
</li>
	<li>Zgodnie ze standardowymi protokołami NHS dla fluoresceiny, przeprowadzić fluoresceinowanie przeciwciała detekcyjnego</li>
	<li>Oznaczyć stopień fluoresceinowania</li>
</ol>
2. HCP – Rozwój
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów roboczych:
	<ol>
		<li>Przeciwciało znakowane fluoresceiną (Fl-Ab): Większość testów CHO-HCP wykorzystuje Fl-Ab w końcowym stężeniu 400 ng/mL. Fl-Ab dodaje się w ilości stanowiącej ¼ końcowej objętości testu, zatem stężenie roztworu roboczego wynosi 1,6 μg/mL. Roztwór ten należy przygotować poprzez rozcieńczenie zapasu FlAb za pomocą BioScale Bead/FlAb Diluent. </li>
		<li>Kuleczki: Większość testów CHO-HCP wykorzystuje kuleczki w końcowym stężeniu 2x105 beads/mL. Odczynnik z kuleczkami stanowi ¼ końcowej objętości testu; zatem stężenie roztworu roboczego wynosi 8x105 beads/mL. Roztwór ten należy przygotować poprzez rozcieńczenie zapasu kuleczek za pomocą BioScale Bead/FlAb Diluent. Przed pobraniem aliquotu należy dokładnie wymieszać zapas kuleczek w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że wszystkie kuleczki znajdują się w zawiesinie. </li>
		<li>Bufor roboczy: Skład buforu roboczego może wymagać optymalizacji pod kątem przeciwciał użytych do opracowania testu, jednak kilka testów CHO-HCP opracowano z użyciem buforu 10 mM HEPES, 1% Tween, pH 7,5. Firma BioScale opracowała dodatek do buforu roboczego (dostarczany w zestawie do opracowania), który dodaje się do buforu do stężenia 1% przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć kalibratory i próbki za pomocą BioScale Sample Diluent. </li>
</ol>
3. Konfiguracja systemu ViBE
<ol>
	<li>Włącz stację roboczą ViBE </li>
	<li>Podłącz zasilanie systemu i odpływ odpadów </li>
	<li>Przepłucz system (priming) </li>
	<li>Włóż kartridż ViBE </li>
	<li>Poprowadź rurki </li>
	<li>Przygotuj szablon analizy, wypełniając arkusz zatytułowany „Sample Setup”. System BioScale umożliwia stworzenie osobnego szablonu analizy dla każdego badania na stacji roboczej ViBE. Pozwala to użytkownikowi na edytowanie i zapisywanie szczegółowych uwag w arkuszu „Notes” szablonu dla różnych analiz, co zapewnia prowadzenie pełnej dokumentacji eksperymentu. </li>
	<li>Wstępna konfiguracja szablonu analizy: Rozpocznij od wypełnienia tabeli (lewy górny róg) zakresu stężeń standardów w analizie w arkuszu „Sample Setup”. </li>
	<li>Następnie wprowadź dodatkowe informacje w tabeli po prawej stronie standardów (konfiguracje Simple Column Read Setup, One Reagent Add oraz Two Reagent Add), aby poinstruować stację roboczą ViBE, jak długo próbki muszą być inkubowane, jaka objętość odczynnika ma zostać przeniesiona, jak długi musi być czas akumulacji próbki oraz czy konieczne jest kondycjonowanie czujnika i dekontaminacja sond oraz kartridża itp. </li>
	<li>Wypełnij układ płytki (plate layout). </li>
	<li>Napełnij płytki próbkami/odczynnikami. System ViBE poda wymagane objętości dla płytki z odczynnikami. Objętość próbki może być zmienna, ale dobrym punktem wyjścia jest połowa całkowitej objętości analizy wynoszącej 120 μL. </li>
	<li>Nałóż pokrywy na płytki. Załaduj płytki na pokład stacji roboczej.</li>
	<li>Uruchom kreator startowy analizy, przejdź przez kroki kreatora i rozpocznij analizę.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="Schemat czujnika przeciwciał; detekcja białka z wykorzystaniem biotynilowanego wychwytu i magnetycznych mikrocząsteczek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Kanapkowy immunotest AMMP
Na stacji roboczej ViBE test AMMP służy do pomiaru stężenia antygenu. Sygnał jest mierzony, gdy przeciwciało typu kuleczka-antygen-hapten wiąże się z sensorem poprzez oddziaływanie hapten/antyhapten. Regeneracja przywraca sensor do stanu początkowego poprzez usunięcie kompleksów immunologicznych.
<img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="Wykres krzywej kalibracyjnej CHO-HCP; stężenie względem sygnału; analiza ilościowa białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Krzywa kalibracyjna testu AMMP dla CHO-HCP
Rysunek 2 powyżej przedstawia przykład krzywej kalibracyjnej testu CHO HCP AMMP. Analizę można przeprowadzić w próbkach z całego procesu oczyszczania, w tym z reaktora, z wysoką precyzją i powtarzalnością.
<img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="Krzywa kalibracyjna białka, wykres sygnału w funkcji stężenia, dane do analizy ilościowej białka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3: Krzywa kalibracyjna testu AMMP dla białka A
Rysunek 3 przedstawia krzywą kalibracyjną dla testu Residual Protein A AMMP, wykonanego przy użyciu zestawu VIBE Residual Protein A Assay Kit. Ten sam zestaw może być wykorzystany do szybszego testu z 30-minutowym okresem inkubacji lub w celu uzyskania bardziej czułych wyników i szerszego zakresu dynamicznego przy dłuższym okresie inkubacji, bez utraty precyzji lub dokładności, które w obu przypadkach są zazwyczaj lepsze niż w przypadku równoważnych testów ELISA wykonywanych przez użytkowników
<img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="Wykres krzywej kalibracyjnej IgG, dopasowanie modelu 5PL, próbki w buforze, analiza danych dla szybkości przeżywalności komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4: Analiza AMMP miana produktu
Stacja robocza ViBE może być również wykorzystywana do oznaczania miana produktu, którego wyniki przedstawiono na rysunku 4. W przeciwieństwie do innych testów AMMP, procedura ta nie wymaga wstępnego przygotowania próbek poza zwykłym rozcieńczeniem ani stosowania kulek, a dokładność oznaczania ilościowego została zweryfikowana w próbkach „bez wirowania” zawierających ponad 10 milionów komórek w szerokim zakresie żywotności.
<img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="Krzywe analizy biomarkerów; po lewej: sygnał Alphascreen, po prawej: RU AMMP względem logarytmu stężenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5: Krzywa standardowa testu AMMP dla analizy biomarkera GST-Gadd34
Na rysunku 5 przedstawiono krzywą wzorcową sygnału uzyskanego za pomocą urządzenia ViBE BioAnalyzer (Panel A) lub technologii AlphaScreen z wykorzystaniem rekombinowanego białka GST-Gadd34. Wyniki na platformie ViBE były około logarytmicznie bardziej czułe przy zastosowaniu tych samych przeciwciał. AMMP wykorzystuje pomiar mniejszej liczby większych cząsteczek, a mimo to korzysta z przechwytywania w fazie ciekłej i tworzenia kompleksów detekcyjnych.
<img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="Wykres porównujący sygnały GADD34 i Alphascreen w funkcji stężenia białka w lizacie ksenoprzeszczepu guza; wyniki dla nośnika i leku." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> Rycina 6: Krzywa wzorcowa testu AMMP dla GST-Gadd34 w próbce guza
Na rysunku 6 przebadano indukcję Gadd34 w ksenograftach CWR22 w obecności lub w braku boronowego inhibitora proteasomu, analizując wyniki za pomocą ViBE BioAnalyzer (Panel A) lub AlphaScreen (Panel B). Platforma ViBE była w stanie dostarczyć czułe i powtarzalne wyniki w ksenograftach nowotworowych in vivo, podczas gdy sygnał AlphaScreen ulegał wygaszeniu wraz ze wzrostem liczby μg białka.
Niniejszy przykład demonstruje możliwości technologii AMMP w przypadku próbek o wysokim stopniu złożoności. Dzięki czułemu chipowi detekcyjnemu oraz wysokiej wydajności magnesu umieszczonego w pobliżu chipów, niewielka liczba magnetycznych mikrocząsteczek może efektywnie i powtarzalnie wyłapywać rzadkie cele z otoczenia złożonego z lizowanych komórek (w tym odczynników do lizy) oraz zanieczyszczeń krwi.

Autorzy niniejszego artykułu są zatrudnieni w firmie Bioscale, Inc, która produkuje niektóre z instrumentów i odczynników wykorzystanych w tym artykule.

Powyższe przykłady demonstrują wysoką czułość wyników ilościowych metody AMMP w złożonych próbkach. Taka wydajność, zapewniona dzięki łatwości i kontroli nad wprowadzaniem odczynników do systemu, umożliwia szeroki wachlarz zastosowań. Mogą one być specyficzne dla konkretnego celu, jak w przypadku Gadd34 w guzie, lub ogólne dla całego spektrum celów, jak przy wykrywaniu i ilościowym oznaczaniu białek komórek gospodarza w próbkach pobieranych z różnych etapów procesu oczyszczania. Platforma ViBE o niskich kosztach eksploatacji w połączeniu z niezwykle elastyczną metodą AMMP stanowi potężne narzędzie do przeprowadzania kluczowych analiz.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do znakowania NHS-Chromogenic-biotin lub NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>W przypadku zakupu NHS-Chromogenic-biotin jako odczynnika wymagane będą następujące dodatkowe materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalny z wodą rozpuszczalnik organiczny, taki jak dimetylosulfotlenek (DMSO) lub dimetylformamid (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan bufor solny (PBS) lub inny bufor wolny od amin (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do odsalania lub jednostki do dializy w celu wymiany buforu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr umożliwiający pomiar przy 354 i 280 nm &amp;#8211; do pomiaru stężeń białka i biotyny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało biotynilowane (2-5 biotyn/Ab)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki streptawidynowe</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>(10 mg/mL) ~10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; kulek/mg</td></tr><tr><td>Magnes do probówek mikrocentryfużkowych</td><td>New England Biolabs</td><td>kat. nr S1510S</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowana BSA do blokowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan bufor solny (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 0.1% Tween 20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikrocentryfużkowy do Vortexu lub rotator do probówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało lub białko do znakowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania NHS-Fluorescein lub NHS-Fluorescein Labeling kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>W przypadku zakupu NHS-Fluorescein jako odczynnika wymagane będą następujące dodatkowe materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalny z wodą rozpuszczalnik organiczny, taki jak dimetylosulfotlenek (DMSO) lub dimetylformamid (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM boran, pH 8.5 lub inny bufor wolny od amin (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do odsalania lub jednostki do dializy w celu wymiany buforu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomiar stężeń białka i fluoresceiny wymaga spektrofotometru umożliwiającego pomiar przy 493 i 280 nm.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>do rozcieńczania kulek i FlAb</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik próbek</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>do rozcieńczania próbek i kalibratorów</td></tr><tr><td>Dodatek do buforu roboczego</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowywanie spersonalizowanych testów białek komórek gospodarza z linii chinese hamster ovary z wykorzystaniem technologii akustycznej mikrocząsteczkowej membrany

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Dostosowane testy dla unikalnych białek są często ograniczone do czasochłonnych, ręcznych technik detekcji i kwantyfikacji, takich jak ELISA lub Western blot, ze względu na złożoność opracowywania ich na alternatywnych platformach. Własna technologia Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) firmy BioScale pozwala na łatwe opracowanie testów immunoenzymatycznych typu kanapka (sandwich immunoassays) do zastosowania na platformie ViBE, zapewniając lepszą czułość, powtarzalność oraz zautomatyzowany przebieg pracy. Jako przykład, niniejszy protokół opisuje procedurę opracowywania dostosowanego testu na białka komórek gospodarza jajnika chińskiego chomika (CHO-HCP). Opisane tutaj ogólne zasady mogą być stosowane przy opracowywaniu szerokiej gamy testów immunoenzymatycznych.
Test AMMP mierzy stężenie antygenu poprzez pomiar zmian częstotliwości oscylacji wywołanych wiązaniem mikrocząsteczek z powierzchnią czujnika. Składa się on z czterech głównych komponentów: (1) kartridża zawierającego funkcjonalizowany chip z ośmioma czujnikami, (2) magnetycznych mikrocząsteczek znakowanych przeciwciałami, (3) przeciwciał znakowanych haptenem, które wiążą się z powierzchnią funkcjonalizowanego chipu, (4) próbek zawierających badany antygen. Biosensor firmy BioScale jest urządzeniem rezonansowym zawierającym osiem oddzielnych membran z osobnymi ścieżkami przepływu płynów. Membrany zmieniają częstotliwość oscylacji w odpowiedzi na gromadzenie się masy na powierzchni, a ta zmiana częstotliwości jest wykorzystywana do ilościowego określenia wartości dodanej masy.
Aby umożliwić zastosowanie w szerokiej gamie testów immunoanalitycznych, sensor zostaje funkcjonalizowany przeciwciałem antyhaptenowym. Przeciwciała specyficzne dla danego testu są modyfikowane poprzez kowalencyjną koniugację znacznika haptenowego z jednym przeciwciałem oraz biotyny z drugim. Znacznik biotynowy służy do związania przeciwciała z magnetycznymi kulkami sprzężonymi ze streptawidyną, które w połączeniu z przeciwciałem znakowanym haptenem są wykorzystywane do wychwytywania anality w układzie kanapkowym. Kompleks wiąże się z chipem poprzez oddziaływanie antyhapten/hapten. Po zakończeniu każdego cyklu pomiarowego sensory są oczyszczane rozcieńczonym kwasem, co umożliwia sekwencyjną analizę kolumn z płytki 96-dołkowej.
W niniejszym materiale przedstawiamy metodę opracowania specjalistycznego testu AMMP dla białek gospodarza CHO (CHO-HCP) na potrzeby rozwoju bioprocesów. Opracowanie testów AMMP lub modyfikacja istniejących testów w celu przekształcenia ich w testy AMMP może zapewnić lepsze parametry (powtarzalność, czułość) w próbkach złożonych oraz skrócić czas pracy operatora. Protokół opisuje etapy opracowania, a sekcja dyskusji przedstawia reprezentatywne wyniki. W celu uzyskania bardziej szczegółowych wyjaśnień dotyczących optymalizacji testów i parametrów dostosowania prosimy o kontakt z firmą BioScale. Zestaw ten oferuje ogólne testy do rozwoju bioprocesów, takie jak testy na pozostałą Proteinę A, miano produktu oraz CHO-HCP.

Opisano opracowanie niestandardowych analiz na platformie ViBE w celu uzyskania bardziej czułych, powtarzalnych i zautomatyzowanych wyników w złożonych matrycach. Uniwersalny kartridż pozwala na łatwe dostosowanie analiz do zastosowań niestandardowych. Ta wszechstronność umożliwia szybkie opracowanie i walidację nowych analiz lub zautomatyzowanych wersji istniejących analiz manualnych, co zostało zilustrowane w tym filmie.

Opracowywanie spersonalizowanych testów białek komórek gospodarza z linii Chinese Hamster Ovary z wykorzystaniem technologii akustycznej mikrocząsteczkowej membrany

Dostosowane analizy dla unikalnych białek są często ograniczone do czasochłonnych manualnych technik detekcji i oznaczania ilościowego, takich jak testy ELISA lub Western blot, ze względu na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie zoptymalizowanego, stabilnego testu immunoologicznego, zapewniającego powtarzalne wyniki przy ograniczonym czasie pracy manualnej. Jest to realizowane poprzez przygotowanie odpowiednich komponentów testu, a następnie optymalizację testu w oparciu o jego parametry.Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie analizy na platformie Vibe poprzez załadowanie płytek z próbkami i odczynnikami oraz zdefiniowanie procedury pomiarowej. W oprogramowaniu Vibe ostatnim etapem jest uruchomienie urządzenia za pomocą kreatora startowego. W rezultacie, dzięki zastosowaniu platformy Vibe, można uzyskać czułe i powtarzalne wyniki immunoprocedury z użyciem niestandardowych przeciwciał przy ograniczeniu nakładu pracy manualnej.Główną zaletą tej technologii w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda Eli'ego, jest to, że stacja robocza Vibe Workstation zapewnia możliwość pracy bezobsługowej oraz bardziej powtarzalne dane zgodnie ze standardowymi protokołami. W przypadku użycia NHS Chromogenic i biotyny, aby przyłączyć przeciwciało biotynilowane do streptawidynowych kulek magnetycznych, należy rozpocząć od wstrząsania fiolki ze streptawidynowymi kulkami magnetycznymi w wirówce (vortex) przez jedną do dwóch minut w celu ich resuspensji. Następnie należy pipetować pożądaną objętość kulek do probówki wirówkowej i usunąć nadsącz za pomocą separatora magnetycznego. Kuleczki należy przemyć trzykrotnie buforem PBST, odzyskując je za pomocą separacji magnetycznej zgodnie z opisem w protokole.Po usunięciu PBST z ostatniego etapu płukania, należy dodać do kulek roztwór przeciwciał biotynylowanych i resuspender kulki za pomocą pipety. Należy upewnić się, że objętość przeciwciał wynosi co najmniej 300 µL. Jeśli jest ona mniejsza, należy ją uzupełnić za pomocą PBS.Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu. Następnie przemyć kuleczki PBST w sposób opisany wcześniej. Dodać biotynilowane BSA zgodnie z procedurą przeprowadzoną poprzednio.Po przemyciu przeciwciała biotynilowanego, przed zawieszeniem kulek w 100 µL 0,05% BSA w PBS do długoterminowego przechowywania, zgodnie ze standardowymi protokołami można dodać azydku sodu. Za pomocą fluoresceiny NHS należy przeprowadzić fluorynację przeciwciała detekcyjnego. Aby rozpocząć opracowanie testu na białka gospodarza komórek jajnika chomika syryjskiego.W pierwszej kolejności należy przygotować roztwory robocze. Przeciwciało znakowane haptenem (HAB) przygotowuje się jako czterokrotny roztwór roboczy o stężeniu 1,6 µg/ml, rozcieńczony w rozcieńczalniku HAB do kulek bio scale; roztwór należy mieszać rotacyjnie przez co najmniej pięć minut. Następnie przygotowuje się zawiesinę kulek.Dokładnie wymieszaj zapas kulek w żółci na wirówce typu vortex. Aby upewnić się, że wszystkie kulki znajdują się w zawiesinie, pobierz alykwot w celu przygotowania czterokrotnego roztworu roboczego o stężeniu 8 × 10⁵ kulek/ml, rozcieńczonego w rozcieńczalniku Bio Scale Bead HAB. Rotuj roztwór przez co najmniej pięć minut.Następnie należy przygotować bufor do elektroforezy. Kilka testów HCP dla komórek CHO opracowano z wykorzystaniem buforu HEPES 10 mM z dodatkiem 1% tween, pH 7,5.Należy jednak pamiętać, że bufor może wymagać optymalizacji pod kątem przeciwciał wykorzystywanych do opracowania danego testu. Zaleca się przygotowanie szablonu testu dla każdego z pięciu testów stacji roboczej. Szablon testu składa się z siedmiu arkuszy oznaczonych jako instrukcje, notatki dotyczące przygotowania próbek, obliczenia danych surowych, wykres kalibracyjny oraz wyniki.Aby rozpocząć konfigurowanie szablonu, wybierz arkusz konfiguracji próbek i uzupełnij w tabeli zakres stężeń standardów. W lewym górnym rogu arkusza wpisz w tabeli po prawej stronie standardów dodatkowe informacje, aby poinstruować stację roboczą vibe o czasie inkubacji próbek, objętości przenoszonego odczynnika, czasie akumulacji próbek oraz o tym, czy konieczne jest przygotowanie sensora i dekontaminacja sond oraz kartridża. Następnie uzupełnij układ płytki, rozcieńcz kalibratory i próbki za pomocą rozcieńczalnika próbek bio scale i wprowadź próbki do płytek.Nanieś odczynniki do trzeciej płytki 96-dołkowej z wysokimi ściankami. Uszczelnij płytki. Umieść płytki na potrysinach platformy roboczej i przygotuj system, uzupełniając go buforem płuczącym oraz roztworem regenerującym.Włącz stację roboczą vibe i podłącz dopływ oraz odpływ systemu. Rozpocznij przygotowanie systemu (priming). Włóż kasetę vibe.Na koniec uruchom kreator konfiguracji analizy. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie i rozpocznij. Sygnał analizy jest mierzony za pomocą technologii A MMP. Gdy przeciwciało HAPTEN antygenu na koraliku wiąże się z sensorem poprzez oddziaływanie hapten-antyhapten, regeneracja przywraca sensor do stanu początkowego poprzez usunięcie kompleksów immunologicznych. Jak pokazano.Oto przykład analizy CHO H-C-P-A-M-M-P. Analizę krzywej kalibracyjnej można przeprowadzić w próbkach z bioreaktora, uzyskując powtarzalne wyniki. Ta krzywa kalibracyjna dotyczy białka resztkowego.Test A-A-M-M-P przeprowadzony przy użyciu zestawu do oznaczania resztkowego białka vibe. Ten sam zestaw można wykorzystać do szybszego badania z 30-minutowym okresem inkubacji lub w celu uzyskania bardziej czułych wyników i szerszego zakresu dynamicznego przy dłuższym czasie inkubacji. Stacja robocza Vibe może być również wykorzystana do oznaczania miana produktu, przeprowadzanego w inny sposób niż pozostałe testy A-MMP.Ten test nie wymaga obróbki próbek ani kulek, a ilościowe oznaczenie zostało zweryfikowane w próbkach bez wirowania zawierających ponad 10 milionów komórek. Przedstawiono tutaj krzywą wzorcową sygnału uzyskanego za pomocą Vibe Bioanalyzer lub technologii Alpha Screen, wykorzystując wyniki dla rekombinowanego GST GAD 34 na platformie Vibe. Tutaj zastosowano czułość większą o rząd wielkości.Indukcję GAD 34 z ksenoprzeszczepów CWR 22 badano w obecności lub przy braku inhibitora proteasomu bate, analizując wyniki za pomocą systemu Vibe, bioanalizatora lub Alpha screen. Platforma Vibe była w stanie dostarczyć czułe i powtarzalne wyniki w ksenoprzeszczepach guzów in vivo, podczas gdy sygnał Alpha screen był tłumiony wraz ze zwiększeniem liczby mikrogramów białka po opracowaniu metody. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie odkrywania leków onkologicznych do badania inhibicji leków w próbkach guzów i pozwoliła na bardziej efektywne operacje w zastosowaniach bioprocesowych.

developing-custom-chinese-hamster-ovary-host-cell-protein-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowywanie niestandardowych metod oznaczania białek komórek gospodarza jajnika chomika chińskiego za pomocą technologii akustycznych mikrocząstek membranowych

Ten film demonstruje test do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z płynu do hodowli komórkowych pobranego z komórek jajnika chomika chińskiego. Wykorzystuje porowatą żywicę szklaną z unieruchomionym białkiem A, które wiąże się z regionem Fc przeciwciał w próbce, skutecznie oddzielając je od zanieczyszczeń. Zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH osłabia interakcję, ułatwiając pobieranie oczyszczonych przeciwciał.

Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Tutaj opisujemy test chromatograficzny połączony z separacją ruchliwości jonów prekursorów peptydów, po której następuje detekcja MS w wysokiej rozdzielczości (~30 000) MS dla kwantyfikacji wzorców peptydów wzbogaconych w trawieniu przeciwciał monoklonalnych.

Test HS-MRM do oznaczania ilościowego białek komórek gospodarza w biofarmaceutykach białkowych za pomocą chromatografii cieczowej Mobilność jonów Spektrometria mas QTOF

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Protokół przedstawia metodę izolowania lizatów białkowych całych komórek z wypreparowanych procesów twarzy zarodków myszy lub hodowanych mysich embrionalnych komórek mezenchymy zarodkowej i przeprowadzania następnie western blot w celu oceny poziomu fosforylowanego białka.

Izolacja lizatów białkowych całych komórek z procesów twarzy myszy i hodowanych komórek mezenchymy podniebienia do analizy fosfoprotein

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Przedstawiono protokół wzbogacania białek komórek gospodarza (HCP) z produktów leczniczych (DP) i wykrywania peptydów za pomocą kulek wzbogacających proteom. Metodę demonstruje się przy użyciu wyprodukowanej we własnym zakresie substancji leczniczej (DS) opartej na przeciwciałach monoklonalnych (mAb), która jest dobrze scharakteryzowanym materiałem referencyjnym do oceny i porównywania różnych metod pod względem wydajności.

Analiza białek komórek gospodarza przy użyciu kulek wzbogacających w połączeniu z ograniczonym trawieniem

Tutaj prezentujemy protokół generowania i funkcjonalnej weryfikacji wrażliwych na niedotlenienie komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)-T. Protokół ten przedstawia generację wrażliwych na niedotlenienie komórek CAR-T opartą na lentiwirusie i ich charakterystykę, w tym walidację zależnej od hipoksji ekspresji CAR i selektywnej cytotoksyczności.

Generowanie i weryfikacja funkcjonalna wrażliwych na niedotlenienie chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Egzosomy mają znaczny potencjał kliniczny, ale ich praktyczne zastosowanie jest ograniczone ze względu na łatwą klirens in vivo i słabą stabilność. Mikroigły stanowią rozwiązanie, umożliwiając miejscowe dostarczanie poprzez przebijanie barier fizjologicznych i zachowanie stanu suchego, rozwiązując w ten sposób ograniczenia podawania egzosomów i rozszerzając ich użyteczność kliniczną.

Wytwarzanie i charakterystyka plastrów mikroigłowych do ładowania i dostarczania egzosomów

Poznaj rozwój niestandardowych immunoassayów na platformie ViBE dla białek komórek jajnika chomika chińskiego. Ta metoda zapewnia wrażliwe i powtarzalne wyniki przy minimalnym czasie obsługi ręcznej.

Opracowywanie niestandardowych testów białek komórek jajnika i gospodarza chomika chińskiego przy użyciu technologii mikrocząstek membrany akustycznej (Wideo) | JoVE Journal

Opracowywanie spersonalizowanych testów białek komórek gospodarza z linii Chinese Hamster Ovary z wykorzystaniem technologii akustycznej mikrocząsteczkowej membrany

Przeglądaj więcej filmów