Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiałów przepuszczalnych dla gazów

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie prawidłowego wykorzystania zbiorników kominowych Corning Hypers w systemie zamkniętym. Osiąga się to poprzez uprzednie zaszczepienie i napełnienie naczyń pożywką metodą podawania grawitacyjnego. Następnie zawiesina komórkowa jest izolowana w każdej z warstw i komórki są inkubowane.

Po inkubacji zużyte podłoże jest usuwane. Ostatnim etapem zabiegu jest pobranie komórek z naczyń hipers. Ostatecznie uzyskuje się wyniki dyfuzji gazów, aby pokazać zdolność komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do płynności, gdy używany jest zamknięty system hipers-stosu.

Główną zaletą naczynia hiperkominowego z materiałem przepuszczalnym dla gazów jest to, że zapewnia zwiększoną powierzchnię do wzrostu komórek. Eliminując przestrzeń nad głową w naczyniu, mój kolega p pardo zademonstruje teraz protokół systemu zamkniętego do korzystania z naczynia stosu hipers. Naczynie stosu hipers składa się ze staty, która jest indywidualnym przedziałem hodowli komórkowej, który składa się z górnej płyty i folii przepuszczającej gaz.

Komórki są hodowane w tym komponie. Kolektor cieczy łączy ze sobą każdą z warstw ette w ramach modułu. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia w wielokrotności 12 warstw.

Kolektor pozwala użytkownikowi na wykonanie jednej manipulacji płynem na całym naczyniu. Kolektor powietrzny również łączy ze sobą warstwy stat, ale służy do wypierania powietrza z naczynia, gdy dochodzi do dodawania płynów i zawiera linię napełniania do użycia podczas napełniania między nimi. Warstwa Stat to otwarta przestrzeń powietrzna zwana przestrzenią tchawicy, umożliwiająca wymianę gazową przez przepuszczalną dla gazów warstwę każdej warstwy.

Rurka do obsługi cieczy jest podłączona do kolektora cieczy i jest konfigurowalnym elementem używanym do wykonywania wszystkich manipulacji płynami w układzie zamkniętym w celu uwolnienia nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności. Używana jest rurka odpowietrzająca. Rurka odpowietrzająca jest podłączona do kolektora powietrza i zawiera filtr powietrza.

Do rurki do obsługi cieczy podłączona jest rurka pościgowa i filtr, które służą do odprowadzania płynu z rurki do obsługi cieczy po napełnieniu naczynia. W tym protokole używany jest również manipulator Corning Stack lub CSM, który jest urządzeniem manipulacyjnym pomagającym w umieszczaniu naczyń we właściwych pozycjach podczas użytkowania. W tej demonstracji zademonstrowano hodowlę komórkową w układzie zamkniętym dla przepuszczalnego dla gazów 36-warstwowego naczynia.

Jednak przy użyciu CSM szczegóły dotyczące wykonywania tej procedury na 12-warstwowym naczyniu przy użyciu klina napełniającego można znaleźć w dołączonym pisemnym protokole. Zacznij od przygotowania 3,9 litra pożywki w worku przed zaszczepieniem probówki z pożywką. Zwilż worek z serum do worka z pożywką i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać pożądane stężenie surowicy.

Zaciśnij około 300 mililitrów nośnika w torbie za pomocą dużych zacisków do worków. Zapewni to, że wszystkie zaszczepione komórki zostaną wykorzystane podczas napełniania i żadna nie pozostanie w torbie z pożywką. Umieść pożywkę na stojaku na torbę, aby zaszczepić pożywkę.

Napełnić strzykawkę dołączoną do rurki zawiesiną komórkową. Przymocować strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek do worka z pożywką za pomocą spawania rurowego. Trzy rurki o średnicy ponad 16 cali od strzykawki do torby.

Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do worka z podłożem i dobrze wymieszać. Zaszczepioną pożywkę można przymocować do trzycalowej rurki do przenoszenia cieczy naczynia za pomocą spawania rur lub za pomocą łączników uniwersalnych. Dzisiaj zajmiemy się spawaniem rur.

Zamknij zaciski na rurkach do przenoszenia cieczy i chase naczynia. Umieść 36-warstwowe naczynie w A CSM w pozycji załadunku. Zaczep rurkę filtra odpowietrzającego w zacisku mocującym na CSM.

Dokręć pokrywę i przesuń CSM do pozycji napełniania, aby ustawić filtr powietrza w najwyższej pozycji, aby zapobiec zamoczeniu podczas napełniania. Kąt 10 stopni pozwala również na zrównoważenie cieczy z warstwami podczas napełniania czystym powietrzem z linii napełniania. Umieszczając worek na nośnik na tym samym poziomie co naczynie, utrzymując rurkę pościgową clamp zamknięty.

Otwórz rurkę do obsługi cieczy clamp i worek na media clamp aby umożliwić przedostanie się płynu do naczynia. Korzystając ze stojaka na torbę, podnieś worek na nośnik, aby zawiesina komórek mogła przepływać do naczynia. Napełniać naczynie, aż cała zaszczepiona pożywka dostanie się do naczynia.

Górna część torby na nośniki powinna nadal zawierać 300 mililitrów nośnika. Zdejmij clamp z torby na nośniki, aby kontynuować napełnianie naczynia, gdy ciecz zbliża się do górnego kolektora powietrza. Zwolnij tempo napełniania, obniżając worek na nośnik, aby zapobiec przepełnieniu.

Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i zbryl rurkę do przenoszenia cieczy. Doprowadzić naczynie w CSM do pozycji izolacji, umieszczając oba zestawy kolektorów w najwyższym położeniu. Opuścić worek na media poniżej wysokości naczynia.

Gdy filtr chase jest trzymany w pozycji pionowej, otwórz rurkę chase clamp. Spowoduje to opróżnienie lub przepchnięcie nośnika z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka na media. Gdy rurka jest pusta, zamknij zacisk na wężyku worka na nośnik.

Utrzymywanie filtra rurki chase w pozycji pionowej. Otwórz zacisk na rurze do obsługi cieczy naczynia, aby umożliwić przedostawanie się pozostałej cieczy i zrównoważenie się w naczyniu. Poczekaj od jednej do dwóch minut, aż to nastąpi.

Następnie obróć naczynie w CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Opuść naczynie do pozycji załadunku na CSM. Zamknij zaciski zarówno na rowku, jak i wężyku do przenoszenia cieczy.

Worek z pożywką może być teraz wyjęty z naczynia lub może pozostać przymocowany do użycia w dalszej części procedury zbioru. Aby przechowywać dołączoną torbę na nośniki, zwiń ją i umieść pod taśmami mocującymi w tacy do przechowywania naczynia. Na koniec przenieś naczynie do inkubatora Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby płyn nie dostał się do filtra odpowietrzającego.

Osiąga się to poprzez lekkie przechylenie końca kolektora do góry. Aby rozpocząć probówkę procedury zbioru, zespawaj ze sobą roztwór asocjacyjny komórek i worki hartownicze Aby utworzyć zespół worka do zbioru, upewnij się, że wszystkie rurki clamps są zamknięte. Wyjąć naczynie z inkubatora i umieścić je w CSM w pozycji załadunku.

Zwolnij worek na nośniki spod taśm mocujących i zawieś go na torbie. Stań obok, dokręć pokrywę, aby zabezpieczyć naczynie. Zaczep rurkę odpowietrzającą w zacisku mocującym i przesuń CSM do pozycji napełniania.

Upewnij się, że torba na nośniki na stojaku na torby zwisa niżej niż naczynie. Otwórz zacisk na wężyku worka na nośnik i wężyku do przenoszenia płynów w naczyniu, aby umożliwić przepływ mediów do dołączonej torby. Gdy naczynie jest puste w około trzech czwartych, zmień ustawienia CSM na ostateczną pustą pozycję.

Gdy naczynie i rurka do przenoszenia cieczy są puste, podnieś rurkę, aby przepchnąć nośnik przez clamp na rurkę worka ze zużytym nośnikiem. Następnie zamknij zarówno zacisk na wężyku do obsługi cieczy, jak i zacisk na wężyku worka ze zużytą pożywką. Zastąp worek zużytego podłoża zespołem worka do zbioru przez spawanie rurowe.

Podnieś wysokość zespołu worka dysocjującego ogniwo powyżej wysokości naczynia za pomocą stojaka na worki. Umieść CSM w pozycji napełnienia. Otwórz rurkę z roztworem do dysocjacji komórek i zespół worka do zbioru Clamp i przenieś roztwór do naczynia.

Po zakończeniu przenoszenia zamknij zaciski na wężyku do przenoszenia cieczy i wężyku roztworu do dysocjacji komórek. Następnie ustaw CSM w pozycji załadunku, trzymając otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego. Delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek.

Naczynie może czasami być powrócone do pozycji napełniania podczas kołysania, aby utrzymać równomierne rozprowadzenie roztworu. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu zwolnij dźwignię na CSM, aby zablokować pozycję napełniania. Pozostaw naczynie w tej pozycji przez wymagany czas dysocjacji komórek.

Użyj zmętnienia jako przewodnika, aby określić odwarstwienie komórek. Po odłączeniu przesuń CSM do pozycji obciążenia. Otwórz zacisk worka hartowniczego i rurkę do obsługi cieczy clamp, aby umożliwić przedostawanie się medium hartowniczego do naczynia.

Zamknij zacisk na wężyku do obsługi cieczy. Po zakończeniu przenoszenia przywróć CSM do pozycji załadunku i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby przechylić naczynie na boki. Korzystając ze stojaka na worki, opuść pozycję zespołu worka do zbioru poniżej poziomu naczynia.

Ustaw CSM w pustej pozycji. Otwórz rurkę do obsługi cieczy w naczyniu Clamp i przenieś roztwór komórkowy z powrotem do worka hartującego. Przywróć CSM do pozycji załadunku i odłącz zespół worka do zbioru od naczynia za pomocą zgrzewarki do rur.

Teraz rozwiązanie komórkowe jest gotowe do przetwarzania w tradycyjnych systemach wzrostu komórek. Dzięki Headspace tlen w pożywce jest wyczerpywany średnio o 50% w ciągu trzech dni. W hodowli liczba ta pokazuje spadek miligram na litr tlenu na poziomie komórek w czasie w tym samym systemie wzrostu, gradient tlenu przez podłoże o wysokości trzech milimetrów jest prawie o 50% większy na złączu pożywki z przestrzenią roboczą niż w warstwie komórki.

Pokazano procentową zawartość tlenu w przestrzeni tchawicy stosu hipers podczas wzrostu komórek. Rysunek pokazuje, że w ciągu 96 godzin procent tlenu między warstwami, który dostarcza każde dno folii przepuszczalnej dla gazu, pozostaje stały. Pokazuje to zdolność komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do płynności ko.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak napełniać i zbierać naczynie kominowe Corning Hypers w systemie zamkniętym.