Name: Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiałów przepuszczalnych dla gazów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj protokół hodowli komórkowej w zamkniętym systemie HYPERStack z materiałami przepuszczalnymi dla gazów. Ta metoda zwiększa wydajność pobierania komórek przy zachowaniu sterylności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować firmie Lonza Walkersville za pomoc w zakresie wiedzy o systemach zamkniętych, projektowania worków, udostępnienie zgrzewarek i zlutownic do worków, a także za opracowanie schematów worków do systemu HYPERStack.

1. Naczynie HYPERStack - Podstawy technologii materiałów przepuszczalnych dla gazów
<ol>
<li>Naczynie HYPERStack jest wielowarstwowym naczyniem do hodowli komórek w systemie zamkniętym, w którym metabolizm komórkowy opiera się na wymianie gazowej poprzez gazoprzepuszczalną błonę polimerową o grubości 76.2micron.</li>
<li>Naczynie HYPERStack różni się od tradycyjnych naczyń do hodowli komórek tym, że nie posiada ono tzw. „przestrzeni nadfazowej” (headspace) nad komórkami wewnątrz naczynia. Zamiast utrzymywać taką przestrzeń do wymiany gazowej wewnątrz naczynia, produkty gazoprzepuszczalne posiadają przestrzenie powietrzne (zwane przestrzeniami „trachealnymi”) pod każdą komorą hodowlaną, które są otwarte na atmosferę.</li>
<li>Ta przestrzeń trachealna umożliwia równoważną wymianę gazową dla komórek rosnących w każdym przedziale hodowlanym naczynia.</li>
<li>Błona gazoprzepuszczalna pozwala na zachodzenie wymiany gazowej przy jednoczesnym utrzymaniu sterylnego środowiska. Wszystkie manipulacje płynami dla każdej z wielu warstw odbywają się poprzez pojedynczy port dostępu.</li>
</ol>
2. Podsumowanie komponentów naczynia HYPERStack
<ol>
<li>Stackette to poszczególna komora do hodowli komórkowej, składająca się z górnej płyty i membrany przepuszczalnej dla gazów. W tej komorze hodowane są komórki.</li>
<li>Kolektor cieczowy (Liquid Manifold) łączy każdą z 12 warstw stackette w obrębie modułu HYPERStack. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia składające się z wielokrotności 12 warstw. Kolektor umożliwia użytkownikowi wykonanie jednej manipulacji płynem dla całego naczynia.</li>
<li>Kolektor powietrzny (Air Manifold) również łączy warstwy stackette, ale służy do wypierania powietrza z naczynia podczas dodawania cieczy. Zawiera linię napełniania wykorzystywaną podczas procesu napełniania.</li>
<li>Przestrzeń tchawkowata (Tracheal Space) to otwarta przestrzeń powietrzna między każdą warstwą stackette, umożliwiająca wymianę gazową poprzez membranę przepuszczalną dla gazów każdej z warstw.</li>
<li>Rurki do manipulacji cieczami są podłączone do kolektora cieczowego i służą do wykonywania wszystkich manipulacji cieczami w systemie zamkniętym. Ten komponent może być dostosowany do indywidualnych potrzeb.</li>
<li>Rurka odpowietrzająca jest podłączona do kolektora powietrznego, zawiera filtr powietrza i służy do uwalniania nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności.</li>
<li>Rurka odprowadzająca (chase tubing) posiada filtr oraz zacisk, jest podłączona do rurek do manipulacji cieczami i służy do usunięcia cieczy z rurek do manipulacji cieczami po napełnieniu naczynia.</li>
<li>Manipulator do stosów Corning (Corning Stack Manipulator, CSM) to urządzenie pomocnicze służące do precyzyjnego rozmieszczania naczyń w odpowiednich pozycjach podczas użytkowania.</li>
<li>Klin do napełniania (Filling Wedge) to wykonany ze stali nierdzewnej element pomocniczy, stosowany podczas ręcznego napełniania naczyń HYPERStack.</li>
</ol>
3. Wyniki dyfuzji gazów przez membranę gazoprzepuszczalną stosowaną w naczyniach HYPERStack
<ol>
<li>W tradycyjnych systemach hodowli komórkowych z wentylowaną przestrzenią nad cieczą, poziom tlenu w medium spada średnio o 50% w ciągu 3 dni hodowli. (Rycina 1)</li>
<li>W tym samym systemie hodowli komórkowych gradient tlenowy w warstwie medium o wysokości 3 mm jest niemal o 50% większy na styku medium i przestrzeni nad cieczą niż na poziomie warstwy komórek. (Rycina 2)</li>
<li>Dyfuzja tlenu przez gazoprzepuszczalną błonę polistyrenową o grubości 76,2 micron jest równoważna dyfuzji przez 2,6 mm medium. Gazoprzepuszczalna błona zastosowana w naczyniach HYPERStack umożliwia wymianę gazową bezpośrednio na poziomie warstwy komórek.</li>
<li>Procentowa zawartość tlenu w przestrzeni tchawicowej naczyń HYPERStack pozostaje stała w miarę wzrostu komórek do osiągnięcia konfluencji. (Rycina 3)</li>
</ol>
4. Przygotowanie worka z pożywką
<ol>
<li>Naczynie HYPERStack-12 warstw przyjmuje 1,3L medium, a naczynie HYPERStack-36 warstw przyjmuje 3,9L medium.</li>
<li>Przed zaszczepieniem medium w worku, w przypadku stosowania surowicy, należy zespawać worek z surowicą z workiem z medium i dokładnie wymieszać.</li>
<li>Odciąć za pomocą dużych zacisków do worków około 30 mL medium w worku. Zapewni to wykorzystanie wszystkich zaszczepionych komórek podczas napełniania i zapobiegnie ich pozostawaniu w worku z medium. Umieścić worek z medium na stojaku.</li>
</ol>
5. Pożywki do inokulacji
<ol>
<li>Napełnić strzykawkę z dołączonym przewodem zawiesiną komórkową. Połączyć za pomocą spawania rurek przewód 3/16" od strzykawki zawierającej zawiesinę komórkową z workiem z medium.</li>
<li>Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do worka z medium i dokładnie wymieszać.</li>
</ol>
6. Procedura napełniania
<ol>
<li>Zespawaj rurką worek z zaszczepionym medium do przewodów do obsługi cieczy 3/8" w naczyniu HYPERStack. (Używając Sterile Connects lub złączy wielozadaniowych (MPC), można również podłączyć worek z medium do naczynia).</li>
<li>Zamknij zaciski na przewodach do obsługi cieczy oraz przewodach przepłukujących w systemie HYPERStack.</li>
<li>Umieść 36-warstwowe naczynie HYPERStack w CSM w pozycji załadunkowej; zatrzaśnij rurkę filtra odpowietrzającego w uchwycie mocującym w CSM. Dokręć pokrywę i przesuń CSM do pozycji napełniania. Dzięki ustawieniu naczynia w odpowiedniej pozycji napełniania, filtr powietrza znajduje się teraz w najwyższym punkcie, aby zapobiec jego zamoczeniu podczas procesu napełniania. Kąt 10° umożliwia wyrównanie poziomu cieczy w warstwach podczas napełniania. 12-warstwowe naczynie HYPERStack ułożone na boku na klinie do napełniania znajduje się w odpowiedniej pozycji do napełniania.</li>
<li>Usuń powietrze z linii napełniającej, ustawiając worek na tym samym poziomie co naczynie HYPERStack (nie wyżej). Pozostawiając zamknięty zacisk przewodu przepłukującego, otwórz zacisk przewodu do obsługi cieczy oraz zacisk worka z medium, aby umożliwić dopływ płynu do naczynia.</li>
<li>Używając statywu na worek, podnieś worek z medium, aby wspomóc przepływ zawiesiny komórkowej do naczynia.</li>
<li>Napełniaj naczynie, aż całe zaszczepione medium wpłynie do środka; w górnej części worka z medium powinno pozostać jeszcze 300 mL medium. Zdejmij zacisk z worka z medium, aby kontynuować napełnianie naczynia. Gdy ciecz zbliży się do górnego kolektora powietrznego, zmniejsz prędkość napełniania poprzez obniżenie worka z medium, aby zapobiec przepełnieniu. Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i zaciśnij przewód do obsługi cieczy.</li>
</ol>
7. Procedura izolacji w celu zablokowania cieczy w warstwach
<ol>
<li>Przenieś naczynie HYPERStack w module CSM do pozycji izolacji, tak aby oba zestawy kolektorów znajdowały się w najwyższym położeniu, a następnie obniż worek z pożywką poniżej wysokości naczynia. Naczynie HYPERStack-12 layer można podnieść do pozycji izolacji, kładąc jedną rękę na boku naczynia i używając drugiej do uniesienia klina wypełniającego.</li>
<li>Trzymając filtr przepłukujący w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki przepłukującej. Spowoduje to opróżnienie lub przepłukanie pożywki z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka z pożywką. Po opróżnieniu rurki zamknij zacisk na rurce worka z pożywką.</li>
<li>Trzymając filtr rurki przepłukującej w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki do obsługi cieczy w urządzeniu HYPERStack, aby pozostała ciecz mogła wpłynąć i wyrównać się w naczyniu. Odczekaj 1-2 minuty, aż proces ten zostanie zakończony.</li>
<li>Obróć naczynie HYPERStack w module CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Obniż naczynie do pozycji załadunkowej w module CSM. Lekkie przechylenie naczynia HYPERStack-12 layer w lewo umożliwi wyjęcie klina wypełniającego. Zamknij zaciski na rurce przepłukującej oraz rurce do obsługi cieczy.</li>
<li>Worek z pożywką można teraz odłączyć od naczynia lub pozostawić podłączonym do późniejszego użycia podczas procedury zbioru. Aby przechować podłączony worek z pożywką, zwiń pusty worek wraz z pozostałą w nim pożywką i umieść go pod taśmami mocującymi w tacy do przechowywania naczynia HYPERStack.</li>
<li>Przenieś naczynie HYPERStack do inkubatora. Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby ciecz nie dostała się do filtra odpowietrzającego. Osiąga się to poprzez lekkie nachylenie końca z kolektorem urządzenia HYPERStack do góry.</li>
</ol>
8. Protokół zbioru
<ol>
<li>Aby rozpocząć procedurę zbioru, należy zespawać rurki roztworu do dysocjacji komórek i worków z medium hamującym, tworząc zestaw worków do zbioru. Upewnij się, że wszystkie zaciski rurek są zamknięte. (Użyj schematu do demonstracji)</li>
<li>Wyjmij naczynie HYPERStack z inkubatora, zwolnij worek z medium spod pasów mocujących i powieś go na stojaku na worki. Umieść naczynie w CSM w pozycji załadunkowej i mocno dokręć pokrywę, aby zabezpieczyć naczynie. Zaczep rurkę odpowietrzającą w uchwycie mocującym i przesuń CSM do pozycji napełniania.</li>
<li>Upewniając się, że worek z medium na stojaku wisi niżej niż HYPERStack, otwórz zacisk na rurce worka z medium oraz zacisk rurki do prowadzenia cieczy naczynia, aby umożliwić przepływ medium do podłączonego worka.</li>
<li>Gdy naczynie będzie puste w około ¾, zmień ustawienia CSM na końcową pozycję opróżniania. Gdy naczynie HYPERStack i rurka do prowadzenia cieczy będą puste, unieś rurkę, aby przepchnąć medium poza zacisk na rurce worka z zużytym medium, a następnie zamknij zarówno zacisk rurki do prowadzenia cieczy, jak i zacisk rurki worka z zużytym medium.</li>
<li>Zastąp worek z zużytym medium zestawem worków do zbioru za pomocą spawania rurek i podnieś zestaw worków z roztworem do dysocjacji komórek powyżej poziomu HYPERStack, korzystając ze stojaka na worki.</li>
<li>Umieść CSM w pozycji wyrównywania. Otwórz zacisk rurki z roztworem do dysocjacji komórek i przenieś roztwór do HYPERStack. Po zakończeniu transferu zamknij zaciski na rurce do prowadzenia cieczy i rurce z roztworem do dysocjacji komórek.</li>
<li>Przesuń CSM do pozycji załadunkowej. Trzymając otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego, delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek. Podczas kołysania naczynie może być okresowo przywracane do pozycji wyrównywania, aby utrzymać równomierny rozkład roztworu. Wizualnie może nie być widać, że warstwy są całkowicie pokryte, ale roztwór dysocjujący zostanie równomiernie rozprowadzony po powierzchni komórek. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu zwolnij dźwignię CSM, aby zablokować HYPERStack w pozycji załadunkowej. Pozostaw HYPERStack w tej pozycji przez wymagany czas dysocjacji dla Twoich komórek.</li>
<li>Po odłączeniu się komórek, kierując się mętnością, przesuń CSM do pozycji wyrównywania. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej dysocjacji komórek. Otwórz zacisk worka z medium hamującym oraz zacisk rurki do prowadzenia cieczy HYPERStack, aby umożliwić wniknięcie medium hamującego do naczynia. Po zakończeniu transferu zamknij zacisk rurki do prowadzenia cieczy HYPERStack.</li>
<li>Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby kołysać naczyniem na boki.</li>
<li>Korzystając ze stojaka na worki, obniż pozycję zestawu worków do zbioru poniżej poziomu HYPERStack. Ustaw CSM w pozycji opróżniania, otwórz zacisk rurki do prowadzenia cieczy naczynia i przenieś zawiesinę komórkową z powrotem do worka z medium hamującym. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i odłącz zestaw worków do zbioru od naczynia za pomocą zgrzewarki do rurek. Zawiesina komórkowa jest gotowa do dalszej obróbki.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
<ul>
<li>Przy przejściu ze standardowej powierzchni polistyrenowej na powierzchnię polistyrenową przepuszczającą gazy należy zoptymalizować czas zbioru komórek. Komórki mają tendencję do szybszego odrywania się w produkcie HYPERStack.</li>
<li>Aby obejrzeć komórki pod mikroskopem, należy zacisnąć rurki odpowietrzające i rurki do obsługi cieczy. Naczynie HYPERStack należy umieścić na stoliku mikroskopu dnem do góry, tak aby kolektory były skierowane w dół.</li>
<li>Można podjąć kroki zapobiegawcze, aby uniknąć zamoczenia filtrów podczas użytkowania, co spowodowałoby zaprzestanie ich funkcjonowania. Unikając przepełnienia naczynia HYPERStack i utrzymując rurkę odpowietrzającą oraz rurkę odprowadzającą w pozycji uniesionej przy otwartych zaciskach, nie powinno dojść do zamoczenia.</li>
<li>Nacisk zamkniętych zacisków na rurkę powoduje, że pozostaje ona zamknięta nawet po otwarciu zacisków. Ściśnięcie rurki w przeciwnym kierunku spowoduje jej otwarcie.</li>
<li>Czas przepływu medium wchodzącego i wychodzącego z naczynia HYPERStack poprzez dopływ grawitacyjny zależy od różnicy wysokości medium między górnym poziomem medium w naczyniu HYPERStack a górnym poziomem medium w pojemniku z medium. Im większa odległość, tym szybszy przepływ. Maksymalny przepływ jest ograniczony przez wydajność filtrów do 1,5L/min.</li>
<li>Utrzymanie prawidłowej objętości napełnienia w naczyniu HYPERStack zapobiegnie tworzeniu się pęcherzyków powietrza w komorach wzrostu komórek. Pęcherzyki powietrza mogą pojawić się w wyniku pobierania próbek lub inkubacji w środowisku nieuwilgotnionym z powodu ewaporacyjnej utraty wody. Ilość i częstotliwość pobierania próbek, a także warunki inkubacji, określą, czy użytkownik końcowy powinien dodać dodatkową ciecz.</li>
</ul>
<img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Wykres stężenia tlenu dla komórek CHO w kolbie T175; analiza danych w czasie w ppm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Wyczerpanie tlenu w pożywce w standardowym naczyniu do hodowli komórkowych. Rycina przedstawia spadek stężenia tlenu w mg/L na poziomie komórek w ciągu 3 dni.
<img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Wykres gradientu tlenu w kolbie T-175; stężenie O2 w funkcji głębokości; analiza danych; mg/L O2." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Gradient tlenu w medium w standardowym naczyniu do hodowli komórkowej. Rycina przedstawia, że stężenie tlenu w mg/L jest najwyższe na styku medium i przestrzeni nad cieczą niż na warstwie komórkowej.
<img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Wykres poziomu tlenu i temperatury w przestrzeni tchawiczej, czas względem procentowej zawartości tlenu i zmiany temperatury." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Procent zawartości tlenu w przestrzeni tchawiczkowej układu HYPERStack podczas wzrostu komórek. Rysunek pokazuje, że w ciągu 96 godzin procent tlenu pomiędzy warstwami, który zasila każde przepuszczalne dla gazów dno, pozostaje stały. Dowodzi to zdolności komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji.

Technologia przepuszczalności gazów w naczyniu HYPERStack jest objęta patentem USA nr: 7745209. 
Autorzy są pracownikami firmy Corning Life Sciences, Inc, która produkuje instrument wykorzystany w niniejszym artykule.

W naczyniu HYPERStack z powodzeniem hodowano komórki modyfikowane, pierwotne oraz macierzyste. Dodawanie cieczy do naczynia odbywało się poprzez aseptyczne połączenia z workami za pomocą grawitacyjnego dozowania, a także poprzez pompowanie ze sterylnego pojemnika z pożywką. Naczynie zapewnia ponad 2,5-krotny wzrost powierzchni hodowli w porównaniu do produktu z układu piętrowych płytek o tej samej objętości zajmowanej przestrzeni. Model HYPERStack-12 posiada powierzchnię hodowli 6 000cm2, HYPERStack-36 posiada powierzchnię hodowli 18 000cm2, a HYPERStack-120 posiada powierzchnię hodowli 60 000cm2. Dzięki zwiększeniu powierzchni użytkownicy mogą uzyskać więcej komórek z tej samej populacji lub partii komórkowej i zmniejszyć zmienność. Mogą również oszczędzać miejsce i/lub nakłady pracy, używając mniejszej liczby naczyń w celu uzyskania tej samej ilości komórek, lub zwiększyć wydajność produkcji komórek bez konieczności zatrudniania dodatkowego personelu, tworzenia nowych pomieszczeń czystych czy zakupu inkubatorów. System jest produkowany metodami montażu o niskim stopniu zanieczyszczenia cząstkami i bez użycia klejów. Jest to system zamknięty, wstępnie wyposażony w zestawy rurek i filtrów, zapakowany w potrójny worek i dostarczany w formie sterylnej.

<table><tbody><tr><td>Pożywka w worku 1,5 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350 ml pożywki + 150 ml serum (jeśli wymagane)</td></tr><tr><td>Pożywka w worku 4,0 L</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600 ml pożywki + 400 ml serum (jeśli wymagane)</td></tr><tr><td>Naczynie HYPERStack Vessel-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie HYPERStack Vessel-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>Klin do napełniania</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator do stosów</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do pobierania próbek HyQtainer Sub-Assembly</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hamujący w worku 600 ml (10% FBS IMDM)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek 600 ml</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń hyperstack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Hodowla przylegających komórek w dużych objętościach jest obecnie standaryzowana przy użyciu produktów do wzrostu komórek w postaci stosów płytek, gdy mikronośniki nie stanowią optymalnego wyboru. Naczynia HYPERStack umożliwiają skalowanie w systemie zamkniętym w odniesieniu do obecnych produktów w formie stosów płytek i pozwalają uzyskać >2,5X więcej komórek przy zachowaniu tej samej objętości całkowitej. Naczynia HYPERStack wykorzystują materiał przepuszczalny dla gazów, który umożliwia wymianę gazową, co eliminuje potrzebę pozostawiania wewnętrznej przestrzeni nad cieczą w naczyniu. Eliminacja przestrzeni nad cieczą pozwala na zminimalizowanie komory, w której zachodzi wzrost komórek, w celu oszczędności miejsca, co umożliwia rozmieszczenie większej liczby warstw powierzchni wzrostu komórek w tej samej objętości całkowitej.
W wielu zastosowaniach, takich jak terapia komórkowa czy produkcja szczepionek, wymagany jest zamknięty system do hodowli i zbioru komórek. Pojemnik HYPERStack umożliwia dodawanie i usuwanie komórek oraz odczynników za pomocą przewodów z worków z pożywką lub innymi metodami.
Niniejszy protokół wyjaśni technologię stojącą za materiałem przepuszczalnym dla gazów zastosowanym w naczyniach HYPERStack, wyniki dyfuzji gazów w celu zaspokojenia potrzeb metabolicznych komórek, protokoły hodowli komórkowej w systemie zamkniętym oraz różne metody zbioru komórek.

Wprowadzenie do technologii, protokołu i obsługi naczyń Corning HYPERStack oraz akcesoriów wykorzystywanych do wysokowydajnej hodowli komórek adherentnych. Protokół pokaże, jak wykorzystać naczynia z zamkniętym systemem w celu zwiększenia wydajności zbioru komórek w porównaniu do obecnie stosowanych produktów w formie stosów płytek.

Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Kultury adhezyjne komórek w dużej objętości są obecnie standaryzowane z wykorzystaniem produktów do hodowli komórkowych w postaci stosów płytek, w sytuacjach, gdy mikronośniki w formie kulek nie stanowią optymalnego wyboru.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie prawidłowego zastosowania naczyń w systemie zamkniętym z wykorzystaniem stosu Corning Hypers. Cel ten zostanie osiągnięty poprzez uprzednie zaszczepienie i napełnienie naczyń pożywką metodą grawitacyjną. Następnie zawiesina komórkowa zostanie wyizolowana w każdej z warstw, a komórki zostaną poddane inkubacji.Po inkubacji zużyte medium zostaje usunięte. Ostatnim krokiem procedury jest pozyskanie komórek z naczyń systemu hypers stack. W rezultacie uzyskuje się wyniki dyfuzji gazów, które wykazują zdolność komórek do pobierania tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji przy użyciu zamkniętego systemu hypers stack.Główną zaletą naczynia hypers stack z materiałem przepuszczalnym dla gazów jest zapewnienie zwiększonej powierzchni dla wzrostu komórek. Poprzez wyeliminowanie wolnej przestrzeni nad cieczą w naczyniu, mój kolega p pardo zaprezentuje teraz protokół systemu zamkniętego z wykorzystaniem naczynia hypers stack. Naczynie hypers stack składa się ze statu, czyli poszczególnej komory hodowli komórkowej, która tworzona jest przez płytkę górną oraz film przepuszczalny dla gazów.Komórki są hodowane w tej komorze. Kolektor cieczy łączy ze sobą poszczególne warstwy ette w obrębie modułu. Moduły są połączone rurkami, tworząc naczynia składające się z wielokrotności 12 warstw.Rozdzielacz umożliwia użytkownikowi przeprowadzenie jednej manipulacji płynem we wszystkich naczyniach jednocześnie. Rozdzielacz powietrza łączy również warstwy statyczne, ale służy do wypierania powietrza z naczyń podczas dodawania płynów i zawiera linię napełniania używaną podczas napełniania pomiędzy poszczególnymi etapami. Warstwa statyczna to otwarta przestrzeń powietrzna nazywana przestrzenią tchawkową, która umożliwia wymianę gazową poprzez gazoprzepuszczalną membranę każdej warstwy.Przewody do transportu cieczy są podłączone do kolektora cieczy i stanowią konfigurowalny element służący do przeprowadzania wszystkich manipulacji płynami w układzie zamkniętym w celu usunięcia nadmiaru powietrza przy zachowaniu sterylności. Stosowane są również przewody odpowietrzające. Przewody odpowietrzające są podłączone do kolektora powietrza i zawierają filtr powietrza.Do przewodów do obsługi cieczy podłączono przewód odprowadzający oraz filtr, które służą do usunięcia cieczy z przewodów po napełnieniu naczynia. W tym protokole wykorzystywany jest również manipulator Corning Stack (CSM), czyli urządzenie manipulacyjne pomagające w rozmieszczaniu naczyń w odpowiednich pozycjach podczas użytkowania. W niniejszej prezentacji przedstawiono hodowlę komórkową w systemie zamkniętym dla gazoprzepuszczalnego naczynia 36-warstwowego.W przypadku zastosowania CSM szczegółowe informacje dotyczące wykonania tej procedury w naczyniu 12-warstwowym przy użyciu klina do napełniania znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Rozpocznij od przygotowania 3,9 litra pożywki w worku przed zaszczepieniem probówki z pożywką. Przenieś surowicę z worka do worka z pożywką i wymieszaj dokładnie, aby uzyskać pożądane stężenie surowicy.Zaklemiej około 300 mililitrów pożywki w worku, używając dużych zacisków do worków. Dzięki temu wszystkie zaszczepione komórki zostaną wykorzystane podczas napełniania i żadne nie pozostaną w worku z pożywką. Umieść pożywkę na statywie do worków w celu przeprowadzenia szczepienia.Napełnić strzykawkę z podłączonym przewodem zawiesiną komórkową. Przymocować strzykawkę zawierającą zawiesinę komórkową do worka z pożywką za pomocą zgrzewania przewodów. Pozostawić około 16 cali przewodu od strzykawki do worka.Wstrzyknij zawiesinę komórkową do worka z medium i dokładnie wymieszaj. Zaszczepiony worek z medium można podłączyć do przewodów do obsługi cieczy w naczyniu o średnicy trzy ósemki cala poprzez spawanie przewodów lub przy użyciu złączy wielofunkcyjnych. Dzisiaj zastosujemy spawanie przewodów.Zamknij zaciski na przewodach do dozowania cieczy i przewodach płuczących naczynia. Umieść 36-warstwowe naczynie w CSM w pozycji załadunkowej. Zaczep przewód filtra odpowietrzającego w uchwycie mocującym w CSM.Dokręć pokrywkę i przesuń CSM do pozycji napełniania, aby umieścić filtr powietrza w najwyższym punkcie, co zapobiegnie jego zamoczeniu podczas procesu napełniania. Kąt 10 stopni umożliwia również wyrównanie poziomu cieczy w warstwach podczas napełniania, usuwając powietrze z linii napełniania. Ustaw worek z pożywką na tym samym poziomie co naczynie, utrzymując zamknięty zacisk rurki odprowadzającej.Otwórz zacisk rurki do obsługi cieczy oraz zacisk worka z medium, aby umożliwić dopływ płynu do naczynia. Za pomocą statywu na worek unieś worek z medium, aby ułatwić przepływ zawiesiny komórkowej do naczynia. Napełniaj naczynie, aż całe zaszczepione medium zostanie do niego przelane.W górnej części worka z pożywką powinno znajdować się nadal 300 ml pożywki. Zdejmij zacisk z worka z pożywką, aby kontynuować napełnianie naczynia, gdy ciecz zbliża się do górnego rozdzielacza powietrza. Zmniejsz szybkość napełniania, obniżając worek z pożywką, aby zapobiec przepełnieniu.Powoli doprowadź poziom cieczy do linii napełniania i zaklemuj dreny układu dozowania cieczy. Przesuń naczynie w CSM do pozycji izolacyjnej, ustawiając oba zestawy rozdzielaczy w najwyższym położeniu. Obniż worek z pożywką poniżej poziomu naczynia.Trzymając filtr płuczący w pozycji pionowej, otwórz zacisk rurki płuczącej. Spowoduje to opróżnienie lub wypłukanie medium z rurki do obsługi cieczy z powrotem do worka z medium. Po opróżnieniu rurki zamknij zacisk na rurce worka z medium.Utrzymując filtr rurki odprowadzającej w pozycji pionowej, otwórz zacisk na rurce do obsługi cieczy naczynia, aby umożliwić pozostałej cieczy wpłynięcie i wyrównanie poziomu w naczyniu. Odczekaj od jednej do dwóch minut, aż proces ten zostanie zakończony.Następnie obróć naczynie w module CSM tak, aby kolektory znajdowały się po lewej stronie. Obniż naczynie do pozycji załadunkowej w module CSM. Zamknij zaciski zarówno na przewodach odpływowych, jak i przewodach do obsługi cieczy.Worek z pożywką można teraz zdjąć z naczynia lub pozostawić go przytwierdzonym do wykorzystania później w procedurze zbioru. Aby przechować przymocowany worek z pożywką, należy go zwinąć i umieścić pod pasami mocującymi w tacy do przechowywania naczynia. Na koniec przenieś naczynie do inkubatora. Podczas przenoszenia naczynia należy uważać, aby żadna ciecz nie przedostała się do filtra odpowietrzającego.Osiąga się to poprzez lekkie pochylenie końca kolektora do góry. Aby rozpocząć procedurę zbioru, zespawaj rurkę z roztworem dysocjującym komórki oraz worki do gaszenia, tworząc zespół worków do zbioru; upewnij się, że wszystkie zaciski rurek są zamknięte. Wyjmij naczynie z inkubatora i umieść je w CSM w pozycji załadunkowej.Zwolnij worek z medium spod opasek mocujących i zawieś go na uchwycie. Stojąc obok, mocno zakręć pokrywkę, aby zabezpieczyć naczynie. Wepnij rurkę odpowietrzającą do zacisku mocującego i przesuń CSM do pozycji napełniania.Upewnij się, że worek z pożywką na statywie wisi niżej niż naczynie. Otwórz zacisk na drenie worka z pożywką oraz na drenie do transportu cieczy w naczyniu, aby umożliwić przepływ pożywki do podłączonego worka. Gdy naczynie będzie opróżnione w około trzech czwartych, zmień ustawienia CSM na końcową pozycję opróżniania.Gdy naczynie i przewody do przekazywania cieczy będą puste, unieś przewód, aby przepchnąć medium poza zacisk na przewodzie worka z zużytym medium. Następnie zamknij oba zaciski: ten na przewodzie do przekazywania cieczy oraz ten na przewodzie worka z zużytym medium. Wymień worek z zużytym medium na zestaw worka do zbioru, stosując spawanie przewodów.Za pomocą statywu do worków podnieś zespół worka do dysocjacji komórek powyżej wysokości naczynia. Umieść CSM w pozycji napełniania. Otwórz zacisk rurki z roztworem do dysocjacji komórek oraz zacisk zespołu worka do zbioru i przelej roztwór do naczynia.Po zakończeniu przenoszenia zamknij zaciski na przewodach układu dozowania cieczy oraz na przewodzie z roztworem do dysocjacji komórek. Następnie, trzymając otwartą dźwignię pozycjonowania poziomego, przesuń CSM do pozycji załadunku. Delikatnie kołysz naczyniem na boki za pomocą koła, rozprowadzając roztwór po warstwach komórek.Podczas kołysania naczynie można sporadycznie przywracać do pozycji napełniania, aby utrzymać równomierny rozkład roztworu. Po odpowiednim rozprowadzeniu roztworu należy zwolnić dźwignię w CSM, aby zablokować urządzenie w pozycji napełniania. Naczynie należy pozostawić w tej pozycji przez wymagany czas dysocjacji komórek.Użyj mętności jako wskaźnika do określenia stopnia odrywania się komórek. Po ich odłączeniu przenieś CSM do pozycji załadunkowej. Otwórz zacisk worka z medium gaszącym oraz zacisk rurki do obsługi cieczy, aby umożliwić wpłynięcie medium gaszącego do naczynia.Zamknij zacisk na przewodach układu dozowania cieczy. Po zakończeniu transferu przywróć CSM do pozycji załadunkowej i przytrzymaj dźwignię pozycjonowania poziomego, aby przechylić naczynie na boki. Korzystając ze stojaka na worki, obniż zespół worka do zbioru poniżej poziomu naczynia.Ustaw CSM w pozycji pustej. Otwórz zacisk rury do obsługi cieczy w zbiorniku i przenieś roztwór komórek z powrotem do worka do gaszenia. Przywróć CSM do pozycji załadunkowej i odłącz zespół worka do zbioru od zbiornika za pomocą zgrzewarki do rurek.Obecnie roztwór komórkowy jest gotowy do przetwarzania w tradycyjnych systemach hodowli komórek. W przypadku Headspace zawartość tlenu w pożywce ulega wyczerpaniu średnio o 50% w ciągu trzech dni. W hodowli wartość ta obrazuje spadek zawartości tlenu w miligramach na litr na poziomie komórek w czasie w tym samym systemie wzrostu; gradient tlenu przy wysokości pożywki wynoszącej 3 mm jest prawie o 50% większy na styku pożywki z Headspace niż na warstwie komórek.Przedstawiono procentową zawartość tlenu w przestrzeni tchawkowej stosu hypers podczas wzrostu komórek. Rysunek pokazuje, że w ciągu 96 godzin procentowa zawartość tlenu między warstwami, który zasila każde gazoprzepuszczalne dno filmu, pozostaje stała. Dowodzi to zdolności komórek do dostępu do tlenu podczas wzrostu do stanu konfluencji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak napełniać i zbierać produkt z naczynia typu stack Corning Hypers w systemie zamkniętym.

closed-system-cell-culture-protocol-using-hyperstack-vessels-with-gas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół hodowania komórek w układzie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiałów przepuszczających gaz

Koncepcja, wykonanie i walidacja platformy dodatkowej, która zapewnia zwiększoną kontrolę nad przestrzennym i czasowym natlenieniem w płytce 6-dołkowej. Urządzenie jest dostosowane do wielu systemów hodowli i może być wykorzystywane do badania wpływu tlenu na gojenie ran.

Wytwarzanie i obsługa wkładki tlenowej do adherentnych kultur komórkowych

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Opisano rotujący system hodowli komórkowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach fizjologicznych, co prowadzi do tworzenia trójwymiarowych agregatów komórkowych. Powstałe agregaty wykazują cechy podobne do tych obserwowanych in vivo, których nie stwierdzono w konwencjonalnych modelach hodowli, i służą jako dokładniejszy organotypowy system modelowy dla wielu badań naukowych.

Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Ten protokół opisuje metodę tymczasowej przepuszczalności przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego. Technika ta ułatwia przenoszenie materiału genetycznego i biomolekuł do przylegających komórek ssaków poprzez wykorzystanie sił mechanicznych do przerwania błony plazmatycznej.

Przepuszczalność przylegających komórek za pomocą strumienia gazu obojętnego

Regulacja składników odżywczych za pomocą ciągłego karmienia dostosowanego do wzrostu poprawia tempo wzrostu sferoid komórek ssaków w porównaniu do przerywanego karmienia partiami dla kultur w bioreaktorach z mieszaną zawiesiną.  Niniejsze badanie demonstruje metody wymagane do ustalenia prostych kultur karmionych o skorygowanej dawce.

Regulacja składników odżywczych poprzez ciągłe karmienie w celu ekspansji komórek ssaków w sferoidach na dużą skalę

Oto protokół do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i nerwowych komórek macierzystych (NSC) w zamkniętym systemie hodowli komórek, który pozwala na maksymalną sterylność i odtwarzalność, zastępując tradycyjną komorę bezpieczeństwa biologicznego i inkubator. To urządzenie spełnia wytyczne dobrej klinicznej praktyki produkcyjnej (cGMP) i dobrej praktyki klinicznej (cGLP).

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Prezentujemy mikroprzepływowy model raka na chipie, technologię "Akcelerator Ewolucji", która zapewnia kontrolowaną platformę do długoterminowych badań ilościowych dynamiki raka w czasie rzeczywistym w dobrze zdefiniowanych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki. Oczekuje się, że technologia ta sprawdzi się jako model in vitro do badań podstawowych lub przedklinicznego opracowywania leków.

Generowanie heterogenicznych gradientów leków w różnych populacjach nowotworów w akceleratorze ewolucji mikroprzepływowej do obserwacji w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół pobierania przylegających komórek z wielowarstwowych kolb w zamknięty półautomatyczny sposób za pomocą systemu wirowania przeciwprądowego. Protokół ten może być stosowany do zbierania zarówno komórek przylegających, jak i zawiesinowych z innych platform do rozbudowy komórek z niewielkimi modyfikacjami istniejących etapów.

Przetwarzanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań klinicznych przy użyciu zamkniętego, półautomatycznego przepływu pracy

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający produkcję na dużą skalę komórek przylegających za pomocą całkowicie zamkniętego systemu opartego na rozpuszczalnych mikronośnikach klasy GMP. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, komórek HEK293T i komórek Vero została zwalidowana i spełniła zarówno wymagania ilościowe, jak i kryteria jakościowe dla branży terapii komórkowej i genowej.

Produkcja ogniw na dużą skalę w oparciu o rozpuszczalne porowate mikronośniki klasy GMP

Poznaj protokół hodowli komórkowej w zamkniętym systemie HYPERStack z materiałami przepuszczalnymi dla gazów. Ta metoda zwiększa wydajność pobierania komórek przy zachowaniu sterylności.

Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiałów przepuszczalnych dla gazów (Wideo) | JoVE Journal

Protokół hodowli komórkowej w systemie zamkniętym z wykorzystaniem naczyń HYPERStack z technologią materiału przepuszczającego gazy

Przeglądaj więcej filmów