Name: Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych (LCP) z zastosowaniem testu LCP-FRAP. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości kryształów do analizy rentgenowskiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana z grantów NIH nr GM073197 oraz RR025336.

Typowy schemat eksperymentu krystalizacji in meso przedstawiono na Rys. 11,2. Analizy LCP-FRAP poprzedzające krystalizację są opcjonalne; mogą one jednak znacząco przyspieszyć proces poszukiwania wstępnych warunków krystalizacji, szczególnie w przypadku trudnych białek błonowych3.
1. Rekonstytucja białka w LCP
<ol>
<li>Oczyścić interesujące białko błonowe w roztworze detergentu i zagęścić kompleksy białko/detergent do stężenia ~10 - 20 mg/mL, dbając o to, aby nie przekroczyć optymalnego stężenia detergentu1,4.</li>
<li>Przenieść ~25 mg lipidy gospodarza LCP (zazwyczaj monooleiny) lub mieszaniny lipidów do plastikowej probówki o pojemności 1,5 mL i inkubować w temperaturze 40 °C przez kilka minut, aż lipid się stopi.</li>
<li>Zamocować łącznik strzykawek do szczelnej strzykawki o pojemności 10 μL.</li>
<li>Napełnić strzykawkę stopionym lipidem za pomocą pipety o regulowanej objętości. Zapisać objętość lipidu w strzykawce.</li>
<li>Napełnić drugą strzykawkę o pojemności 10 μL roztworem białka, zachowując stosunek objętości roztworu białka do lipidu 2/3 v/v.</li>
<li>Połączyć obie strzykawki za pomocą łącznika.</li>
<li>Naprzemiennie przesuwać tłoki strzykawek, aby przemieszczać lipid i białko przez wewnętrzną igłę łącznika w przód i w tył, aż mezofaza lipidowa stanie się homogeniczna. LCP tworzy się samoistnie podczas mieszania mechanicznego, a białko zostaje wbudowane w dwuwarstwę lipidową LCP. Powstanie LCP można zweryfikować po jego przezroczystej, żelowatej konsystencji oraz braku dwójłomności w badaniu pod mikroskopem wyposażonym w polaryzatory skrzyżowane lub, jeśli to możliwe, za pomocą małokątowego rozproszenia promieni rentgenowskich1.</li>
</ol>
2. Testy LCP-FRAP przed krystalizacją
Analizy LCP-FRAP służą do pomiaru właściwości dyfuzyjnych białek błonowych zrekonstytuowanych w LCP w różnych warunkach przesiewowych3. Dyfuzja dalekozasięgowa białek błonowych w LCP jest niezbędna do pomyślnej krystalizacji; jednak mikrostruktura LCP ogranicza dyfuzję dużych białek lub oligomerycznych agregatów białkowych. Częstą przyczyną niepowodzenia eksperymentu krystalizacji in meso jest szybka agregacja białek prowadząca do utraty dyfuzji. Wykazano, że zachowanie agregacyjne białka zależy od konkretnego konstruktu białkowego, gospodarza lipidowego oraz składu roztworu przesiewowego3.
<ol>
<li>Oznakuj białko barwnikiem fluorescencyjnym (Cy3 lub podobnym), stosując stosunek białko/barwnik wynoszący ok. 10/1, usuń niezwiązany barwnik i zagęść białko do stężenia ok. 1 mg/ml. Oznakuj wolne grupy aminowe lub wolne grupy tiolowe. W przypadku znakowania wolnych grup aminowych zastosuj pH od 7 do 7,5, aby przede wszystkim oznakować wolny koniec N. Należy pamiętać, że znakowanie grup aminowych może prowadzić również do oznakowania lipidów współoczyszczonych z białkiem.2,3.</li>
<li>Rekonstytuować znakowane białko w LCP zgodnie z opisem w sekcji 1).</li>
<li>Przygotować płytki analityczne zgodnie z opisem w sekcji 3), stosując roztwory przesiewowe LCP-FRAP zamiast ekranów krystalizacyjnych2.</li>
<li>Inkubować płytki w temperaturze 20 °C w ciemności przez co najmniej 12 godzin w celu osiągnięcia stanu równowagi.</li>
<li>Umieść jedną z płytek na stanowisku LCP-FRAP i ustaw ostrość na pierwszej studzience, korzystając z obiektywu 10x.</li>
<li>Należy zarejestrować 5 obrazów fluorescencyjnych, aby utrwalić początkowy stan przed wybieleniem.</li>
<li>Uruchom laser. Moc lasera oraz liczba impulsów powinny zostać tak dostosowane, aby wybielić od ok. 30% do 70% znakowanego białka w środku wybielonej plamki.</li>
<li>Bezpośrednio po wyzwoleniu lasera należy rozpocząć rejestrację szybkiej sekwencji po fotowybielaniu, obejmującej ok. 20 obrazów, z najwyższą możliwą częstotliwością.</li>
<li>Następnie należy zarejestrować powolną sekwencję po wybielaniu składającą się z około 50 obrazów, wybierając opóźnienie między obrazami w zakresie 1–20 s, w zależności od szybkości dyfuzji białka.</li>
<li>Zintegruj natężenie wewnątrz obszaru wybielonego we wszystkich klatkach i skoryguj je pod kątem wybielania oraz wahań natężenia światła podczas akwizycji, dzieląc natężenie wewnątrz wybielonego obszaru przez średnie natężenie obszaru referencyjnego znajdującego się poza strefą wybielania laserowego.</li>
<li>Znormalizuj skorygowaną intensywność tak, aby intensywność przed wybieleniem była równa 1, a początkowa intensywność po wybieleniu była równa 0.</li>
<li>Wyznacz dopasowanie krzywej zaleźności znormalizowanej intensywności od czasu, F(t), korzystając z następującego równania5: 
	F(t) = M x exp(-2T/t) x (I0(2T/Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) + I1(2T/t)), (Równ. 1) 
gdzie M oznacza frakcję mobilną dyfundujących cząsteczek, a T to charakterystyczny czas dyfuzji, t jest rzeczywistym czasem każdej zarejestrowanej klatki, I0 i ja1 czy są 0th i 1st rzędy zmodyfikowanych funkcji Bessela.</li>
<li>Oblicz współczynnik dyfuzji, D, według wzoru: 
	D = R2/4T, (Równ. 2) 
gdzie R to promień wybielonej plamki.</li>
<li>Przejdź do kolejnej studzienki i powtórz kroki od 2.5) do 2.13).</li>
<li>Porównaj frakcje mobilne i współczynniki dyfuzji uzyskane dla różnych warunków przesiewowych. Zaprojektuj nowe ekrany krystalizacyjne w oparciu o składniki, które ułatwiały dyfuzję białka, wykluczając warunki, w których nie zaobserwowano dyfuzji białka. Jeśli białko nie dyfundowało w żadnym z przetestowanych warunków, rozważ rozszerzenie przestrzeni przesiewowej lub wypróbowanie nowej konstrukcji białka.</li>
</ol>
3. Przygotowanie prób krystalizacji LCP
<ol>
<li>Rekonstytuuj białko w LCP zgodnie z opisem w sekcji 1).</li>
<li>Przenieś LCP zawierające białko do szczelnej strzykawki o objętości 10 μL zamocowanej do dozownika strzykawkowego z powtarzalnym dozowaniem.</li>
<li>Do strzykawki 10 μL przymocuj krótką, wymienną igłę (rozmiar 26 G, długość 10 mm).</li>
<li>Nanieś krople (bolusy) LCP o objętości 20 nL na powierzchnię czterech sąsiednich dołków, tworzących kwadrat 2x2.</li>
<li>Na każdą kropkę LCP nałóż 1 μL odpowiedniego roztworu z ekranu krystalizacyjnego.</li>
<li>Przykryj cztery wypełnione dołki kwadratowym szkiełkiem przedmiotowym o boku 18 mm. Delikatnie dociśnij szkiełko, aby uszczelnić dołki.</li>
<li>Powtarzaj kroki 3.4)–3.6) dla kolejnych zestawów 4 dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona.</li>
<li>Inkubuj płytkę w stałej temperaturze, okresowo sprawdzając formowanie i wzrost kryształów.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie kryształów z LCP
<ol>
<li>Umieść płytkę z kryształami białek pod stereomikroskopem z regulowanym powiększeniem, wyposażonym w liniowy polaryzator obrotowy i analizator.</li>
<li>Ustaw ostrość na wybrane wgłębienie, korzystając z niskiego powiększenia, tak aby całe wgłębienie znajdowało się w polu widzenia.</li>
<li>Narysuj na szklanym przykryciu cztery linie, tworząc kwadrat w obrębie wgłębienia, używając ostrego narożnika ceramicznego kamienia tnącego do kapilar.</li>
<li>Przyciśnij krawędzie naciętego obrysu za pomocą mocnej pęsety z ostrymi końcami, aby przenieść zarysowania przez całą grubość szkła przykrycia.</li>
<li>Wywierć dwa małe otwory w przeciwległych narożnikach naciętego kwadratu.</li>
<li>Wstrzyknij kilka μL roztworu precypitanta przez jeden z otworów, aby zmniejszyć odwodnienie podczas kolejnych etapów.</li>
<li>Używając pod kątem ostrej igły sondy, rozłam szkło wzdłuż jednego lub dwóch boków, aby uwolnić wycięty kwadrat.</li>
<li>Ostrożnie podnieś szklany kwadrat, obserwując grudkę fazy kubicznej. Jeśli grudka przylega do przykrycia, obróć szklany kwadrat i połóż go na dnie wgłębienia.</li>
<li>Dodaj dodatkowe kilka μL roztworu precypitanta, w razie potrzeby uzupełnionego o krioprotektant, na wierzch odsłoniętej grudki fazy kubicznej we wgłębieniu.</li>
<li>Zwiększ powiększenie mikroskopu i ustaw ostrość na kryształ.</li>
<li>Dostosuj kąt między polaryzatorem a analizatorem, aby zwiększyć kontrast między dwójłomnym kryształem a tłem, zachowując jednocześnie wystarczającą ilość światła, aby widzieć pętlę do zbierania kryształów.</li>
<li>Wybierz MiTeGen MicroMount o średnicy odpowiadającej wielkości kryształu, a następnie pobierz kryształ bezpośrednio z LCP, zagarniając go do MicroMount.</li>
<li>Szybko zamroź MicroMount z pobranym kryształem w ciekłym azocie, a następnie wyślij go na linię wiązki źródła synchrotronowego w celu zebrania danych rentgenowskich6.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Zmodyfikowany ludzki receptor beta 2 adrenergiczny sprzęgany z białkiem G (β2AR-T4L) wyekspresowano w zainfekowanych bakulowirusem komórkach owadzie sf9 i oczyszczono w roztworze detergentu dodecylmaltosyd (DDM)/hemisukcynian cholesterylu (CHS) w obecności częściowego odwrotnego agonisty, karazololu7. Białko znakowano estrem Cy3 NHS i wykorzystano w testach prekrystalizacyjnych LCP-FRAP (Rysunek 2). Wstępne przesiewania na siatkach w kilku warunkach wybranych na podstawie wyników testów LCP-FRAP pozwoliły uzyskać pierwsze obiekty przypominające kryształy (Rysunek 3). Dalsza optymalizacja warunków wytrącania doprowadziła do otrzymania kryształów o jakości dyfrakcyjnej (Rysunek 4).
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Schemat procesu krystalizacji białek; obejmuje rekonstytucję LCP, próby krystalizacji, analizę rentgenowską." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat typowego eksperymentu krystalizacji w LCP. Kroki w szarych polach nie są opisane w obecnych protokołach.
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Analiza frakcji mobilnej, wykres powrotu fluorescencji, związki Na, rozdział chromatograficzny, kinetyka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. analiza LCP-FRAP z wykorzystaniem β2AR-T4L/karazolol w LCP na bazie monooleiny. A) Wyniki testu LCP-FRAP przeprowadzonego w automatycznym trybie wysokoprzepustowym, w którym każda próbka na płytce 96-dołkowej jest wybełana sekwencyjnie, a powrót fluorescencji mierzony jest po 30-minutowej inkubacji. Wyznaczone wartości powrotu fluorescencji, reprezentujące frakcję mobilną w każdej próbce, przedstawiono dla wszystkich 96 próbek. Roztwory przesiewowe zawierają 0,1 M Tris pH 8, 30% v/v PEG 400 w połączeniu z 48 różnymi solami w dwóch różnych stężeniach. B) Profile powrotu fluorescencji dla kilku reprezentatywnych warunków. Linie ciągłe reprezentują dopasowania zgodnie z równaniem 1. Frakcje mobilne i współczynniki dyfuzji wyznaczono przy użyciu równań 1 i 2. Szybki powrót na poziomie poniżej 10% w próbce zawierającej chlorek sodu wynika z obecności lipidów znakowanych fluorescencyjnie, które zostały współoczyszczone z białkiem.
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, analiza złuszczonych komórek, przedstawiająca morfologię komórek, pasek skali 10 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wstępne wyniki krystalizacji β2Kompleks AR-T4L/karazolol uzyskany w drodze wstępnego przesiewu siatkowego (coarse grid screening) wokół najbardziej obiecujących warunków zidentyfikowanych metodą LCP-FRAP, zawierający siarczan sodu (panel A) i mrzeczan sodu (panel B). Białko zostało znakowane estrem NHS Cy3, a obrazy fluorescencyjne wykonano przy wzbudzeniu przy 543 nm i emisji przy 605 nm. 
<img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopowy procesu krystalizacji; etapy A-D; mikroskopia optyczna; skala 10 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Zoptymalizowane kryształy β2AR-T4L/karazolol. Zdjęcia kryształów wyhodowanych w obecności siarczanu sodu (panele A i B) oraz mrany potasu (panele C i D) wykonano w trybie jasnego pola (panele A i C) oraz przy użyciu polaryzatorów skrzyżowanych (panele B i D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Protokoły zapewniają podstawowe wskazówki wizualne dotyczące głównych etapów przeprowadzania eksperymentów krystalizacji in meso. Bardziej szczegółowe informacje związane z tymi protokołami, ze szczególnym uwzględnieniem potencjalnych pułapek, niedociągnięć lub alternatywnych metod, są dostępne w innych źródłach1,2. Opcjonalne testy LCP-FRAP mogą pomóc na wcześniejszych etapach w wyborze najbardziej obiecującej konstrukcji białka, lipidów gospodarza LCP i dodatków lipidowych, a także w ograniczeniu zakresu możliwych precypitantów i warunków buforowych3. Po znalezieniu wstępnego sukcesu krystalizacyjnego (tzw. hitu), należy go zoptymalizować w celu uzyskania kryształów lepszej jakości. Optymalizacja warunków krystalizacji in meso jest w zasadzie podobna do optymalizacji warunków dla białek rozpuszczalnych, z dodatkiem parametrów związanych ze składem LCP1. Kryształy białek błonowych hodowane w mezofazie lipidowej są zazwyczaj mniejsze niż kryształy otrzymywane w roztworach detergentów, ale są bardziej uporządkowane, co sprawia, że znacząco zyskują one dzięki zastosowaniu linii wiązek mikroogniskowych dostępnych w nowoczesnych źródłach synchrotronowych6.
Wiele procedur związanych z krystalizacją in meso, w tym przygotowywanie płytek do krystalizacji lub analiz, przeprowadzanie testów LCP-FRAP oraz detekcja kryształów, zostało częściowo lub w pełni zautomatyzowanych1,2,8,9, co pozwala na przesiewanie szerokiego zakresu warunków przy zużyciu niewielkich ilości białka i lipidów. Z drugiej strony, rekonstytucja białek w LCP oraz wycinanie kryształów pozostają operacjami manualnymi i bardziej żmudnymi, przez co istnieje potrzeba ich udoskonalenia.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka gazoszczelna 100 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>Wymagane są 2 strzykawki</td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna 10 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik strzykawek</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>Łącznik można wykonać z dostępnych części, zgodnie z opisem w ref. 10</td></tr><tr><td>Repetytory do strzykawek</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>Repetytor do strzykawek można zmodyfikować, aby zmniejszyć objętość dozowania około 3-krotnie&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Krótka (0,375&amp;#8221;) zdejmowana igła z płaskim zakończeniem (styl punktu 3, rozmiar 26 G)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Szklana płytka typu sandwich z 96 dołkami</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>W przypadku operacji manualnych wygodniej jest złożyć szklaną płytkę typu sandwich, używając standardowych szkiełek mikroskopowych i dwustronnej taśmy klejącej z wyciętymi otworami&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Szklany zakrywek</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monooleina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Ekran krystalizacji</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>Większość dostępnych komercyjnych ekranów może być stosowana do wstępnego przesiewu. Warunki, które konsekwentnie zaburzają LCP, można rozcieńczyć 2x w celu uzyskania lepszej kompatybilności&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Kamień do cięcia kapilar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Kątowa ostra sonda</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Należy dobrać średnicę MicroMount dopasowaną do rozmiaru kryształu</td></tr></tbody></table>

krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Białka błonowe pełnią w żywych komórkach krytyczne funkcje związane z transdukcją sygnałów, transportem i przemianami energii, a w związku z tym są uwikłane w liczne dysfunkcje i choroby. Jednakże rozumienie strukturalne i funkcjonalne białek błonowych znacznie odstaje od wiedzy na temat ich rozpuszczalnych odpowiedników, głównie ze względu na trudności związane z ich solubilizacją i otrzymywaniem kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Krystalizacja w mezofazach lipidowych (znana również jako krystalizacja in meso lub LCP) jest obiecującą techniką, która została z sukcesem zastosowana do uzyskania struktur o wysokiej rozdzielczości mikrobialnych rhodopsyn, białek fotosyntetycznych, beta-beczek błony zewnętrznej oraz receptorów sprzężonych z białkiem G. Krystalizacja in meso wykorzystuje środowisko błonowe zbliżone do naturalnego i zazwyczaj pozwala na otrzymanie kryształów o niższej zawartości rozpuszczalnika i lepszym uporządkowaniu w porównaniu z tradycyjną krystalizacją z roztworów detergentów. Metoda ta nie jest trudna, lecz wymaga zrozumienia zachowania faz lipidowych oraz wprawy w obchodzeniu się z lepkimi materiałami mezofazowymi. Prezentujemy tutaj prosty i wydajny sposób przygotowania LCP oraz rekonstytucji białka błonowego w dwuwarstwie lipidowej LCP przy użyciu mieszalnika strzykawkowego, a następnie dozowania nanolitrowych porcji LCP na płytkę analityczną lub krystalizacyjną, przeprowadzanie testów przedkrystalizacyjnych oraz pozyskiwanie kryształów z matrycy LCP. Protokoły te stanowią podstawowy przewodnik po próbach krystalizacji in meso; jednak, jak w każdym eksperymencie krystalizacyjnym, wymagane jest szerokie przesiewanie i optymalizacja, a pomyślny wynik nie jest w pełni gwarantowany.

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Białka błonowe pełnią w żywych komórkach krytyczne funkcje związane z transdukcją sygnałów, transportem oraz przekształceniami energetycznymi i w związku z tym są ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest otrzymanie wysokiej jakości kryształów białka błonowego w celu wyznaczenia jego struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Osiąga się to poprzez rekonstytucję białka w błonie fazy kubicznej lipidów i inkubację z roztworem precypitantu, co indukuje nukleację i wzrost kryształów dzięki ogromnej przestrzeni krystalizacji oraz ograniczonym informacjom zwrotnym z eksperymentów krystalizacyjnych. Test krystalizacji LCP Frap Prec, oparty na fluorescencyjnym powrocie po fotobleakingu w fazie kubicznej lipidów, został opracowany w celu wyłonienia najbardziej obiecujących warunków krystalizacji.Metoda ta pozwala ograniczyć zakres przesiewu i zwiększa szanse na uzyskanie pierwszych sukcesów w krystalizacji. Po zidentyfikowaniu wstępnych kryształów przeprowadza się próby optymalizacyjne w celu poprawy wzrostu kryształów. Na koniec zoptymalizowane kryształy są zbierane i mrożone w ciekłym azocie w celu przeprowadzenia pomiarów w źródle synchrotronowym.Wyniki wykazują efektywne zastosowanie testu LCP FRA w celu uzyskania pierwszych kryształów receptora beta-2 adrenergicznego w LCP, z których dalsza optymalizacja pozwoliła otrzymać kryształy o jakości dyfrakcyjnej. Technika ta wykorzystuje naturalne środowisko błonowe zapewniane przez powtarzalną fazę kubiczną i zazwyczaj prowadzi do powstania kryształów o niskiej zawartości rozpuszczalnika i lepszym uporządkowaniu w porównaniu z krystalizacją w roztworach detergentów. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na wysoką lepkość i właściwości tiksotropowe faz lipidowych, co sprawia, że materiały te są trudne w obsłudze.Jednakże, przy zastosowaniu odpowiednich narzędzi i opanowaniu techniki, procedura ta nie jest trudniejsza od jakiejkolwiek innej techniki krystalizacji białek i nadaje się do automatyzacji oraz wysokiej przepustowości. Zacznijmy zatem. Oczyść interesujące białko błonowe w roztworze detergentu i zagęść kompleksy białkowo-detergentowe do stężenia około 10 do 20 mg/ml.Przenieś około 25 mg lipidy gospodarza LCP lub mieszaniny lipidów do plastikowej probówki i inkubuj w temperaturze 40 °C przez kilka minut, aż lipid się roztopi. Następnie przymocuj łącznik strzykawki do strzykawki szczelnej gazowo o pojemności 100 µL. Napełnij strzykawkę roztopionym lipidem za pomocą pipety o regulowanej objętości.Zapisz objętość lipidu w strzykawce, a następnie napełnij drugą strzykawkę o pojemności 100 µL taką ilością roztworu białka, aby stosunek objętości roztworu białka do lipidu wynosił od 2 do 3. Połącz obie strzykawki za pomocą łącznika do strzykawek. Przesuwaj naprzemiennie tłoki strzykawek, aby przemieszczać lipid i białko przez wewnętrzną igłę łącznika w przód i w tył, aż mezo faza lipidowa stanie się homogeniczna.LCP tworzy się spontanicznie podczas mieszania mechanicznego, a białko ulega rekonstytucji w dwuwarstwie lipidowej LCP. Powstanie LCP można zweryfikować na podstawie jego przezroczystości i żelowej konsystencji oraz braku dwójłomności w badaniu pod mikroskopem wyposażonym w polaryzatory skrzyżowane lub, jeśli to możliwe, za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej w małych kątach. Aby rozpocząć testy FRAP w LCP, należy znakować białko barwnikiem fluorescencyjnym w stosunku białka do barwnika wynoszącym około 100:1, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Usunąć niereaktywny barwnik i zagęścić białko do stężenia około 1 mg/ml. Następnie zrekonstytuować znakowane białko w LCP w ten sam sposób, w jaki zrobiono to w przypadku białka nieznakowanego. Przygotować płytki do analizy.Użycie roztworów przesiewowych do powłok LCP. Najpierw przenieść LCP zawierające białko do strzykawki szczelnej gazowo o objętości 10 µL, przymocowanej do dozownika strzykawkowego z funkcją powtarzalności, a następnie dołączyć krótką, wymienną igłę do strzykawki 10 µL. Nanieść bolusy LCP o objętości 200 nL na powierzchnię czterech sąsiadujących studzienek, tworząc kwadrat 2x2; każdy z bolusów LCP przykryć 1 µL odpowiedniego roztworu przesiewowego LCP FRA.Po dozowaniu roztworu przesiewowego, przykryj cztery załadowane dołki kwadratowym szkiełkiem nakrywnym o boku 18 mm. Delikatnie dociśnij szkiełko, aby uszczelnić dołki. Powtarzaj ten proces dla kolejnych zestawów czterech dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona.Po napełnieniu przykryć płytkę folią. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez co najmniej 12 godzin. Aby osiągnąć stan równowagi, umieścić jedną z płytek na stacji LCP Frap i ustawić ostrość na pierwszym dołku, korzystając z obiektywu 10x.Pozyskiwanie danych FRAP jest przeprowadzane automatycznie za pomocą skryptu Image Pro, w którym użytkownik najpierw wprowadza wszystkie parametry akwizycji, a następnie naciska przycisk start. Typowa sekwencja pozyskiwania rozpoczyna się od zarejestrowania pięciu obrazów przed wybielaniem, następnie uruchamia laser wybielający zsynchronizowany ze strumieniowaniem szybkiej sekwencji powrotu obejmującej około 200 obrazów z maksymalną możliwą prędkością, po czym następuje wykonanie wolnej sekwencji powrotu składającej się z 50 obrazów z odstępami od 1 do 20 sekund między obrazami, w zależności od szybkości dyfuzji białka. Po zakończeniu zbierania danych należy zintegrować intensywność wewnątrz plamki wybielonej oraz w plamkach referencyjnych umieszczonych poza obszarem wybielonym laserem we wszystkich klatkach w celu dokonania korekty.Krzywa zintegrowanej intensywności dla odchyleń spowodowanych fluktuacjami światła i blaknięciem podczas akwizycji danych normalizuje skorygowaną intensywność tak, aby intensywność przed blaknięciem była równa jednej, a początkowa intensywność po blaknięciu równa zeru; dopasuj krzywą znormalizowanej intensywności w funkcji czasu zgodnie z opisem w protokole pisemnym, aby wyznaczyć frakcję mobilną oraz współczynnik dyfuzji. Powtórz tę procedurę dla kolejnych próbek, a następnie porównaj frakcje mobilne i współczynniki dyfuzji uzyskane dla różnych warunków przesiewu. Zaprojektuj nowe ekrany krystalizacji w oparciu o komponenty, które ułatwiały dyfuzję białek, wykluczając warunki, w których nie zaobserwowano dyfuzji białek, aby przygotować próby krystalizacji LCP.Rekonstytuuj białko w LCP jak wcześniej, następnie przygotuj płytki krystalizacyjne analogicznie jak dla LCP frap, ale z użyciem roztworów do screeningu krystalizacji. Alternatywnie, po przygotowaniu płytek krystalizacyjnych, próby krystalizacji można ustawić robotycznie; inkubuj je w stałej temperaturze, okresowo sprawdzając formowanie i wzrost kryształów. Po urośnięciu kryształów białka, umieść płytkę z kryształami pod mikroskopem stereoskopowym ze zmiennym przybliżeniem, wyposażonym w liniowy polaryzator obrotowy i analizator.Ustawiając niski powiększenie zoomu, skup się na interesującej studience tak, aby cała studienka znajdowała się w polu widzenia. Nacinaj szkiełko nakrywkowe czterema pociągnięciami, tworząc kwadrat w obrębie granic studienki za pomocą ostrego narożnika ceramicznego kamienia do cięcia kapilar. Dociśnij krawędzie wzdłuż naciętego obwodu za pomocą ostrych pęset, aby pogłębić zarysowania przez całą grubość nakrywki.W szkiełku przedmiotowym wykonaj dwa małe otwory w przeciwległych narożnikach naciętego kwadratu. Przez jeden z otworów wstrzyknij kilka µL roztworu precypitantu, aby ograniczyć dehydratację podczas kolejnych etapów. Używając ostrej igły pod kątem, rozbij szkło wzdłuż jednego lub dwóch boków, aby uwolnić wycięty kwadrat.Ostrożnie podnieś szklany kwadrat, obserwując bolus fazy kubicznej. Jeśli to konieczne, dodaj na wierzch odsłoniętego bolusa fazy kubicznej w studzience dodatkowe kilka mikrolitrów roztworu wytrącającego z dodatkiem krioprotektanta, zwiększ powiększenie mikroskopu i ustaw ostrość na kryształ. Dostosuj kąt między polaryzatorem a analizatorem, aby zwiększyć kontrast między kryształem a tłem, zachowując jednocześnie wystarczającą ilość światła, by widzieć pętlę do zbierania kryształów.Następnie usunąć nadmiar lipidów i pobrać kryształ bezpośrednio z LCP, przekładając go do uchwytu micro mount firmy Mighty Genc, którego średnica została dobrana tak, aby odpowiadała rozmiarowi kryształu. Zamrozić uchwyt micro mount z pobranym kryształem w ciekłym azocie i przetransportować go do linii wiązki źródła synchrotronowego w celu przeprowadzenia pomiarów dyfrakcyjnych danych rentgenowskich. Zmodyfikowany beta 2 adrenergic receptor został znakowany za pomocą S SI3 NHS ester i wykorzystany w testach prekrystalizacji LCP-FRAP w automatycznym trybie wysokoprzepustowym, w którym każda próbka z płytki 96-dołkowej jest kolejno wybielana, a następnie mierzono powrót fluorescencji po 30 minutowej inkubacji. Uzyskane wartości powrotu fluorescencji, reprezentujące frakcję mobilną w każdej próbce, zostały naniesione na wykres dla wszystkich 96 próbek.Roztwory przesiewowe zawierają 0,1 molowy TRIS o pH 8, 30% obj. PEG 400, połączone z 48 różnymi solami w dwóch różnych stężeniach. Przedstawiono profile powrotu fluorescencji dla kilku reprezentatywnych warunków. Krzywe z linią ciągłą reprezentują dopasowania znormalizowanej intensywności w funkcji czasu; szybki powrót na poziomie poniżej 10% w próbce zawierającej NaCl wynika z obecności lipidów znakowanych fluorescencyjnie.Współoczyszczone z białkiem pierwsze kryształy receptora beta2-adrenergicznego w kompleksie z ololem uzyskano za pomocą screeningu na grubej siatce wokół najbardziej obiecujących warunków zidentyfikowanych przez LCP Frap, zawierających siarczan sodu i mrówczan sodu. Dalsza optymalizacja warunków wytrącania pozwoliła na uzyskanie kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Poniżej przedstawiono obrazy kryształów wyhodowanych w obecności siarczanu sodu i mrówczanu potasu, wykonane w trybie jasnego pola.Te same kryształy można również oglądać przy użyciu polaryzatorów skrzyżowanych. Po opanowaniu techniki, rekonstytucja białka w lipidowych fazach sześciennych może zostać przeprowadzona w ciągu 10 do 15 minut, a ręczne przygotowanie 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej w ciągu jednej godziny. Analiza L three B wrap w trybie wysokim wymaga około dwóch godzin na jedną 96-dołkową płytkę, a H crystal zajmuje około 10 do 20 minut na dołek. Procedury przedstawione w tym filmie stanowią podstawowy przewodnik po próbach krystalizacji białek.Jednak, jak w każdym eksperymencie krystalizacyjnym, wymagane jest przeprowadzenie szerokiego screeningu i optymalizacji, a pomyślny wynik nie jest gwarantowany.

crystallization-of-membrane-proteins-in-lipidic-mesophases

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krystalizacja białek błonowych w fazach lipidowych mezofazowych

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny...

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Poznaj metodę krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych (LCP) z zastosowaniem testu LCP-FRAP. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości kryształów do analizy rentgenowskiej.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Przeglądaj więcej filmów