Name: Obrazowanie zmiany kształtu komórki w żywych zarodkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę obrazowania zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila melanogaster przy użyciu konfokalnej mikroskopii czasowo-rozdzielczej z sondami GFP. Technika ta umożliwia badanie dynamicznych procesów rozwojowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność Ericowi Wieschausowi, który zapewnił podstawy, na których opracowano niniejszy protokół. Nasza praca jest wspierana przez Verna &amp; Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Start-up Award, Baylor College of Medicine.

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
<li>Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+genetic+basis+of+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the genetic basis of neural tube defects.</a> Clin Genet. 71, 295-310 (2007).</li>
<li>Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+tube+morphogenesis+during+Drosophila+tracheal+development+requires+Piopio%2C+a+luminal+ZP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein.</a> Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
<li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li>
<li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół umożliwi obrazowanie konfokalne na żywo szeregu zmian kształtu komórek w rozwijającym się zarodku muchy. Linie GFP do obrazowania mogą zostać przygotowane przez poszczególne laboratoria (Tabela 2), lecz wiele takich linii jest również ogólnodostępnych w centrach takich jak Bloomington Drosophila Stock Center na Uniwersytecie w Indianie (<a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a>) oraz FlyTrap Stock Center na Uniwersytecie Yale (<a href...

<table><tbody><tr><td>Lamelki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Kryszki 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Butelki z atomizerem (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Gruszki do małych pipet, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do scyntylacji z zakrętkami</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki Tri-Corn, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego BD Falcon 60x15mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek BD Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Żółte końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Siatka ze stali nierdzewnej, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura 5&amp;#190; cala</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny P4</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Gumki recepturki</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma Scotch, &amp;frac12; cala</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Pędzle malarskie Robert Simmons Expression E85 okrągłe nr 2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont nr 5 wysokiej precyzji Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Olej Halocarbon 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar BD Bacto</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Kwas p-hydroksybenzoesowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Aktywne drożdże suszone Red Star</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe, składane w C</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmocniona folia aluminiowa</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% sok jabłkowy</td><td>Ocean Spray lub Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych zarodkach drosophila

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Rozwijający się embrion Drosophila melanogaster przechodzi szereg zmian kształtu komórek, które są bardzo podatne na obrazowanie konfokalne żywych tkanek. Zmiany kształtu komórek u muchy są analogiczne do tych występujących u organizmów wyższych i napędzają morfogenezę tkanek. W związku z tym, w wielu przypadkach ich badanie ma bezpośrednie znaczenie dla zrozumienia chorób ludzkich (Tabela 1)1-5. W skali subkomórkowej zmiany kształtu komórek są wynikiem procesów obejmujących od ekspresji genów po transdukcję sygnałów, polaryzację komórek, przebudowę cytoszkieletu i transport błonowy. Tym samym embrion Drosophila dostarcza nie tylko kontekstu do oceny zmian kształtu komórek w odniesieniu do morfogenezy tkanek, ale oferuje również w pełni fizjologiczne środowisko do badania procesów subkomórkowych, które nadają kształt komórkom.
Opisany tutaj protokół został opracowany w celu obrazowania specyficznej zmiany kształtu komórek nazywanej cellularyzacją. Cellularyzacja jest procesem gwałtownego wzrostu błony plazmatycznej, który ostatecznie przekształca embrion syncytialny w komórkową blastodermę. Oznacza to, że w interfazie 14. cyklu mitotycznego błona plazmatyczna jednocześnie uwypukla się do wewnątrz wokół każdego z około 6000 jąder zakotwiczonych w korze, tworząc warstwę pierwotnych komórek nabłonkowych. W przeciwieństwie do wcześniejszych sugestii, cellularyzacja nie jest napędzana kurczliwością Miozyny-26, lecz wynika głównie z egzocytozy błony z zapasów wewnętrznych7. W związku z tym cellularyzacja stanowi doskonały system do badania transportu błonowego podczas zmian kształtu komórek wymagających invaginacji lub ekspansji błony plazmatycznej, takich jak cytokineza czy morfogeneza cewek poprzecznych (T-tubules) w mięśniach.
Należy zauważyć, że protokół ten można łatwo zastosować do obrazowania innych zmian kształtu komórek w embrionie muchy, co wymaga jedynie niewielkich adaptacji, takich jak zmiana stadium zbierania embrionów lub użycie „kleju do embrionów” w celu zamocowania embrionu w określonej orientacji (Tabela 1)8-19. W każdym przypadku schemat postępowania jest zasadniczo taki sam (Rysunek 1). Do przygotowania stabilnych linii much wyrażających białko zainteresowania, połączone z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub jego wariantami, stosuje się standardowe metody klonowania i transgenezy Drosophila; muchy te stanowią odnawialne źródło embrionów. Alternatywnie, białka fluorescencyjne/sondy wprowadza się bezpośrednio do embrionów much za pomocą prostych technik mikroiniekcji9-10. Następnie, w zależności od zdarzenia rozwojowego i zmiany kształtu komórek poddawanych obrazowaniu, embriony są zbierane i etapowane na podstawie morfologii pod mikroskopem stereoskopowym, a na koniec pozycjonowane i montowane do obrazowania time-lapse na mikroskopie konfokalnym.

Wczesny rozwój muszki owocówki, Drosophila melanogaster, charakteryzuje się szeregiem zmian kształtu komórek, które są bardzo odpowiednie dla metod obrazowania. Niniejszy artykuł opisze podstawowe narzędzia i metody niezbędne do konfokalnego obrazowania zarodków Drosophila na żywo, koncentrując się na procesie zmiany kształtu komórek zwanym cellularizacją.

Obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila

Rozwijający się zarodek Drosophila melanogaster ulega liczby zmian kształtu komórek, które są w wysokim stopniu podatne na konfokalne obrazowanie żywych tkanek. Kształt komórki ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych embrionach drosofil (*Drosophila*). Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie i namnożenie transgenicznych linii much wyrażających sondy białkowe znakowane GFP. Drugim etapem procedury jest przeniesienie tych much do kubków do zbierania embrionów.Trzecim krokiem procedury jest pobranie embrionów. Czwartym krokiem jest powlekanie i montaż embrionu. W końcowym etapie, dzięki obrazowaniu konfokalnemu w trybie time-lapse zamontowanych embrionów, można uzyskać wyniki pokazujące zmiany kształtu komórek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie utrwalonych tkanek, jest możliwość uchwycenia dynamicznych aspektów zmian kształtu komórek w kontekście żywych embrionów. Chociaż opisana tutaj metoda jest dostosowana do procesów esofagizacji, można ją zaadaptować i zastosować do innych zmian kształtu komórek towarzyszących wczesnemu rozwojowi muchy, takich jak formowanie bruzdy brzusznej, wydłużanie pasma zarodkowego, trachegeneza oraz zamknięcie grzbietowe. Osoby rozpoczynające pracę z tą techniką często napotykają trudności podczas manipulowania embrionami i ich montowania pod mikroskopem stereoskopowym.Procedurę tę zaprezentujemy ja oraz moja promotorka, Anna Marie Soki. Procedura rozpoczyna się od przygotowania naczynia do zbierania embrionów; za pomocą żyletki należy odciąć dno zerówki (zlewki trójkątnej) o pojemności 100 ml, starając się, aby krawędź była jak najgładsza. Należy również odciąć trzy narożniki z górnej części naczynia, aby ułatwić jego obsługę.Następnie, pracując w dygestorium, wytnij kwadrat z siatki drucianej o wymiarach 6 cm na 6 cm. Połóż arkusz wytrzymałej folii aluminiowej na wstępnie rozgrzanej płycie grzejnej, a na folii aluminiowej umieść kwadrat siatki drucianej. Mocno dociśnij odcięty dolny brzeg naczynia do gorącej siatki.Odczekaj kilka sekund i podnieś naczynie z przymocowaną siatką. Jeśli folia również przywarła, odklej ją. Pozostaw naczynie na noc do następnego dnia.Nadmiar siatki należy usunąć nożyczkami, a wszelkie ostre krawędzie wygładzić drobnoziarnistym papierem ściernym. Kolejnym krokiem jest przygotowanie pasty drożdżowej, która będzie stymulować produkcję embrionów przez samice much. Napełnij mały kubek w mniej więcej równych częściach aktywnymi drożdżami suchymi Red Star oraz wodą destylowaną, a następnie mieszaj do czasu rozpuszczenia drożdży.Pasta powinna mieć konsystencję zbliżoną do mokrego masła orzechowego. Gdy pasta drożdżowa będzie gotowa, należy wyjąć płytki z agarem z soku jabłkowego z przechowywania w temperaturze 4 °C. Opis przygotowania płytek z agarem z soku jabłkowego znajduje się w towarzyszącym manuskrypcie.Nanieś sok jabłkowy na płytki z pastą drożdżową i odczekaj co najmniej godzinę, aż płytki osiągną temperaturę pokojową. Złóż okrągły papier filtracyjny na pół, a następnie ponownie na pół.Przytnij papier do średnicy od ośmiu do dziewięciu centymetrów. Wykonaj zakładki w harmonijkę w jednej ćwiartce koła. Rozłóż koło, odwróć je i włóż do kubka zbiorczego, aż dotknie siatki.Należy upewnić się, że papier jest stabilnie zamocowany w kubku, aby nie spadł i nie przygniótł much. Teraz nadszedł czas na przeniesienie much. Należy wziąć butelkę z populacją wyjściową much, która miała dwa tygodnie na rozmnożenie. Butelka ta powinna zawierać wystarczającą liczbę much, aby wypełnić jeden kubek do zbierania embrionów, z minimum 50 samicami i 30 samcami.Aby zapewnić najlepsze znoszenie jaj, należy używać much w wieku poniżej pięciu dni od wyklucia. Pojemnik do zbierania należy opisać, podając nazwę szczepu oraz datę. Odwrócić butelkę z muchami i delikatnie potrząsnąć nią nad pojemnikiem, aby przenieść muchy do środka, a następnie natychmiast przykryć pojemnik przygotowaną płytką z sokiem jabłkowym.Przymocuj płytkę do kubka za pomocą gumki recepturki. Kubek z siatkową osłoną ustaw w temperaturze pokojowej w miejscu z bezpośrednim dostępem do światła. Upewnij się, że na kubek nie padają żadne cienie, ponieważ muchy nie będą składać jaj w ciemności. Po dwóch godzinach zbierz embriony, zastępując płytkę z sokiem jabłkowym nową płytką do naszych kolekcji w temperaturze pokojowej.Metoda ta sprawdza się dobrze w obrazowaniu komórkowym. Następnie należy przygotować komorę montażową dla embrionów. W tym celu odetnij kawałek dwustronnej taśmy o długości od 2 do 3 cm i przyklej go do szkiełka przedmiotowego, wyrównując długą oś taśmy z długą osią szkiełka.Odetnij drugi kawałek dwustronnej taśmy o długości od dwóch do trzech centymetrów i nałóż go na pierwszy kawałek taśmy, upewniając się, że ich krawędzie są wyrównane. Za pomocą żyletki wykonaj dwa nacięcia w centrum taśmy, w odstępach około trzech milimetrów, prostopadle do długiej osi szkiełka. Usuń taśmę pomiędzy nacięciami, aby utworzyć kanał, a następnie nanieś pipetą kroplę oleju halo carbon 27 do kanału.W tym kanale zostaną zamontowane embriony. Odkaź embriony, pokrywając płytkę z sokiem jabłkowym 50% roztworem wybielacza na 30 do 60 sekund. Zbierz embriony za pomocą sitka komórkowego i dokładnie przemyj je wodą destylowaną z butelki z rozpylaczem.Osusz sitko za pomocą ręczników papierowych. Za pomocą wilgotnego pędzla przenieś od 10 do 50 pokrytych embrionów na czystą płytkę z sokiem jabłkowym, która nie zawiera pasty drożdżowej. Odsącz wodę rozerwanym brzegiem ręcznika papierowego i natychmiast pokryj embriony niewielką ilością oleju Halocarbon 27.Przenieś płytkę z sokiem jabłkowym pod mikroskop stereotypowy z oświetleniem przechodzącym. Określ stadium rozwoju embrionów zgodnie z morfologicznymi wytycznymi granicznymi. Za pomocą pęsety przenieś pięć embrionów w 11. lub 12. cyklu mitotycznym, odpowiadających czwartemu stadium granicznemu, do kanału komory montażowej.Ułóż zarodki w linii tak, aby strony grzbietowa i brzuszna były widoczne, a strona boczna skierowana w dół. Zarodki łatwo ułożyć w tej orientacji w samym oleju. Aby uniknąć zbyt gęstego rozmieszczenia zarodków, zachowaj między nimi odstęp wynoszący co najmniej połowę długości zarodka.Połóż jedną krawędź szkiełka podstawowego o wymiarach 25 na 25 mm na dwustronnej taśmie przy jednej krawędzi kanału, wyrównując krawędź szkiełka z krawędzią taśmy. Opuść szkiełko, aby przykryło kanał. Jeśli pod szkiełkiem uwięzione zostanie powietrze, nanieś niewielką ilość oleju na krawędź szkiełka.Kapilarność wciągnie olej do kanału i wypchnie powietrze. Umieść komorę montażową na mikroskopie konfokalnym i zlokalizuj embriony, korzystając ze światła przechodzącego. Następnie przełącz na obrazowanie konfokalne, aby ustawić ostrość na obszarze zainteresowania w celu uzyskania obrazu komórkowego w pojedynczej płaszczyźnie w pobliżu środka embrionu.W celu śledzenia dynamiki inwagination należy wykorzystać interwały od 30 do 62 do obrazowania time-lapse. Po uzyskaniu obrazów należy przeanalizować je za pomocą pakietu do analizy obrazu, takiego jak bezpłatny program ImageJ opracowany przez NIH. Dane można następnie przedstawić w formie filmów, sekwencji lub wykresów CH. Aby obrazować zmiany kształtu komórek inne niż komórkowe, może być konieczne zamontowanie embrionów w określonej orientacji, której nie da się łatwo utrzymać w samym oleju.W tym celu należy zastosować inną metodę montażu niż opisana wcześniej. Rozpocznij od przygotowania kleju do zarodków, łącząc 20 cm taśmy dwustronnej z 250 µl heptanu w fiolce. Umieść fiolkę na mieszalniku lub platformie rotacyjnej i mieszaj przez noc.Następnego dnia zanurzyć żółty końcówkę pipety w kleju do embrionów, a następnie przeciągnąć ją wzdłuż szkiełka przedmiotowego, pozostawiając ślad kleju podczas odparowywania heptanu zawartego w kleju do embrionów. Ustawić przygotowane embriony na bloku agaru w taki sposób, aby powierzchnia embrionu, która ma zostać zobrazowana, była skierowana w stronę agaru. Na przykład w celu obrazowania zmian kształtu komórek.Podczas tworzenia farrow, zamocuj embriony stroną brzuszną skierowaną do agaru. Odwróć szkiełko z klejem do embrionów i delikatnie dociśnij smugę kleju do embrionów znajdujących się na bloku agarowym. Następnie ponownie odwróć szkiełko.Większość zarodków powinna przylegać do szkiełka w odpowiedniej orientacji. Następnie należy nakleić dwie warstwy dwustronnej taśmy po obu stronach zarodków. Przykryć je olejem halo carbon 27 i nałożyć szkiełko nakrywkowe.Zarodki są teraz gotowe do obrazowania. Zdjęcia te przedstawiają obrazowanie time-lapse zarodków w stadium blastuli; są one zamocowane stroną grzbietową i brzuszną, które są wyraźnie widoczne, a obrazowanie odbywa się w pobliżu ich środka. Aby śledzić błonę plazmatyczną w obrazach w przekroju poprzecznym, zarodek pokazany tutaj wykazuje ekspresję sondy GFP myosin two, która koncentruje się na końcach inwaginacji błony plazmatycznej. Śledzenie wgłębiania się tego frontu w czasie pozwala określić tempo inwaginacji błony plazmatycznej; punkt czasowy 0 minut odpowiada początkowi procesu cellularization, a krótko po punkcie czasowym 56 minut gastrulacja rozpoczyna się po stronie brzusznej zarodka.Ten film typu time-lapse z obrazowaniem komórkowym rozpoczęto w poprzednim cyklu mitotycznym, 13., rejestrując pseudołubienie, regresję bruzdy, i kontynuowano go aż do momentu zaobserwowania ruchów gastrulacyjnych na stronie brzusznej zarodka. Po opanowaniu techniki, montaż i obrazowanie mogą zająć od 60 do 90 minut, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Oczywiście pobieranie zarodków wymaga dodatkowego czasu i musi być skoordynowane z procesem montażu i obrazowania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest podjęcie wszelkich możliwych działań w celu utrzymania dobrego stanu zdrowia embrionów. Na przykład nie należy nadmiernie wybielać embrionów i należy ograniczyć ich ekspozycję na laser podczas obrazowania zgodnie z tą procedurą. Bardziej zaawansowane techniki obrazowania, takie jak fotowybielanie i fotoprzełączanie, mogą zostać wykorzystane do odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. jaka jest dynamika cytoszkieletu i błony towarzysząca danej zmianie kształtu komórki?

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie zmian kształtu komórek w żyjących Drosophila zarodkach

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Tutaj opisujemy procedurę przechwytywania na żywo obrazów gastrulacji Drosophila. Umożliwiło nam to lepsze zrozumienie zwężenia wierzchołkowego związanego z wczesnym rozwojem i dalszą analizę mechanizmów rządzących ruchami komórek podczas modyfikacji struktury tkanki.

Obrazowanie zmiany kształtu komórki i ruchu komórek w gastrulacji Drosophila przy użyciu transgenicznych much reporterowych DE-kadheryny

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Celem tego protokołu jest wstrzyknięcie globularnej aktyny sprzężonej z rodaminą do zarodków Drosophila i zobrazowanie wewnątrzjądrowego montażu pręcików aktyny po stresie cieplnym.

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj metodę obrazowania zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila melanogaster przy użyciu konfokalnej mikroskopii czasowo-rozdzielczej z sondami GFP. Technika ta umożliwia badanie dynamicznych procesów rozwojowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów