Name: Mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę mechanicznej manipulacji neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów z pomiarem sił w zakresie mikrodyn. Technika ta pozwala badać biofizykę wydłużania aksonów i dynamikę wzrostu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność dr. Robertowi E. Buxbaumowi za istotny wkład w opracowanie tej metodyki.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Techniki przykładania i pomiaru sił komórkowych mają długą historię9. Nasza metoda była pierwotnie inspirowana pracami Dennisa Braya, który wykorzystywał szklane igły podobne do naszych do „ciągnięcia” neuronów ze stałą prędkością przy użyciu zmotoryzowanego urządzenia hydraulicznego10. Istnieje wiele alternatywnych sposobów przykładania sił do komórek, w tym: silniki krokowe11, koraliki magnetyczne12, mikrofabrykowane belki13 oraz przepływy płynów14. Te o...

<table><tbody><tr><td>Kapilara R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>Szkło R-6 OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>Wyciągacz BB-CH</td><td>Mecanex S.A., Genewa, Szwajcaria</td><td>BB-CH puller</td><td>Używać trybu 4 Alt przy CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>Drut Chromel 0.001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>nieizolowany drut termopary, szpula 50ft, obecnie nazywany Chromega</td></tr><tr><td>Drut Constatan 0.003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>nieizolowany drut termopary, szpula 50 ft</td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>Uniwersalny statyw z ramieniem do mikroskopu</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 lub 90430</td><td>Większość marek lub typów statywów z ramieniem będzie odpowiednia do tego zastosowania</td></tr><tr><td>Mechaniczny mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>Trójosiowy mikromanipulator gruboustawny z bezpośrednim napędem</td></tr><tr><td>Hydrauliczny mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>Obecnie dostępny jako MMO-203, typ z trzema ruchomymi osiami</td></tr><tr><td>Uchwyt igłowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Zestaw 3 szt.</td></tr><tr><td>Pojedynczy uchwyt na instrument</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny uchwyt na instrument</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>Mechaniczny mikromanipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Montaż słupowy, 1 uchwyt na sondę, Model RH 430001</td></tr><tr><td>Mechaniczny mikromanipulator z joystickiem</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Mikroskop odwrócony</td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>seria 1200</td><td>Używany model 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>Własna konstrukcja (patrz odniesienie 19)</td><td></td><td>Odniesienie 19, wymaga zaktualizowanego sterownika wymienionego poniżej</td></tr><tr><td>Programowalny sterownik temperatury</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>Zastępuje wycofany sterownik temperatury PXV3</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Mikroskop odwrócony, ok. 1980 r.</td></tr><tr><td>Binokularny mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ-10</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Inne mikroskopy stereoskopowe będą odpowiednie</td></tr></tbody></table>

mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Manipulacje komórkowe oraz wydłużanie aksonów neuronalnych można przeprowadzić za pomocą skalibrowanych szklanych mikrowłókien, zdolnych do pomiaru i przyłożenia sił w zakresie 10-1000 μdyne1,2. Pomiary siły uzyskuje się poprzez obserwację zginania igieł szklanych zgodnie z prawem Hooke'a, które są kalibrowane bezpośrednią metodą empiryczną3. W pełni opisano wymagania sprzętowe oraz procedury wytwarzania, kalibrowania, modyfikowania i wykorzystywania igieł w badaniach nad komórkami. Zakresy sił stosowane wcześniej oraz różne typy komórek, do których zastosowano te techniki, demonstrują elastyczność tej metodologii i służą jako przykłady dla przyszłych badań4-6. Zalety techniczne obejmują ciągłą „wizualizację” sił generowanych podczas manipulacji oraz możliwość bezpośredniej ingerencji w różnorodne zdarzenia komórkowe. Należą do nich bezpośrednia stymulacja i regulacja wzrostu oraz retrakcji aksonów7, a także odrywanie i pomiary mechaniczne każdego rodzaju hodowanych komórek8.

Precyzyjne pomiary i aplikacja sił działających na neurony w zakresie od 2 do 1000 mikrodyn są realizowane przy użyciu kalibrowanych szklanych igieł. Metodologia ta może być wykorzystana do kontrolowania i pomiaru wielu aspektów rozwoju aksonów, w tym inicjacji aksonalnej, napięcia aksonalnego, prędkości wydłużania się aksonów oraz wektorów siły.

Mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów

Manipulacje komórkowe oraz wydłużanie aksonów neuronalnych można przeprowadzać za pomocą kalibrowanych mikrowłókien szklanych, które umożliwiają pomiar i przyłożenie sił w zakresie...

Celem niniejszego eksperymentu jest wydłużenie aksonu przy jednoczesnym dokładnym pomiarze sił. Osiąga się to poprzez wykonanie bezpośrednio skalibrowanej igły referencyjnej z drutu, po czym – w procesie kalibracji igły referencyjnej – przygotowywane są igły skalibrowane, pośrednie oraz robocze w pożądanym zakresie sił. Następnie stożki wzrostu są przeciągane za pomocą igły roboczej w celu wydłużenia aksonu.Wynikowe wydłużenie aksonu jest rejestrowane, a siły są mierzone na podstawie ugięcia skalibrowanej igły. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biofizyki wydłużania się aksonów. Rozpocznij tę procedurę, używając regulowanego wyciągacza mikroigieł oraz szklanych kapilar do wykonania igieł o zwężonych końcówkach o długości około czterech milimetrów.Przechowywać igły w przykrytej szalce Petriego o średnicy 160 milimetrów. Następnie przygotować kalibracyjną igłę drutową, wsuwając drut chromalowy o grubości 0,001 cala do wnętrza szklanej igły z odłamaną końcówką. Wysunąć drut z końcówki na długość 26 milimetrów i przymocować go za pomocą superglue.Zagiąć dystalny jeden milimetr drutu, tworząc haczyk. Następnie z jednego metra drutu o stałej średnicy 0,003 cala przygotować mikroobciążenia. W celu odmierzenia drutu przymocować go taśmą do linijki metrówki.Aby pomóc w uzyskaniu jak największej prostoty. Zważ drut o długości jednego metra i precyzyjnie potnij go na odcinki o długości jednego centymetra. Zegnij kilka kawałków drutu w kształt wazy.Kalibracja drucianych igieł wymaga zastosowania mikroskopu dissectingowego z pionową skalą pomiarową oraz mikromanipulatora. Mikroskop jest przechylony o 90 stopni na bok. Wykorzystuje się statyw z ramieniem uniwersalnym, aby można było obserwować odchylenie drucianej igły w dół.Zamocuj drutową igłę w uchwycie narzędziowym na mikromanipulatorze tak, aby była ona prostopadła do osi optycznej mikroskopu. Wyrównaj haczyk drutowej igły z marką radialną. Zawieś mikroobciążenie o masie 1 cm na haczyku i zapisz wartość wychylenia.Stała zgięcia drutu referencyjnego jest równa masie mikrowagi podzielonej przez zaobserwowane odchylenie. Po kalibracji przygotuj igłę do kolejnego etapu, odcinając haczyk w punkcie kontrolnym za pomocą żyletki, aby skalibrować pośrednie igły szklane. Wymagany jest mikroskop odwrócony z okularową skalą pomiarową.Po jednej stronie stolika mikroskopowego znajduje się mechaniczny mikromanipulator służący do trzymania igły drucianej. Po drugiej stronie znajduje się hydrauliczny mikromanipulator służący do przesuwania pośredniej igły szklanej; należy go skalibrować, używając mikromanipulatorów, aby zbliżyć obie igły do siebie w centrum pola optycznego pod kątem 45 stopni w szalce Petriego o wymiarach 160 mm na 30 mm wypełnionej wodą, przy powiększeniu 10x. Następnie należy wykonać serię odchyleń dla każdego z tych odchyleń.Odnotuj początkowe ugięcie oraz końcową pozycję zerową obciążenia szklanej igły po zwolnieniu. Pozwala to uzyskać 10 par punktów danych. Aby przygotować te 10 par danych do regresji liniowej, od drugiej wartości z zapisanych par należy odjąć ugięcie początkowe.Dodaj pięć par kontrolnych o wartościach zero zero do 10 par danych eksperymentalnych, aby zakotwiczyć regresję liniową w punkcie zero, który odpowiada zerowemu ugięciu przy zerowej sile. Oblicz regresję liniową dla tych 15 par danych.Stała sprężystości pośredniej igły szklanej jest równa znanej stałej zginania igieł drucianych podzielonej przez nachylenie linii regresji. Następnie należy skalibrować robocze igły szklane względem pośredniej igły szklanej w opisany wcześniej sposób. Igły szklane o wartości mniejszej niż dwa mikrony na mikrometr można lekko skrócić, aby sprowadzić je do odpowiedniego zakresu sztywności.Wcisnąć igły przeznaczone do powlekania w bryłę gliny umieszczoną nad zlewką o pojemności 10 mililitrów z roztworem czynnika adhezyjnego, tak aby kolejno tylko końcówki igieł były zanurzone w roztworze. Zanurzyć igły w 0,1% roztworze polilizyny na 30 minut. Następnie zanurzyć igły w conval i a na 30 minut, traktując igły czynnikami adhezyjnymi.Włącz inkubator lub system grzewczy stolika mikroskopu, aby stolik osiągnął równowagę termiczną. Stanowisko do manipulacji na stole wibroizolacyjnym składa się z mikroskopu odwróconego wyposażonego w manipulator hydrauliczny utrzymujący wyważone specjalne przedłużenie, w które włożony jest podwójny uchwyt narzędzi.Włóż niekalibrowaną igłę referencyjną do uchwytu igieł w taki sposób, aby wystawała z niego jak najdalej. Umieść ten zestaw w prawej części podwójnego uchwytu narzędzi. Następnie włóż przetraktowaną igłę roboczą do uchwytu igieł tak, aby wystawała o połowę mniej niż igła referencyjna, i umieść ją w lewej części podwójnego uchwytu narzędzi.Ustaw hydrauliczny mikromanipulator tak, aby sterowanie pionowe znajdowało się w najwyższym położeniu. Następnie zbliż do siebie końcówki dwóch igieł, używając śruby regulacyjnej do przemieszczania bocznego. Ustaw igłę w odpowiedniej pozycji.Wskazówki są zatem następujące: należy sprawdzić parę igieł z boku gołym okiem i użyć śruby regulacyjnej góra-dół po prawej stronie, aby sprowadzić końcówki do tej samej płaszczyzny. Obrócić uchwyt narzędzia i umieścić końcówki igieł w drodze światła nad powierzchnią medium, kierując je stromo w dół.Dokręć śrubę przegubu kulowego u podstawy. Używając obiektywu 10 x, ustaw ostrość powyżej komórek znajdujących się na dnie naczynia. Opuść igły do medium, aby odnaleźć ich końcówki w polu widzenia mikroskopu.Zanim przesunie się je zbyt nisko w głąb naczynia hodowlanego, należy poruszać igłą na boki, do tyłu lub do przodu i wypatrywać jej cienia. Gdy igła pojawi się w polu widzenia, należy przekręcić śrubę regulacji bocznej, aby zidentyfikować, która igła została odnaleziona.Jeśli igła porusza się wraz ze śrubą, jest to igła referencyjna. Jeśli się nie porusza, jest to igła kalibrowana. Po zlokalizowaniu obu igieł należy użyć precyzyjnych pokręteł uchwytu podwójnego narzędzia, aby je wyrównać.Celem jest uzyskanie odstępu między końcówkami igieł wynoszącego około 50 µm lub około jednej cali na monitorze. Punkt odniesienia powinien znajdować się wyżej nad naczyniem hodowlanym, a zatem być nieco poza obszarem ostrości. Gdy igła holująca będzie znajdować się w obszarze ostrości na naczyniu, należy zarejestrować obraz tej końcowej, dostrojonej pozycji.Odległość zerowa jest definiowana jako moment rozdzielenia igieł. Unieś igły powyżej płaszczyzny preparatu i ustaw je na krawędzi pola widzenia. Wybierz akson do eksperymentu zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokole pisemnym.Przesuń igły blisko stożka wzrostu aksonu i ponownie zarejestruj odległość zerową. Następnie podnieś stół wibroizolacyjny, aby móc zmanipulować stożek wzrostu na igłę. Umieść igłę holującą obok stożka wzrostu poniżej niego, a następnie opuść igłę do dna szalki.Spowoduje to odchylenie igły do góry, jej zgięcie i przesunięcie wzdłuż naczynia w stronę stożka wzrostu, a następnie przesunięcie stożka wzrostu w górę. Dociśnij igłę do dna naczynia tylko w takim stopniu, aby stożek wzrostu zahaczył o końcówkę igły, ale nie tak mocno, by ześlizgnął się z niej i przesunął do tyłu. Odczekaj 20 minut, aby chwyt został utrwalony.Gdy stożek wzrostu znajduje się na igle, należy lekko go napiąć. Przesuwając igłę w prawo i delikatnie ją unosząc, należy skompensować ruch w dół, przesuwając igłę nieco do przodu podczas podnoszenia. Unosić igłę etapami, aż do momentu, gdy przyczepiony wypustek będzie rozciągać się prostopadle do igły i powyżej powierzchni szalki. Holowanie wykonuje się poprzez odsuwanie igieł od ciała komórki.W niewielkich przyrostach obserwuje się siły jako zwiększającą się przerwę między igłami podczas stopniowego zwiększania napięcia. Należy uważnie obserwować wszelkie oznaki odczepienia stożka wzrostu od igły. Poziom medium w naczyniu należy utrzymać poprzez dodawanie wody co godzinę w celu zrównoważenia odparowania.Używając oznaczenia na ściance naczynia do wskazania początkowej głębokości, powoli dodawaj wodę przy krawędzi naczynia, z dala od igieł, po zakończeniu eksperymentu. Przed wyjęciem igieł z naczynia ponownie sprawdź dystans zerowy. Odczytaj pozycje igieł wzdłuż osi poziomej na ekranie.Należy również zarejestrować pozycję ciała komórki oraz momenty, w których odległość rozdzielenia igieł pomniejszona o dystans zerowy bez obciążenia, pomnożona przez stałą giętkości igły, odpowiada wartości przyłożonej siły wyrażonej w mikronach. Pokazano. Oto przykładowe pole komórek z kilkoma możliwymi wyborami do kontrolowania rozwoju aksonów. Poziomy akson z dużym stożkiem wzrostu jest dobrym wyborem.Ciało komórki jest ustawione blisko krawędzi ekranu, a igły są zbliżane do stożka wzrostu. Wykonuje się obraz oddalenia nieobciążonych igieł, który stanowi dystans zerowy. Przed rozpoczęciem eksperymentu igła holująca jest przykładana do stożka wzrostu, aby sprawdzić, czy możliwe jest uzyskanie spontanicznego przyczepienia.Następnie igłę wsuwa się nieco głębiej w stożek wzrostu. Manewr wypychania w górę wykonuje się poprzez opuszczenie igły w stronę dna szalki, co powoduje jej wygięcie i wsunięcie się w stożek wzrostu, prowadząc do jego oderwania. Dodano również niewielki przyrost naprężenia w kierunku przednim.Po 15 minutach wydaje się, że akson wydłużył się wraz z ruchem igły do przodu. Następnie do igły holowniczej przyłożono większą siłę naciągu i rozpoczęto podnoszenie igły. Dodatkowy naciąg jest widoczny poprzez zwiększony odstęp między igłami.W tym momencie akson wyraźnie się wydłuża. Igła referencyjna nie została przesunięta do przodu, jednak akson urósł w jej kierunku, co zmniejszyło napięcie. Ponadto igły zostały lekko uniesione.Następnie zwiększa się naprężenie igły holowniczej. W odpowiedzi na naprężenie przyłożone do zgiętej igły holowniczej nastąpił znaczny wzrost. Na koniec eksperymentu wykonuje się końcową kontrolę zera.Cały proces został przedstawiony w tej sekwencji poklatkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kalibrować igły, manipulować stożkiem wzrostu w celu umieszczenia go na igle oraz mierzyć siły podczas wydłużania aksonu.

mechanical-manipulation-of-neurons-to-control-axonal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mechaniczne manipulowanie neuronami w celu kontroli rozwoju aksonów

Opracowano unikalną metodę inżynierii tkankowej w celu wydłużenia licznych włókien nerwowych w hodowli poprzez odtworzenie wzrostu aksonów indukowanego rozciąganiem; jest to forma wzrostu układu nerwowego, w której nerwy wydłużają się równocześnie ze wzrostem powiększającego się organizmu.

Wzrost aksonów indukowany rozciąganiem: mechanotransdukcja wzrostu neuronalnego

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Morfogeneza i migracja neuronów są kluczowymi wydarzeniami leżącymi u podstaw prawidłowego rozwoju mózgu. W tym miejscu opisujemy metody genetycznej manipulacji hodowanymi neuronami ziarnistymi móżdżku i rozwijającym się móżdżkiem w celu oceny morfologii i cech migracyjnych neuronów.

Manipulacja genetyczna neuronów ziarnistych móżdżku in vitro i in vivo w celu zbadania morfologii i migracji neuronów

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Testy wzrostu neurytów dostarczają ilościowej wartości na temat regeneracyjnych procesów neuronalnych. Zaletą tego półautomatycznego oprogramowania jest to, że segmentuje ciała komórek i neuryty oddzielnie, tworząc maskę i mierzy różne parametry, takie jak długość neurytów, liczba punktów rozgałęzień, obszar klastra komórka-ciało i liczba klastrów komórek.

Standaryzacja nowatorskiego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru przyrostu neurytów

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Poznaj metodę mechanicznej manipulacji neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów z pomiarem sił w zakresie mikrodyn. Technika ta pozwala badać biofizykę wydłużania aksonów i dynamikę wzrostu.

Mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów

Przeglądaj więcej filmów