Mechaniczna manipulacja neuronami w celu kontrolowania rozwoju aksonów

Celem niniejszego eksperymentu jest wydłużenie aksonu przy jednoczesnym dokładnym pomiarze sił. Osiąga się to poprzez wykonanie bezpośrednio skalibrowanej igły referencyjnej z drutu, po czym – w procesie kalibracji igły referencyjnej – przygotowywane są igły skalibrowane, pośrednie oraz robocze w pożądanym zakresie sił. Następnie stożki wzrostu są przeciągane za pomocą igły roboczej w celu wydłużenia aksonu.

Wynikowe wydłużenie aksonu jest rejestrowane, a siły są mierzone na podstawie ugięcia skalibrowanej igły. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biofizyki wydłużania się aksonów. Rozpocznij tę procedurę, używając regulowanego wyciągacza mikroigieł oraz szklanych kapilar do wykonania igieł o zwężonych końcówkach o długości około czterech milimetrów.

Przechowywać igły w przykrytej szalce Petriego o średnicy 160 milimetrów. Następnie przygotować kalibracyjną igłę drutową, wsuwając drut chromalowy o grubości 0,001 cala do wnętrza szklanej igły z odłamaną końcówką. Wysunąć drut z końcówki na długość 26 milimetrów i przymocować go za pomocą superglue.

Zagiąć dystalny jeden milimetr drutu, tworząc haczyk. Następnie z jednego metra drutu o stałej średnicy 0,003 cala przygotować mikroobciążenia. W celu odmierzenia drutu przymocować go taśmą do linijki metrówki.

Aby pomóc w uzyskaniu jak największej prostoty. Zważ drut o długości jednego metra i precyzyjnie potnij go na odcinki o długości jednego centymetra. Zegnij kilka kawałków drutu w kształt wazy.

Kalibracja drucianych igieł wymaga zastosowania mikroskopu dissectingowego z pionową skalą pomiarową oraz mikromanipulatora. Mikroskop jest przechylony o 90 stopni na bok. Wykorzystuje się statyw z ramieniem uniwersalnym, aby można było obserwować odchylenie drucianej igły w dół.

Zamocuj drutową igłę w uchwycie narzędziowym na mikromanipulatorze tak, aby była ona prostopadła do osi optycznej mikroskopu. Wyrównaj haczyk drutowej igły z marką radialną. Zawieś mikroobciążenie o masie 1 cm na haczyku i zapisz wartość wychylenia.

Stała zgięcia drutu referencyjnego jest równa masie mikrowagi podzielonej przez zaobserwowane odchylenie. Po kalibracji przygotuj igłę do kolejnego etapu, odcinając haczyk w punkcie kontrolnym za pomocą żyletki, aby skalibrować pośrednie igły szklane. Wymagany jest mikroskop odwrócony z okularową skalą pomiarową.

Po jednej stronie stolika mikroskopowego znajduje się mechaniczny mikromanipulator służący do trzymania igły drucianej. Po drugiej stronie znajduje się hydrauliczny mikromanipulator służący do przesuwania pośredniej igły szklanej; należy go skalibrować, używając mikromanipulatorów, aby zbliżyć obie igły do siebie w centrum pola optycznego pod kątem 45 stopni w szalce Petriego o wymiarach 160 mm na 30 mm wypełnionej wodą, przy powiększeniu 10x. Następnie należy wykonać serię odchyleń dla każdego z tych odchyleń.

Odnotuj początkowe ugięcie oraz końcową pozycję zerową obciążenia szklanej igły po zwolnieniu. Pozwala to uzyskać 10 par punktów danych. Aby przygotować te 10 par danych do regresji liniowej, od drugiej wartości z zapisanych par należy odjąć ugięcie początkowe.

Dodaj pięć par kontrolnych o wartościach zero zero do 10 par danych eksperymentalnych, aby zakotwiczyć regresję liniową w punkcie zero, który odpowiada zerowemu ugięciu przy zerowej sile. Oblicz regresję liniową dla tych 15 par danych.

Stała sprężystości pośredniej igły szklanej jest równa znanej stałej zginania igieł drucianych podzielonej przez nachylenie linii regresji. Następnie należy skalibrować robocze igły szklane względem pośredniej igły szklanej w opisany wcześniej sposób. Igły szklane o wartości mniejszej niż dwa mikrony na mikrometr można lekko skrócić, aby sprowadzić je do odpowiedniego zakresu sztywności.

Wcisnąć igły przeznaczone do powlekania w bryłę gliny umieszczoną nad zlewką o pojemności 10 mililitrów z roztworem czynnika adhezyjnego, tak aby kolejno tylko końcówki igieł były zanurzone w roztworze. Zanurzyć igły w 0,1% roztworze polilizyny na 30 minut. Następnie zanurzyć igły w conval i a na 30 minut, traktując igły czynnikami adhezyjnymi.

Włącz inkubator lub system grzewczy stolika mikroskopu, aby stolik osiągnął równowagę termiczną. Stanowisko do manipulacji na stole wibroizolacyjnym składa się z mikroskopu odwróconego wyposażonego w manipulator hydrauliczny utrzymujący wyważone specjalne przedłużenie, w które włożony jest podwójny uchwyt narzędzi.

Włóż niekalibrowaną igłę referencyjną do uchwytu igieł w taki sposób, aby wystawała z niego jak najdalej. Umieść ten zestaw w prawej części podwójnego uchwytu narzędzi. Następnie włóż przetraktowaną igłę roboczą do uchwytu igieł tak, aby wystawała o połowę mniej niż igła referencyjna, i umieść ją w lewej części podwójnego uchwytu narzędzi.

Ustaw hydrauliczny mikromanipulator tak, aby sterowanie pionowe znajdowało się w najwyższym położeniu. Następnie zbliż do siebie końcówki dwóch igieł, używając śruby regulacyjnej do przemieszczania bocznego. Ustaw igłę w odpowiedniej pozycji.

Wskazówki są zatem następujące: należy sprawdzić parę igieł z boku gołym okiem i użyć śruby regulacyjnej góra-dół po prawej stronie, aby sprowadzić końcówki do tej samej płaszczyzny. Obrócić uchwyt narzędzia i umieścić końcówki igieł w drodze światła nad powierzchnią medium, kierując je stromo w dół.

Dokręć śrubę przegubu kulowego u podstawy. Używając obiektywu 10 x, ustaw ostrość powyżej komórek znajdujących się na dnie naczynia. Opuść igły do medium, aby odnaleźć ich końcówki w polu widzenia mikroskopu.

Zanim przesunie się je zbyt nisko w głąb naczynia hodowlanego, należy poruszać igłą na boki, do tyłu lub do przodu i wypatrywać jej cienia. Gdy igła pojawi się w polu widzenia, należy przekręcić śrubę regulacji bocznej, aby zidentyfikować, która igła została odnaleziona.

Jeśli igła porusza się wraz ze śrubą, jest to igła referencyjna. Jeśli się nie porusza, jest to igła kalibrowana. Po zlokalizowaniu obu igieł należy użyć precyzyjnych pokręteł uchwytu podwójnego narzędzia, aby je wyrównać.

Celem jest uzyskanie odstępu między końcówkami igieł wynoszącego około 50 µm lub około jednej cali na monitorze. Punkt odniesienia powinien znajdować się wyżej nad naczyniem hodowlanym, a zatem być nieco poza obszarem ostrości. Gdy igła holująca będzie znajdować się w obszarze ostrości na naczyniu, należy zarejestrować obraz tej końcowej, dostrojonej pozycji.

Odległość zerowa jest definiowana jako moment rozdzielenia igieł. Unieś igły powyżej płaszczyzny preparatu i ustaw je na krawędzi pola widzenia. Wybierz akson do eksperymentu zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokole pisemnym.

Przesuń igły blisko stożka wzrostu aksonu i ponownie zarejestruj odległość zerową. Następnie podnieś stół wibroizolacyjny, aby móc zmanipulować stożek wzrostu na igłę. Umieść igłę holującą obok stożka wzrostu poniżej niego, a następnie opuść igłę do dna szalki.

Spowoduje to odchylenie igły do góry, jej zgięcie i przesunięcie wzdłuż naczynia w stronę stożka wzrostu, a następnie przesunięcie stożka wzrostu w górę. Dociśnij igłę do dna naczynia tylko w takim stopniu, aby stożek wzrostu zahaczył o końcówkę igły, ale nie tak mocno, by ześlizgnął się z niej i przesunął do tyłu. Odczekaj 20 minut, aby chwyt został utrwalony.

Gdy stożek wzrostu znajduje się na igle, należy lekko go napiąć. Przesuwając igłę w prawo i delikatnie ją unosząc, należy skompensować ruch w dół, przesuwając igłę nieco do przodu podczas podnoszenia. Unosić igłę etapami, aż do momentu, gdy przyczepiony wypustek będzie rozciągać się prostopadle do igły i powyżej powierzchni szalki. Holowanie wykonuje się poprzez odsuwanie igieł od ciała komórki.

W niewielkich przyrostach obserwuje się siły jako zwiększającą się przerwę między igłami podczas stopniowego zwiększania napięcia. Należy uważnie obserwować wszelkie oznaki odczepienia stożka wzrostu od igły. Poziom medium w naczyniu należy utrzymać poprzez dodawanie wody co godzinę w celu zrównoważenia odparowania.

Używając oznaczenia na ściance naczynia do wskazania początkowej głębokości, powoli dodawaj wodę przy krawędzi naczynia, z dala od igieł, po zakończeniu eksperymentu. Przed wyjęciem igieł z naczynia ponownie sprawdź dystans zerowy. Odczytaj pozycje igieł wzdłuż osi poziomej na ekranie.

Należy również zarejestrować pozycję ciała komórki oraz momenty, w których odległość rozdzielenia igieł pomniejszona o dystans zerowy bez obciążenia, pomnożona przez stałą giętkości igły, odpowiada wartości przyłożonej siły wyrażonej w mikronach. Pokazano. Oto przykładowe pole komórek z kilkoma możliwymi wyborami do kontrolowania rozwoju aksonów. Poziomy akson z dużym stożkiem wzrostu jest dobrym wyborem.

Ciało komórki jest ustawione blisko krawędzi ekranu, a igły są zbliżane do stożka wzrostu. Wykonuje się obraz oddalenia nieobciążonych igieł, który stanowi dystans zerowy. Przed rozpoczęciem eksperymentu igła holująca jest przykładana do stożka wzrostu, aby sprawdzić, czy możliwe jest uzyskanie spontanicznego przyczepienia.

Następnie igłę wsuwa się nieco głębiej w stożek wzrostu. Manewr wypychania w górę wykonuje się poprzez opuszczenie igły w stronę dna szalki, co powoduje jej wygięcie i wsunięcie się w stożek wzrostu, prowadząc do jego oderwania. Dodano również niewielki przyrost naprężenia w kierunku przednim.

Po 15 minutach wydaje się, że akson wydłużył się wraz z ruchem igły do przodu. Następnie do igły holowniczej przyłożono większą siłę naciągu i rozpoczęto podnoszenie igły. Dodatkowy naciąg jest widoczny poprzez zwiększony odstęp między igłami.

W tym momencie akson wyraźnie się wydłuża. Igła referencyjna nie została przesunięta do przodu, jednak akson urósł w jej kierunku, co zmniejszyło napięcie. Ponadto igły zostały lekko uniesione.

Następnie zwiększa się naprężenie igły holowniczej. W odpowiedzi na naprężenie przyłożone do zgiętej igły holowniczej nastąpił znaczny wzrost. Na koniec eksperymentu wykonuje się końcową kontrolę zera.

Cały proces został przedstawiony w tej sekwencji poklatkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kalibrować igły, manipulować stożkiem wzrostu w celu umieszczenia go na igle oraz mierzyć siły podczas wydłużania aksonu.