Name: Eksperyment z profilem bioenergetycznym z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę profilowania bioenergetycznego mitochondriów w żywych komórkach C2C12 z wykorzystaniem analizatora XF 96. Technika ta mierzy podstawową respirację, produkcję ATP, wyciek protonów i rezerwę oddechową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

W tym eksperymencie mioblasty C2C12 są wysiewane z określoną gęstością w płytkach do hodowli komórkowej Seahorse. Mierzy się podstawowe tempo zużycia tlenu (OCR) oraz tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w celu ustalenia wartości bazowych.
1. Iniekcja komórek
Komórki poddawane są zaburzeniom metabolicznym poprzez sekwencyjne dodanie trzech różnych związków, które zmieniają profil bioenergetyczny komórki. Jedna grupa będzie służyć jako kontrola, do której w miejsce „związków” dodawane będzie medium prowadzące.
<ol>
<li>Pierwszym wstrzykiwanym związkiem jest oligomycyna. Oligomycyna hamuje syntezę ATP poprzez blokowanie kanału protonowego części Fo syntazy ATP (Kompleks V). W badaniach nad mitochondriami stosuje się ją w celu zapobiegania oddychaniu w stanie 3 (fosforylującym). W przypadku komórek może być ona wykorzystana do rozróżnienia odsetka zużycia O2 przeznaczonego na syntezę ATP od odsetka zużycia O2 niezbędnego do zniwelowania naturalnego przecieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną.</li>
<li>Drugim wstrzykiwanym związkiem jest FCCP. FCCP (cyjanek karbonylowy p-trifluorometoksyfenylohydrazon) jest jonoforem będącym mobilnym nośnikiem jonów. Jest to czynnik rozprzęgający, ponieważ zaburza syntezę ATP, transportując jony wodoru przez błonę mitochondrialną z pominięciem kanału protonowego syntazy ATP (Kompleks V). To załamanie potencjału błony mitochondrialnej prowadzi do szybkiego zużycia energii i tlenu bez generowania ATP. W tym przypadku wzrośnie zarówno OCR, jak i ECAR – OCR z powodu rozprzęgnięcia, a ECAR, ponieważ komórki starają się utrzymać równowagę energetyczną, wykorzystując glikolizę do generowania ATP. 
Opracowanie z użyciem FCCP może służyć do obliczenia „rezerwowej” wydolności oddechowej komórek, definiowanej jako różnica ilościowa między maksymalnym niekontrolowanym OCR a początkowym podstawowym OCR. Przypuszcza się, że utrzymanie pewnej rezerwowej wydolności oddechowej, nawet w warunkach maksymalnego bodźca fizjologicznego lub patofizjologicznego, jest głównym czynnikiem określającym żywotność i/lub przetrwanie komórek. Zdolność komórek do reagowania na stres w warunkach zwiększonego zapotrzebowania na energię jest w dużej mierze zależna od wydolności bioenergetycznej mitochondriów. Wydolność bioenergetyczna ta jest określana przez kilka czynników, w tym zdolność komórki do dostarczania substratu do mitochondriów oraz wydolność funkcjonalną enzymów zaangażowanych w transport elektronów.</li>
<li>Podczas trzeciego wstrzyknięcia do komórek dodaje się rotenon, inhibitor Kompleksu I. Spowoduje to zatrzymanie oddychania mitochondrialnego i umożliwi obliczenie frakcji mitochondrialnej oraz niemitochondrialnej przyczyniających się do oddychania. Zaobserwuje się spadek OCR z powodu upośledzenia funkcji mitochondrialnych, z towarzyszącym mu wzrostem ECAR, gdy komórka przechodzi w stan bardziej glikolityczny w celu utrzymania równowagi energetycznej. 
Rotenon jest inhibitorem mitochondrialnym, który zapobiega transferowi elektronów z centrum Fe-S w Kompleksie I do ubichinonu (Koenzym Q). To hamowanie Kompleksu I zapobiega przekształceniu energii potencjalnej w NADH w energię użytkową w postaci ATP. 
</li>
</ol>
2. Odczynniki i materiały
<ol>
<li>Roztwory oligomycyny, FCCP i rotenonu (Seahorse Mito Stress Test Kit)</li>
<li>Podłoże robocze DMEM (Seahorse #100965-000)</li>
<li>DMSO (Sigma D8418)</li>
<li>Woda destylowana (Gibco 15230-170)</li>
<li>Bufor kalibracyjny (Seahorse Bioscience)</li>
</ol>
3. Pożywka wzrostowa
<ol>
<li>500 mL DMEM (Gibco 11965-092)</li>
<li>10% FBS (Hyclone SH90070.03)</li>
<li>5 mL Penn/Strep (Gibco 15140-122)</li>
<li>5 mL pirogronian sodu (Sigma S8636)</li>
<li>5 mL Glutamax (Gibco 35050-061)</li>
</ol> 
4. Protokół wysiewania
<ol>
<li>Komórki wysiewa się na płytki do hodowli komórkowych XF96 w zagęszczeniu 10 000 komórek/dołek w 100 μL pożywki wzrostowej i inkubuje w temperaturze 37°C przy 10% CO2.</li>
<li>Komórki przytwierdzą się do płytki do hodowli komórkowych XF96 w ciągu 1 godziny.</li>
<li>Analizę komórek na płytce XF96 przeprowadza się 24 godziny po wysiewie.</li>
</ol>
5. Przygotowanie szablonu do analizy
<ol>
<li>Za pomocą kreatora testów Assay Wizard (Załącznik I) wygeneruj szablon z następującym układem grup: 
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Schemat konfiguracji testu Seahorse XF96; analiza aktywności metabolicznej; pomiar respiracji komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ siatki studzienek określający przypisania kolumn i grup</li>
</ol>
6. Przygotowanie związku
<ol>
<li>Przygotować następujące związki w pożywce XF DMEM Assay w następujący sposób: 
10 uM oligomycyny, 30.0 uM FCCP, 20.0 μM rotenonu, 
Stężenia te odpowiadają 10-krotnemu rozcieńczeniu, które nastąpi po wstrzyknięciu związków do dołka. Stężenia robocze wynoszą: 
1 uM oligomycyny, 3.0 uM FCCP, 2.0 μM rotenonu
</li>
</ol>
7. Wymiana pożywki i przygotowanie komórek
<ol>
<li>Umieść płytkę z komórkami na stacji XF Prep Station</li>
<li>Ustaw końcową objętość pożywki na 160 μL na dołek.</li>
<li>Inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37°C bez CO2 przez 60 minut, aby umożliwić komórkom wstępną ekwilibrację z pożywką do analizy.</li>
</ol>
8. Ładowanie wkładu czujnika
<ol>
<li>Podgrzać związki do 37°C przed załadowaniem do wkładu czujnika, a następnie wprowadzić związki do portów wtryskowych w następujący sposób:
<ol>
<li>Kolumny 1-4: Wprowadzić odpowiednio 16, 18 i 20 μL pożywki do testu XF Assay (DMEM) do portów A, B i C.</li>
<li>Kolumny 5-12: 
Wprowadzić 16 μL oligomycyny do portów A 
Wprowadzić 18 μL FCCP do portów B 
Wprowadzić 20 μL rotenonu do portów C</li>
</ol></li>
</ol>
9. Polecenia protokołu
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Polecenie</td>
 <td >Czas (min)</td>
 <td >Port</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Kalibracja</td>
 <td > </td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Równoważenie</td>
 <td > </td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Start pętli</td>
 <td >3X</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Mieszanie</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Oczekiwanie</td>
 <td >2</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Pomiar</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Koniec pętli</td>
 <td > </td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Wtrysk</td>
 <td > </td >
 <td >A</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Start pętli</td>
 <td >2X</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Mieszanie</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Oczekiwanie</td>
 <td >2</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Pomiar</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Wtrysk</td>
 <td > </td >
 <td >B</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Start pętli</td>
 <td >2X</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Mieszanie</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Oczekiwanie</td>
 <td >2</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Pomiar</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Wtrysk</td>
 <td > </td >
 <td >C</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Start pętli</td>
 <td >2X</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Mieszanie</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Oczekiwanie</td>
 <td >2</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Pomiar</td>
 <td >3</td >
 <td > </td >
 </tr>
 <tr >
 <td >Koniec</td>
 <td > </td >
 <td > </td >
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 1. Polecenia protokołu

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers i David A. Ferrick są pracownikami firmy Seahorse Bioscience, która produkuje odczynniki i aparaturę przedstawione w niniejszym artykule.

Ten test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do badania funkcji mitochondriów i stanowi podstawę do tworzenia bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie różnorodnych zmian w metabolizmie komórkowym, funkcji mitochondriów oraz ogólnej bioenergetyce.
Wszystkie związki użyte w tym eksperymencie powinny zostać zoptymalizowane pod kątem stężenia zapewniającego maksymalny efekt. Oznacza to, że należy przeprowadzić oddzielne doświadczenia z miareczkowaniem, aby ustalić te wartości. Jest to szczególnie ważne w przypadku FCCP, ponieważ krzywa miareczkowania ma tendencję do bycia dość stromej, a zbyt duża ilość FCCP może w rzeczywistości osłabić odpowiedzi w OCR. Typowe zakresy (stężenia końcowe) do przetestowania to:
<ul>
<li>0.1	- 1.0 ug/ mL oligomycyny</li>
<li>0.1	- 5.0 uM FCCP</li>
<li>0.1	- 1.0 uM rotenonu</li>
</ul>
Należy pamiętać, że odpowiedzi na każdy z powyższych związków (zwłaszcza FCCP) będą zależeć od składu pożywki do testu (typ bazy, [glucose], [pyruvate], obecność/brak BSA itp.). Ponadto, w przypadku zmiany składu pożywki do testu XF, konieczne będzie ponowne przeprowadzenie optymalizacji. Obecność i stężenie pirogronianu są szczególnie istotne dla uzyskania maksymalnej wydolności oddechowej po dodaniu FCCP. Firma Seahorse Bioscience zaobserwowała w wielu liniach komórkowych, że pominięcie pirogronianu znosi zdolność komórek do maksymalnej odpowiedzi (powyżej poziomu bazowego) na FCCP. Zazwyczaj należy przetestować stężenia pirogronianu w zakresie 1-10 mM, aby określić optymalne stężenie pozwalające na uzyskanie maksymalnego oddychania. Należy zauważyć, że [pyruvate] ORAZ [glucose] mogą wymagać „tytracji krzyżowej” w celu uzyskania optymalnych warunków pożywki dla danego eksperymentu.
Typowe wyniki tego eksperymentu przedstawiono poniżej na wykresie zależności OCR od czasu oraz na innym wykresie zależności ECAR od czasu:
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Wykres liniowy OCR przedstawiający odpowiedź metaboliczną na oligomycynę, FCCP i rotenon; czas w funkcji tempa zużycia tlenu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. OCR w funkcji czasu
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Wykres ECAR, aktywność metaboliczna w czasie przy zastosowaniu oligomycyny, FCCP i rotenonu, punkty danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. ECAR w funkcji czasu
W tym przypadku zaobserwowano oczekiwane odpowiedzi w zakresie OCR i ECAR podczas traktowania komórek kolejno poszczególnymi związkami. W przypadku oligomycyny OCR spada w wyniku zablokowania syntezy ATP w kompleksie V mitochondrium. Ponieważ komórki nie są w stanie syntetyzować ATP drogą OXPHOS, przechodzą na glikolizę, aby zaspokoić zapotrzebowanie na ATP, co skutkuje obserwowanym wzrostem ECAR. Jak wykazano wcześniej, FCCP działa jako czynnik rozprzęgający. Ponieważ komórki muszą teraz zniwelować przeciek protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, OCR znacząco wzrasta, gdyż zużywane jest więcej O2 w celu wypompowania nadmiaru protonów z powrotem przez błonę mitochondrialną. Na koniec rotenon hamuje odpowiednio kompleks I i kompleks III mitochondrium, co powoduje przerwanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a w konsekwencji drastyczny spadek zużycia O2.
<img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Wykres OCR w funkcji czasu przedstawiający oddychanie podstawowe, obrót ATP oraz wydolność oddechową z inhibitorami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Parametry oddychania
Poza oczekiwanymi zmianami w oddychaniu i ECAR, z tych danych można uzyskać szereg parametrów oddechowych. Zostało to podsumowane na powyższej rysunku:
Tutaj widzimy, że możemy uzyskać informacje o oddychaniu podstawowym komórek, procencie zużycia O2 przeznaczonym na produkcję ATP, a także ilości przeznaczonej na utrzymanie gradientu protonowego (wynikającego z wycieku H+). Ponadto możemy uzyskać maksymalną szybkość oddychania w warunkach oddychania rozprzężonego (czasami określanego jako rezerwowa wydolność oddechowa), a na koniec możemy określić ilość zużycia O2, która nie wynika z procesów mitochondrialnych.
Coraz więcej badań wykorzystuje ten profil mitochondrialny do oceny bioenergetyki komórkowej, identyfikacji dysfunkcji mitochondriów oraz przewidywania zdolności komórek do odpowiedzi na stres i/lub uszkodzenia. Aby uzyskać więcej informacji i szczegółów na temat tej metody eksperymentalnej oraz koncepcji rezerwowej wydolności oddechowej, należy zapoznać się z następującymi publikacjami 1-8.

<table><tbody><tr><td>Roztwory oligomycyny, FCCP, rotenonu i antymycyny A</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Zestaw Seahorse Mito Stress Test Kit</td></tr><tr><td>Medium robocze DMEM</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kalibracyjny</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów c2c12

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Zdolność do pomiaru metabolizmu komórkowego oraz zrozumienia dysfunkcji mitochondrialnych pozwoliła naukowcom na całym świecie na postępy w badaniach nad rolą funkcji mitochondriów w otyłości, cukrzycy, starzeniu się, nowotworach, funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego oraz w badaniach toksykologicznych i bezpieczeństwa.
Metabolizm komórkowy to proces pobierania substratów, takich jak tlen, glukoza, kwasy tłuszczowe i glutamina, oraz następująca po nim konwersja energii poprzez szereg enzymatycznie kontrolowanych reakcji utleniania i redukcji. Te wewnątrzkomórkowe reakcje biochemiczne skutkują produkcją ATP oraz uwalnianiem ciepła i produktów ubocznych, takich jak mleczan i CO2, do środowiska pozakomórkowego.
Cenne informacje o stanie fizjologicznym komórek oraz o zmianach tego stanu można uzyskać poprzez pomiar szybkości zużycia tlenu przez komórki, która jest wskaźnikiem oddychania mitochondrialnego – tzw. szybkości zużycia tlenu (Oxygen Consumption Rate) lub OCR. Komórki generują również ATP poprzez glikolizę, czyli konwersję glukozy do mleczanu, niezależnie od obecności tlenu. W hodowlach w studzienkach mleczan jest głównym źródłem protonów. Pomiar kwasu mlekowego wytwarzanego pośrednio poprzez protony uwalniane do medium zewnątrzkomórkowego otaczającego komórki, co powoduje zakwaszenie medium, pozwala wyznaczyć szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (Extra-Cellular Acidification Rate) lub ECAR.
W tym eksperymencie mioblasty C2C12 są wysiewane z określoną gęstością do płytek hodowlanych Seahorse. Mierzone są podstawowe tempo zużycia tlenu (OCR) oraz tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w celu ustalenia wartości bazowych. Następnie komórki są poddawane perturbacjom metabolicznym poprzez sekwencyjne dodawanie trzech różnych związków, które zmieniają profil bioenergetyczny komórki.
Niniejszy test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do oceny mitochondriów i stanowi podstawę do tworzenia bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie fizjologicznych i patofizjologicznych funkcji mitochondriów oraz przewidywanie zdolności komórek do reagowania na stres i/lub uszkodzenia.

Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Zdolność do pomiaru metabolizmu komórkowego i zrozumienia dysfunkcji mitochondrialnych pozwoliła naukowcom na całym świecie na posunięcie naprzód badań w zakresie...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest badanie statusu funkcjonalnego mitochondriów w żywych komórkach oraz w izolowanych mitochondriach poprzez pomiar wielu parametrów metabolizmu oksydacyjnego przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XF 96. Parametrami tymi są oddychanie podstawowe, obrót ATP, przeciek protonowy oraz oddychanie maksymalne lub rezerwowa zdolność oddechowa. Jest to realizowane poprzez sekwencyjne dodawanie specyficznych modulatorów oddychania mitochondrialnego do komórek mioblastów C2C12 i pomiar zmiany tempa zużycia tlenu, czyli OCR, będącego wskaźnikiem oddychania, oraz konwersji glukozy do mleczanu, która generuje ATP w procesie glikolizy.Drugim głównym szlakiem energetycznym w komórkach jest ECAR, czyli zewnątrzkomórkowy wskaźnik zakwaszenia. Można uzyskać wyniki profilowania mitochondriów, które dają wgląd w kluczową rolę, jaką funkcja mitochondriów odgrywa w określaniu długości życia komórek. Witam, nazywam się David Nichols.Przez całą moją karierę zajmowałem się badaniami nad mitochondriami, a najważniejszym urządzeniem, którego używałem w moich studiach, była elektroda tlenowa. Jeśli potrafisz zmierzyć tempo poboru tlenu w różnych warunkach przy użyciu izolowanych mitochondriów, uzyskujesz ogromną ilość istotnych informacji. Jednak w przypadku przejścia do badania komórek, zwłaszcza tych hodowanych na płytkach wielodołkowych lub na szkiełkach nakrywkowych, klasyczne metody nie sprawdzają się.Jest to poważny problem, który został rozwiązany kilka lat temu dzięki opracowaniu testu na płytkach wielodołkowych, umożliwiającego równoległe badanie oddychania komórek w formacie wielodołkowym. To, co zobaczą Państwo dzisiaj, to bardzo prosty, lecz bogaty w informacje eksperyment, który opracowaliśmy w celu monitorowania podstawowych funkcji bioenergetycznych mitochondriów w hodowlach komórkowych. Aby rozpocząć, należy wysiać komórki na płytki do hodowli komórek XF 96 w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek w 100 µL pożywki wzrostowej, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2.Komórki można poddać analizie w systemie XF 96 w 24 godziny po ich wysianiu przy użyciu testu. Kreator generuje szablon z następującym układem grup. Kolumny od 1 do 12 zawierają po 10 000 komórek C2C12.Grupa pierwsza, zaznaczona na niebiesko, służy jako komórki kontrolne. Grupie drugiej, zaznaczonej na czerwono, zostaną podane leki oligomycyna, FCCP oraz roone. Następnie należy przygotować związki w medium do testów X-F-D-M-E-M zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu.Oligo Mycin, FCCP i rotenon. Związki te są wcześniej odmierzone w zestawie XF cell MIT stress test. Używając stacji XF prep, zastąp pożywkę wzrostową pożywką roboczą DMEM.Na koniec inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla przez 60 minut, aby komórki mogły wstępnie wyrównać potencjał z medium do analizy przed dodaniem związków wstrzykiwanych do kartridża czujnika; doprowadź związki do temperatury 37 °C. Następnie wprowadź je do portów wtryskowych w następujący sposób. Dla kolumn od pierwszej do czwartej wprowadź odpowiednio 16, 18 i 20 µL medium do analizy XF lub DMEM do portów A, B i C.Dla kolumn od piątej do dwunastej należy nanieść 16 µL oligomycyny do portu A, 18 µL FCCP do portu B oraz 20 µL rotenonu do portu C. Następnie w ustawieniach protokołu należy ustawić liczbę powtórzeń pętli na trzy, czas mieszania na trzy minuty oraz czas pomiaru na trzy minuty. Na koniec należy kliknąć start.Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, które poinformują użytkownika o momencie załadowania kartridża po zakończeniu kalibracji. Postępuj zgodnie z komunikatami użytkownika i dodaj płytkę z komórkami do eksperymentu. Następnie kliknij kontynuuj i pozwól na przeprowadzenie analizy.Wyjmij płytkę po zakończeniu eksperymentu. Niniejszy test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do profilowania funkcji mitochondriów i stanowi podstawę do budowy bardziej złożonych eksperymentów mających na celu zrozumienie wpływu różnych związków na metabolizm komórkowy, funkcje mitochondriów oraz ogólną aktywność bioenergetyczną. W tym przypadku zaobserwowano oczekiwaną odpowiedź w tempie zużycia tlenu po potraktowaniu komórek kolejno każdym z związków.W przypadku ligamycyny poziom ATP spadł w wyniku zablokowania syntezy ATP w kompleksie V mitochondrium. Ponieważ po zastosowaniu ligamycyny komórki nie były w stanie syntetyzować ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, powróciły do glikolizy, aby zaspokoić zapotrzebowanie na ATP. W związku z tym zaobserwowaliśmy wzrost ECAR (wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego), który, jak wykazano wcześniej, jest wskaźnikiem glikolizy. FCCP działa jako czynnik rozprzęgający i znosi ograniczenie powrotu protonów.Oddychanie przyspiesza i jest teraz ograniczone przez transport elektronów. Na koniec rotenon hamuje kompleks I mitochondriów, co powoduje zatrzymanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a w konsekwencji drastycznie zmniejsza zużycie tlenu. W ten sposób uzyskuje się informacje o oddychaniu podstawowym komórek, procencie zużycia tlenu przeznaczonym na produkcję ATP, a także o ilości przeznaczonej na utrzymanie gradientu protonowego wynikającego z wycieku protonów.Ponadto możemy uzyskać maksymalną szybkość oddychania w warunkach oddychania rozsprzęganego, co czasem określa się mianem rezerwowej wydolności oddechowej. I wreszcie możemy określić ilość zużycia tlenu niezwiązaną z procesami mitochondrialnymi. Właśnie zaprezentowano to za pomocą urządzenia Seahorse.XF 96 to seria eksperymentów dostarczających ogromnej ilości informacji na temat energetyki BIE mitochondriów w komórce. Podstawowy eksperyment, który jest kluczowy i określany jako eksperyment numer jeden, dostarcza informacji o oddychaniu podstawowym, obrocie ATP, przecieku protonów w mitochondriach oraz rezerwowej wydolności oddechowej. Parametry te dają fundamentalną wiedzę o stanie bioenergetycznym mitochondriów w komórce.

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Eksperyment profilu bioenergtycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

W tym protokole przedstawiamy procedury tworzenia modeli mioblastów dystrofii 1 dyotonii, w tym zoptymalizowane utrzymanie komórek C2C12, transfekcję/transdukcję genów i różnicowanie miocytów.

Modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów C2C12

Mitochondria komórek śródbłonka są niezbędne do utrzymania integralności bariery krew-mózg. Wprowadzamy protokół pomiaru funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych.

Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Badanie metabolizmu staje się coraz bardziej istotne dla badań immunologicznych. W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w mysich splenocytach oraz limfocytach T i B.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Dostarczamy protokół do stabilnego niszczenia genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w mioblastach C2C12 za pomocą małego spinki do włosów (sh) RNA. Na przykładzie ADAMTSL2 opisujemy metody walidacji skuteczności knockdown na poziomie mRNA, białka i komórki podczas różnicowania mioblastów C2C12 do miotub.

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.

Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Poznaj metodę profilowania bioenergetycznego mitochondriów w żywych komórkach C2C12 z wykorzystaniem analizatora XF 96. Technika ta mierzy podstawową respirację, produkcję ATP, wyciek protonów i rezerwę oddechową.

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Przeglądaj więcej filmów