Eksperyment z profilem bioenergetycznym z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przetestowanie stanu funkcjonalnego mitochondriów w żywych komórkach i izolowanych mitochondriach poprzez pomiar wielu parametrów metabolizmu oksydacyjnego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XF 96. Parametry te to oddychanie podstawowe, obrót A TP, wyciek protonów i maksymalne oddychanie lub zapasowa pojemność oddechowa. Osiąga się to poprzez sekwencyjne dodawanie specyficznych modulatorów oddychania mitochondrialnego do C dwóch komórek mioblastów C 12 i pomiar zmiany szybkości zużycia tlenu lub OAR, wskaźnika oddychania, konwersji glukozy do mleczanu, który generuje TP w wyniku glikolizy.

Drugi główny szlak energetyczny w komórkach jest również mierzony jako ECAR lub wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego. Można uzyskać wyniki profilowania mitochondriów, które zapewniają wgląd w kluczową rolę, jaką funkcja mitochondriów odgrywa w określaniu długości życia komórek. Cześć, nazywam się David Nichols.

Przez całą moją karierę byłem artystą mitochondrialnym, a najważniejszym sprzętem, którego używałem w moich badaniach, była elektroda tlenowa. Jeśli możesz zmierzyć tempo poboru tlenu w różnych warunkach za pomocą izolowanych mitochondriów, uzyskasz ogromną ilość ważnych informacji. Kiedy przechodzisz do komórek, zwłaszcza komórek, które są hodowane na płytce wielodołkowej lub na szkiełku nakrywkowym, klasyczne metody nie działają.

Jest to poważny problem, który został rozwiązany kilka lat temu dzięki opracowaniu testu z płytką wielodołkową, umożliwiającego nam badanie oddychania komórek równolegle w formacie płytki wielodołkowej. To, co zobaczycie dzisiaj, to bardzo prosty, ale bogaty w informacje eksperyment, który opracowaliśmy w celu monitorowania podstawowych funkcji bioenergetycznych mitochondriów w hodowanych komórkach nasiennych To Begin. W XF 96 płytki do hodowli komórkowych z 10 000 komórek na studzienkę w 100 mikrolitrach wzrostu, pożywkę i umieszczenie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla.

Komórki można oznaczyć w XF 96, 24 godziny po wysiewie za pomocą testu. Kreator generuje szablon z następującym układem grupy. Kolumny od pierwszej do dwunastej zawierają 10 000 C dwie komórki C 12.

Grupa pierwsza w kolorze niebieskim jest używana jako komórki kontrolne. Grupie drugiej w kolorze czerwonym będą podawane leki oligo Mycin, FCCP i roone. Następnie przygotuj związki w pożywce testowej X-F-D-M-E-M, zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu.

Oligo Mycyna, FCCP, zgniły znany. Związki te są wstępnie dozowane w zestawie do testów warunków skrajnych MIT XF cell. Korzystając ze stacji przygotowawczej XF, zastąp pożywkę wzrostową pożywką roboczą DMEM.

Na koniec inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla przez 60 minut, aby umożliwić komórkom wstępne zrównoważenie z testem Pożywka przed dodaniem związków do wstrzykiwań do wkładu czujnika uformuj związki do 37 stopni Celsjusza. Następnie załaduj je do portów wtryskiwaczy w następujący sposób. W przypadku kolumn od pierwszej do czwartej załaduj 16, 18 i 20 mikrolitrów pożywki testowej XF lub DMEM odpowiednio do portów A, B i C.

Dla kolumn od piątej do dwunastej załaduj 16 mikrolitrów całej liga mycyny do portu A, 18 mikrolitrów FCCP do portu B i 20 mikrolitrów zgnilizny znanej do portu C.Następnie zdefiniuj protokół Polecenia ustaw pętlę na trzy razy. Mieszaj do trzech minut i odmierzaj do trzech minut. Następnie kliknij Start.

Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, które poinstruują użytkownika, kiedy należy załadować wkład po zakończeniu kalibracji. Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkownika i dodaj płytkę komórkową do eksperymentu. Następnie kliknij przycisk Kontynuuj i zezwól na uruchomienie testu.

Wyjmij płytkę po zakończeniu eksperymentu. Test ten wywodzi się z klasycznego eksperymentu mającego na celu profilowanie funkcji mitochondriów i służy jako rama, za pomocą której można budować bardziej złożone eksperymenty mające na celu zrozumienie różnych złożonych skutków dla metabolizmu komórkowego, funkcji mitochondriów i ogólnej aktywności bioenergetycznej. Tutaj zaobserwowaliśmy oczekiwaną reakcję w tempie zużycia tlenu, gdy komórki były traktowane każdym sukcesem związku.

Dla liga Mycin Oard zmniejszył się w wyniku zablokowania syntezy TP w kompleksie mitochondrialnym piątym. Ponieważ komórki nie były w stanie zsyntetyzować TP poprzez fosforylację oksydacyjną po leczeniu liga mycyną, powróciły do glikolizy, aby zaspokoić swoje zapotrzebowanie na TP. W ten sposób zaobserwowaliśmy wzrost ECAR, wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, wskaźnika glikolizy, jak pokazano wcześniej. FCCP działa jako czynnik rozprzęgający i usuwa ograniczenie ponownego wejścia w atmosferę protonu.

Oddychanie przyspiesza i jest teraz ograniczone przez transport elektronów. Wreszcie, znana rota hamuje kompleks mitochondrialny jeden, co powoduje zatrzymanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a co za tym idzie zużycie tlenu zostało drastycznie zmniejszone. Tutaj uzyskuje się informacje o podstawowym oddychaniu komórek, procentowym zużyciu tlenu przeznaczonym na produkcję TP, a także ilości poświęconej na utrzymanie gradientu protonów z powodu wycieku protonów.

Co więcej, możemy uzyskać maksymalną częstość oddechów w warunkach oddychania niesprzężonego, czasami określanych jako zapasowa wydolność oddechowa. I wreszcie, możemy określić ilość zużycia tlenu, która nie jest spowodowana procesami mitochondrialnymi. Właśnie widziałeś z konikiem morskim.

XF 96, seria eksperymentów, które dostarczają ogromnej ilości informacji na temat energetyki BIE mitochondriów w komórce. Podstawowy eksperyment, który jest tak ważny, że nazywamy go eksperymentem numer jeden, dostarcza informacji na temat oddychania podstawowego, obrotu TP, wycieku protonów mitochondrialnych i wolnej pojemności oddechowej. Parametry te dostarczają podstawowych informacji na temat statusu bioenergetycznego mitochondriów w komórce.