Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przetestowanie stanu funkcjonalnego mitochondriów w żywych komórkach oraz w izolowanych mitochondriach poprzez pomiar wielu parametrów metabolizmu oksydacyjnego przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XF 96. Parametrami tymi są oddychanie podstawowe, obrót ATP, przeciek protonów oraz oddychanie maksymalne lub rezerwowa zdolność oddechowa. Jest to osiągane poprzez sekwencyjne dodawanie specyficznych modulatorów oddychania mitochondrialnego do komórek mioblastów C2C12 i pomiar zmian w szybkości zużycia tlenu, czyli OCR, która jest wskaźnikiem oddychania, a także konwersji glukozy do mleczanu, co generuje ATP w procesie glikolizy.

Inną główną ścieżką energetyczną w komórkach jest ECAR, czyli zewnątrzkomórkowy wskaźnik zakwaszenia. Można uzyskać wyniki profilowania mitochondriów, które dostarczają informacji o centralnej roli, jaką funkcja mitochondriów odgrywa w określaniu długości życia komórek. Witam, nazywam się David Nichols.

Przez całą swoją karierę zajmowałem się badaniami nad mitochondriami, a najważniejszym sprzętem, z którego korzystałem w moich studiach, była elektroda tlenowa. Pomiar szybkości poboru tlenu w różnych warunkach przy użyciu izolowanych mitochondriów pozwala uzyskać ogromną ilość istotnych informacji. Jednak w przypadku przejścia do badań na komórkach, zwłaszcza tych hodowanych na płytkach wielodołkowych lub na szkiełkach podstawkowych, klasyczne metody okazują się nieskuteczne.

Jest to poważny problem, który został rozwiązany kilka lat temu dzięki opracowaniu testu na płytkach wielodołkowych, umożliwiającego nam równoległe badanie respiracji komórek w formacie wielodołkowym. To, co zobaczycie dzisiaj, to bardzo prosty, ale bogaty w informacje eksperyment, który opracowaliśmy w celu monitorowania podstawowej funkcji bioenergetycznej mitochondriów w hodowlach komórkowych. Aby rozpocząć, należy wysiać komórki w płytkach hodowlanych XF 96 w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek w 100 µL pożywki wzrostowej i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2.

Komórki można poddać analizie w systemie XF 96, 24 godziny po ich wysianiu zgodnie z protokołem. Kretka (Wizard) generuje szablon z następującym układem grup. Kolumny od pierwszej do dwunastej zawierają po 10 000 komórek C two C 12.

Grupa pierwsza, zaznaczona na niebiesko, służy jako komórki kontrolne. Grupie drugiej, zaznaczonej na czerwono, zostaną podane leki oligomycyna, FCCP oraz roone. Następnie należy przygotować związki w podłożu assay X-F-D-M-E-M zgodnie z opisem zawartym w pisemnej części protokołu.

Oligomycyna, FCCP, rotenon. Związki te są wcześniej odmierzone w zestawie XF cell MIT stress test kit. Przy użyciu stacji XF prep station należy zastąpić medium wzrostowe medium roboczym DMEM.

Na koniec inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla przez 60 minut, aby umożliwić ich wstępne wyrównanie z medium do analizy przed dodaniem wstrzykiwanych związków do wkładu czujnika; doprowadź związki do temperatury 37 °C. Następnie wprowadź je do portów wtryskowych w następujący sposób. W przypadku kolumn od pierwszej do czwartej, wprowadź odpowiednio 16, 18 i 20 µL medium do analizy XF lub DMEM do portów A, B i C.

W kolumnach od piątej do dwunastej należy nanieść 16 µL oligomycyny do portu A, 18 µL FCCP do portu B oraz 20 µL rotenonu do portu C. Następnie w ustawieniach protokołu należy zdefiniować liczbę powtórzeń pętli (loop) na trzy, czas mieszania (mix) na trzy minuty oraz czas pomiaru (measure) na trzy minuty. Na koniec należy kliknąć start.

Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, które poinformują użytkownika, kiedy załadować kartridż po zakończeniu kalibracji. Postępuj zgodnie z komunikatami i wprowadź płytkę z komórkami do eksperymentu. Następnie kliknij kontynuuj i pozwól na przeprowadzenie analizy.

Wyjmij płytkę po zakończeniu eksperymentu. Ten test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do profilowania funkcji mitochondriów i stanowi podstawę do budowy bardziej złożonych doświadczeń mających na celu zrozumienie wpływu różnych związków na metabolizm komórkowy, funkcje mitochondriów oraz ogólną aktywność bioenergetyczną. W tym przypadku zaobserwowano oczekiwaną reakcję w tempie zużycia tlenu po potraktowaniu komórek kolejnymi związkami.

W przypadku ligamycyny poziom ATP spadł w wyniku zablokowania syntezy ATP w kompleksie V mitochondrium. Ponieważ po zastosowaniu ligamycyny komórki nie były w stanie syntetyzować ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, powróciły do glikolizy, aby zaspokoić zapotrzebowanie na ATP. W związku z tym zaobserwowaliśmy wzrost ECAR (wskaźnika zewnątrzkomórkowego tempo zakwaszenia), który, jak wykazano wcześniej, jest wskaźnikiem glikolizy. FCCP działa jako czynnik rozprzęgający i znosi ograniczenie powrotu protonów.

Oddychanie przyspiesza i jest obecnie ograniczane przez transport elektronów. Na koniec dodano rotenon, który hamuje kompleks I mitochondriów, co powoduje zatrzymanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a w konsekwencji drastycznie zmniejsza zużycie tlenu. Pozwala to na uzyskanie informacji o oddychaniu podstawowym komórek, procencie zużycia tlenu przeznaczonym na produkcję ATP, a także o ilości tlenu zużywanego na utrzymanie gradientu protonowego w wyniku przecieku protonów.

Ponadto możemy wyznaczyć maksymalną szybkość oddychania w warunkach oddychania rozsprzężonego, co niekiedy określa się mianem rezerwowej pojemności oddechowej. Na koniec możemy określić ilość zużycia tlenu, która nie wynika z procesów mitochondrialnych. Właśnie zaprezentowaliśmy to z wykorzystaniem analizatora Seahorse.

XF 96 to seria doświadczeń, które dostarczają ogromnej ilości informacji na temat bioenergetyki mitochondriów w komórce. Podstawowy eksperyment, który jest niezwykle istotny i nazywamy go eksperymentem numer jeden, dostarcza informacji o respiracji podstawowej, obrocie ATP, przecieku protonowym mitochondriów oraz rezerwowej wydolności oddechowej. Parametry te dają fundamentalne informacje o stanie bioenergetycznym mitochondriów w komórce.