Zestaw narzędzi analitycznych do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkryptomu biofilmów jamy ustnej, w których pośredniczą paciorkowce Mutans
25 stycznia 2011
Biofilmy powstające na powierzchni zębów są bardzo złożone i narażone na ciągłe wrodzone i egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię i transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów biofilmów jamy ustnej, które można dostosować do innych obszarów badań nad biofilmem.
Biofilmy powstające na powierzchniach zębów są bardzo złożone i ustrukturyzowane. Społeczności drobnoustrojów uwikłane w macierz zewnątrzkomórkową, które są narażone na ciągłe wyzwania środowiskowe. Ogólnym celem jest pokazanie dwóch konkretnych elementów zestawu narzędzi analitycznych zaprojektowanych w celu ułatwienia badań strukturalnych i molekularnych, biorąc pod uwagę złożoną naturę biofilmów jamy ustnej poprzez połączenie nowatorskiej techniki obrazowania fluorescencyjnego z niestandardowym oprogramowaniem do przetwarzania i analizy danych.
Osiąga się to poprzez wybór najpierw konkretnych testów do analizy biofilmu, transkryptomu i struktury, w tym nowego podejścia do obrazowania konfokalnego do jednoczesnej wizualizacji EPS i bakterii. Drugim krokiem procedury jest zebranie surowych danych z testów biologicznych. Trzecim krokiem jest przetworzenie surowych danych za pomocą specjalnego oprogramowania, w tym nowo opracowanego duo stat do analizy kolokalizacji.
Ostatnim krokiem jest analiza danych procesowych, w tym wykorzystanie oprogramowania do eksploracji i organizacji danych z mikromacierzy, wizualizatora danych lub MDV. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, w jaki sposób patogeny jamy ustnej zmieniają swój transkryptom i architekturę biofilmów w odpowiedzi na złożoną dietę i interakcje mikrobiologiczne gospodarza, korzystając z naszego unikalnie zintegrowanego zestawu narzędzi analitycznych, zapewniając bardziej kompleksową analizę biofilmu i interpretację danych. Cześć, nazywam się Michelle Kuh i jestem profesorem nadzwyczajnym w centrum biologii Foral w Universal of Rochester Medical Center.
Dziś prezentujemy zestaw narzędzi analitycznych do analizy biofilmu. Ten zestaw narzędzi może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad biofilmem, takie jak struktura komórek biofilmu, ich układ z macierzą zewnątrzkomórkową oraz sposób, w jaki reagują one na złożone wyzwania środowiskowe na poziomie transkryptomicznym. Nazywam się Jean, ona, jestem doktorantem w laboratorium Dr.Ks.
Dzisiaj zamierzam zademonstrować część naszego zestawu narzędzi związaną z obrazowaniem. Cześć, nazywam się Aise Klein. Jestem adiunktem naukowym w laboratorium Dr.Ks.
Dzisiaj przedstawię oprogramowanie MDV do analizy danych mikrorentgenowskich. W tej procedurze pokryte śliną krążki hydroksylowe apetytu są używane jako substytuty powierzchni zębów, na których rosną biofilmy. Najpierw dodaj 2,8 mililitra pożywki hodowlanej zaszczepionej mutantami S w każdym dołku 24-dołkowej płytki chroniącej płytkę przed światłem przy sprzężonym z dekstryną barwniku LOR 6 47 do każdej studzienki do końcowego stężenia jednego mikromola i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać barwnik z pożywką hodowlaną.
Następnie, za pomocą sterylnych kleszczy do zanurzania, umyj sterylne krążki hydroksyapatytu pokryte śliną dwukrotnie w sterylnym buforze AB, aby usunąć nadmiar śliny lub niezwiązanych składników śliny. Następnie umieść krążki pionowo w pożywce hodowlanej uzupełnionej barwnikiem, upewniając się, że każdy krążek jest całkowicie zanurzony. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 20 godzin, aby umożliwić utworzenie biofilmów i włączenie sprzężonej tekstury do polisacharydów egzo wytwarzanych przez komórki bakteryjne.
Aby najpierw oznaczyć komórki bakteryjne, przygotuj 24-dołkową płytkę z 2,8 mililitra sterylnej wody mili Q na studzienkę. Dodaj 1,5 mikrolitra barwnika cyto nine do każdej studzienki do końcowego stężenia jednego mikromola i chroń płytkę przed światłem. Po utworzeniu się biofilmu należy wyjąć płytkę zawierającą krążki z zanurzenia w inkubatorze.
Umyj każdy krążek w roztworze 0,89% chlorku sodu. Następnie przenieś je na nową płytkę zawierającą barwnik cyto nine. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po wybarwieniu komórek zanurz biofilmy i chlorek sodu jak poprzednio. Następnie za pomocą kleszczy uwolnij biofilmy z drutu na szalkę Petriego zawierającą chlorek sodu. Owiń szalkę Petriego folią aluminiową.
Biofilmy są teraz gotowe do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Zeskanuj każdy biofilm w pięciu do 10 losowo wybranych pozycjach i wygeneruj serię Z w każdej pozycji. Aby umożliwić rekonstrukcje 3D, otwórz obrazy konfokalne i przetwórz je za pomocą oprogramowania lustrzanego.
To trójwymiarowe renderowanie obrazów konfokalnych wytworzonych za pomocą programu, Amira, pokazuje biofilm mutantów S utworzony na apatycznej powierzchni przy użyciu zademonstrowanej procedury. Komórki bakteryjne i mikrokolonie są widoczne w kolorze zielonym i są osadzone w matrycy biofilmu zawierającej polisacharydy egzo. Na czerwono można wygenerować zbliżenie wybranego obszaru, który ilustruje specyficzną zależność strukturalną EPS między konkretnymi bakteriami w skali mikro.
Użyj programu duos stat, aby określić ilościowo stopień kolokalizacji oddzielnych składników biofilmu, takich jak bakterie i polisacharydy egzo. Najpierw skonfiguruj ścieżkę nowo opracowanego duo stat w MATLAB w wersji 5.1 i otwórz foldery obrazów zawierające obrazy serii Z dwóch komponentów biofilmu. Następnie wybierz dwa kanały, które będą ze sobą skorelowane i przeanalizowane.
Dwa stosy obrazów muszą mieć identyczne rozmiary pikseli we wszystkich wymiarach i taką samą liczbę obrazów w każdym stosie. Ustaw progi dla każdego kanału i postępuj zgodnie z instrukcjami w interfejsie oprogramowania, a następnie wprowadź dane do pliku przetwarzania danych w celu analizy. Ten rysunek pokazuje, w jaki sposób duo stack ilościowo interpretuje relacje przestrzenne między bakteriami a DBS.
W obrębie biofilmu stos Duo oblicza pionowy rozkład bakterii i DPS od powierzchni dysku do fazy płynnej, jak pokazano tutaj na zielonej linii dla bakterii i czerwonej linii dla EPS. Oblicza również kolokalizację bakterii i DPS na całej grubości biofilmu. Jak pokazano na żółtej linii, dane pokazują wyższe proporcje EPS niż bakterii na całej głębokości biofilmu, a większość komórek bakteryjnych jest związana z EPS, zwłaszcza od środkowych warstw i w górę Duo stat z renderowaniem 3D zapewnia lepsze zrozumienie organizacji strukturalnej i interakcji bakterii i DPS w biofilmach.
W celu zapewnienia wysokiej jakości RNA pozyskiwanego z biofilmów zalecamy, aby ekstrakcja RNA odbywała się zgodnie z protokołem specyficznym dla biofilmu opisanym w artykule Curian KU opublikowanym w 2007 roku. W czasopiśmie wykorzystano standardowe protokoły biochemii analitycznej do przygotowania mikromacierzy CD NA i ilościowych testów PCR w czasie rzeczywistym. Aby ułatwić analizę dużych zbiorów danych generowanych przez eksperymenty z mikromacierzami, zaprojektowaliśmy oprogramowanie do eksploracji i organizacji danych, wizualizator danych mikromacierzy lub MDV, które jest dostępne online pod adresem www.oralgen.anl.gov.
Przed przesłaniem danych do MDV należy przeprowadzić analizę statystyczną, taką jak sparowany test T z modelem wariancji losowej, korzystając z dostępnego online oprogramowania BRB array tool z wartością odcięcia P wynoszącą 0,001 w celu porównania klas. W tej przykładowej analizie baraniny przeprowadzono biofilmy wyhodowane w trzech różnych stężeniach cukru i czterech punktach czasowych. Porównano pary z trzema plikami BRB: warunek 0,5% sacharozy plus 1% skrobi kontra 1% sacharozy warunek B 0,5% sacharoza plus 1% skrobia kontra 0,5% sacharozy i warunek C 0,5% sacharozy kontra 1% sacharozy.
Panel ten reprezentuje liczbę genów wykrytych jako różnie wyrażonych w każdym stanie i punkcie czasowym, ocenianych przez porównanie klas standardowych przy użyciu narzędzia BRB array tool, co daje dużą liczbę genów o nazwie BRB raw data. Aby zademonstrować MDV, skupimy się na punkcie czasowym 30 godzin przy użyciu programu Excel. Konwertuj nieprzetworzone dane BRB na pliki tekstowe z ograniczoną kartą MDV.
Pamiętaj, aby usunąć wszystkie litery, które są dostarczane z numerem karty locus genu, na przykład w nazwie SMU dot 1432 C. Usuń literę C, otwórz MDV. Otwórz menu plików i wybierz opcję wybierz źródło adnotacji. Wybierz opcję pliku płaskiego, gdy pojawi się okno dialogowe.
Użyj przycisków przeglądania, aby wybrać pliki, które zawierają adnotacje dotyczące ontologii genów, numeru, ścieżki, klasyfikacji funkcjonalnej, danych klasyfikacyjnych i nazwy genu. Przejdź do pliku i zaimportuj każdy z plików przekonwertowanych do formatu MDV. Każdy plik reprezentuje warunek eksperymentalny.
Porównaj geny wyrażone w każdym warunku eksperymentalnym A i B w porównaniu z C.In tym przykładzie, korzystając z funkcji diagramu Venna. W tej demonstracji skupiamy się na genach o zróżnicowanej ekspresji, które są jednoznacznie związane z wpływami sacharozy i skrobi w połączeniu. Funkcja oparta na diagramie Venna służy do wizualizacji liczby unikalnych i wspólnych genów ulegających ekspresji w tych różnych warunkach i pomaga nam w identyfikacji tych, które mają zostać wybrane do dalszej analizy.
Tutaj wybieramy tylko geny o zróżnicowanej ekspresji, które są unikalne w stanie A i lub B, ale nie te wykryte w C, jak pokazano na szaro, jak pokazano tutaj. MDV znacznie zmniejszyło całkowitą liczbę genów do analizy, a jednocześnie odfiltrowało geny nieistotne dla przypadku eksperymentalnego. Z menu pliku wybierz opcję eksportu, aby zapisać dane.
Jako pliki z ograniczonymi zakładkami, pliki można następnie otworzyć w programie Excel, gdzie dane wyjściowe można uporządkować i przekonwertować na żądane wyświetlacze graficzne. Organizacja danych w programie Excel umożliwia graficzne przedstawienie danych wyjściowych MDV. Wykres ten przedstawia przegląd zróżnicowanej ekspresji unikalnych funkcjonalnych podzbiorów genów, na które wpływa połączenie skrobi i sacharozy na różnych etapach rozwoju biofilmu.
Wpływ na transkryptom mutantów S jest bardziej wyraźny po 30 godzinach rozwoju biofilmu niż w innych punktach czasowych. Wyniki pomogły nam zidentyfikować precyzyjnie określone funkcjonalne podzbiory genów, które są istotne dla naszej hipotezy roboczej, biorąc pod uwagę efekty czasowe, które ułatwiły selekcję genów i dalszy proces walidacji. Po tej procedurze można również zastosować metody biochemiczne i proteomiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzne reakcje fizjologiczne i metaboliczne organizmów w biofilmach.
Taka kompleksowa i zintegrowana analiza z pewnością pomogłaby lepiej zrozumieć, w jaki sposób biofilmy modulują patogenność w jamie wewnętrznej, która jest bardzo dynamicznym i złożonym środowiskiem. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z plikiem PDF dołączonym do tego artykułu wideo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na złożonej naturze biofilmów powstających na powierzchniach zębów, podkreślając ich organizację strukturalną i ekspresję genów. Wprowadzono nowe narzędzie analityczne w celu ułatwienia badania biofilmów jamy ustnej poprzez zaawansowane techniki obrazowania i oprogramowanie do przetwarzania danych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Ekologia mikrobiologiczna
- Badania nad biofilmami
- Zdrowie jamy ustnej
Tło
- Biofilmy to złożone społeczności mikroorganizmów.
- Są uwięzione w macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Biofilmy są narażone na ciągłe wyzwania środowiskowe.
- Zrozumienie ich struktury i fizjologii jest kluczowe dla zdrowia jamy ustnej.
Cel badania
- Opracowanie zestawu narzędzi do analizy biofilmów jamy ustnej.
- Połączenie obrazowania fluorescencyjnego z niestandardowym oprogramowaniem do analizy danych.
- Ułatwienie badań strukturalnych i molekularnych biofilmów.
Stosowane metody
- Dobór specyficznych metod analizy biofilmów.
- Nowe podejście do konfokalnego obrazowania dla jednoczesnej wizualizacji.
- Zbieranie danych surowych z biotestów.
- Przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania duo stat do analizy kolokalizacji.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja substancji polimerycznych pozakomórkowych (EPS) i bakterii.
- Skuteczne przetwarzanie danych za pomocą niestandardowego oprogramowania.
- Wgląd w strukturalną organizację biofilmów jamy ustnej.
- Zgłębienie rozumienia ekspresji genów w biofilmach.
Wnioski
- Opracowany zestaw narzędzi można dostosować do szerszych badań nad biofilmami.
- Łączenie technik obrazowania z oprogramowaniem pomaga w zrozumieniu złożoności biofilmów.
- To podejście może prowadzić do postępów w badaniach nad zdrowiem jamy ustnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Oral biofilm research faces challenges in capturing dynamic structural and molecular interactions under complex oral conditions. An integrated analytical toolbox combining imaging, transcriptomics, and custom software enables mechanistic de-risking of virulence pathways in mutans streptococci. This supports target validation and predictive confidence in anti-caries therapeutic development by linking biofilm architecture to gene expression changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking extracellular polysaccharide production to bacterial colonization dynamics in biofilms.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous visualization of EPS and bacteria via novel fluorescence labeling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying gene expression patterns associated with sucrose and starch exposure that modulate pathogenicity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biofilm models for downstream compound screening by standardizing growth on saliva-coated hydroxyapatite discs.
- Quantitative Output: Generates reproducible colocalization metrics via DuoStat software to assess spatial relationships between bacterial cells and EPS.
- Scalability: Facilitates high-throughput temporal evaluation and multi-species inclusion under controlled carbohydrate conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase biofilm analysis to preclinical validation through temporal transcriptome profiling at 30 hours.
- Biomarker Alignment: Identifies differentially expressed gene subsets relevant to starch-sucrose interactions as potential virulence biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by filtering non-relevant genes via MDV software to focus on mechanistically relevant pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The toolbox integrates across discovery biology, screening analytics, and translational research by linking structural imaging to molecular profiling in a reproducible workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how diet-derived carbohydrates influence biofilm architecture and microbial organization.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through standardized biofilm formation and dual-channel imaging.
- Analytics: Provides statistical analysis inputs (e.g., paired T-test with BRB array tool) and gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects biofilm development stages to gene expression changes, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for biofilm analysis adaptable to various microbial species and environmental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating EPS distribution with bacterial localization across biofilm depth.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined biofilm growth, staining, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of anti-virulence targets through integrated structural-transcriptomic analysis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by highlighting condition-specific gene expression patterns linked to cariogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescence labeling, and microarray data analysis.
- Dependent on MATLAB-based DuoStat and MDV software for colocalization and data mining.
- Needs cross-team standardization for biofilm growth, RNA extraction, and statistical analysis workflows.
- Adaptation considerations include model system compatibility and carbohydrate condition controls.
- Practical limitations include dependency on specific dyes (Dextran-conjugated LOR 647, Cyto9) and biofilm model reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
2:17
Fluorescent Labeling of Exopolysaccharides and Bacterial Cells in Biofilms
4:12
Biofilm Image Acquisition and Data Analysis
4:58
Biofilm Structural Analysis and Quantification
6:25
Transcriptome Analysis of Biofilms
9:51
Differential Gene Expression in S. mutans Biofilms Formed in the Presence of Different Dietary Carbohydrates
10:28
Conclusion
