Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i ustrukturyzowane. Społeczności drobnoustrojów są uwikłane w macierz zewnątrzkomórkową i narażone na ciągłe wyzwania środowiskowe. Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie dwóch konkretnych elementów zestawu analitycznego zaprojektowanego w celu ułatwienia badań strukturalnych i molekularnych, uwzględniających złożoną naturę biofilmu jamy ustnej poprzez połączenie nowatorskiej techniki obrazowania fluorescencyjnego z dedykowanym oprogramowaniem do przetwarzania i analizy danych.

Osiąga się to najpierw poprzez wybór specyficznych testów do analizy biofilmu, transkryptomu i struktury, w tym nowej metody obrazowania konfokalnego do jednoczesnej wizualizacji EPS i bakterii. Drugim krokiem procedury jest zebranie surowych danych z testów biologicznych. Trzecim krokiem jest przetworzenie surowych danych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania, w tym nowo opracowanego programu duo stat do analizy kolokalizacji.

Ostatnim krokiem jest analiza danych procesowych, obejmująca wykorzystanie oprogramowania do organizowania i eksploracji danych z mikromacierzy Microarray Data Visualizer, czyli MDV. W rezultacie można uzyskać wyniki pokazujące, w jaki sposób patogeny jamy ustnej zmieniają swój transkryptom oraz architekturę biofilmu w odpowiedzi na złożoną dietę i interakcje z mikrobiotą gospodarza, przy użyciu naszego unikalnego, zintegrowanego zestawu narzędzi analitycznych, co pozwala na bardziej kompleksową analizę biofilmu i interpretację danych. Dzień dobry, nazywam się Michelle Kuh i jestem profesorem adiunktem w centrum biologii jamy ustnej na University of Rochester Medical Center.

Dzisiaj przedstawiamy zestaw narzędzi analitycznych do analizy biofilmu. Zestaw ten może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad biofilmem, takie jak struktura komórek biofilmu, ich rozmieszczenie w macierzy zewnątrzkomórkowej oraz sposób, w jaki reagują one na złożone wyzwania środowiskowe na poziomie transkryptomicznym. Nazywam się Jean, jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr Ks.

Dzisiaj zaprezentuję część naszego zestawu narzędzi dotyczącą obrazowania. Cześć, nazywam się Aise Klein. Jestem adiunktem w laboratorium dr. Ks.

Dzisiaj zaprezentuję oprogramowanie MDV do analizy danych z mikromierzaczy. W tej procedurze jako substytuty powierzchni zęba, na których hodowane są biofilmy, wykorzystuje się dyski z hydroksyapatytu pokryte śliną. Najpierw do każdej studzienki płytki 24-dołkowej należy dodać 2,8 ml pożywki hodowlanej zaszczepionej S. mutans, chroniąc płytkę przed światłem, a następnie do każdej studzienki dodać barwnik LOR 6 47 sprzężony z dekstryną do stężenia końcowego 1 µM i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać barwnik z pożywką hodowlaną.

Następnie, używając sterylnej pęsety, dwukrotnie opłucz sterylne krążki hydroksyapatytu pokryte śliną w sterylnym buforze AB, aby usunąć nadmiar śliny lub niezwiązane składniki śliny. Następnie umieść krążki pionowo w pożywce hodowlanej z dodatkiem barwnika, upewniając się, że każdy krążek jest całkowicie zanurzony. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 20 godzin, aby umożliwić utworzenie się biofilmu i wbudowanie sprzężonego barwnika w egzo-polisacharydy produkowane przez komórki bakteryjne.

Aby najpierw oznakować komórki bakteryjne, należy przygotować płytkę 24-dołkową, wlewając do każdego dołka 2,8 milliliters sterylnej wody Milli-Q. Do każdego dołka należy dodać 1,5 microliters barwnika Cyto9 do stężenia końcowego 1 micromolar i zabezpieczyć płytkę przed światłem. Po uformowaniu się biofilmu należy wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą krążki.

Przemyj każdy krążek w roztworze 0,89% chlorku sodu. Następnie przenieś je na nową płytkę zawierającą barwnik cyto nine. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po zabarwieniu komórek, zanurz i przemyj biofilmy w chlorku sodu, postępując jak poprzednio. Następnie, używając pęsety, przenieś biofilmy z drutu do szalki Petriego zawierającej chlorek sodu. Owiń szalkę Petriego folią aluminiową.

Biofilmy są teraz gotowe do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu skaningowego. Przeskanuj każdy biofilm w pięciu do 10 losowo wybranych pozycjach i wygeneruj serie Z w każdej z nich. Aby umożliwić rekonstrukcję 3D, otwórz obrazy konfokalne i przetwórz je przy użyciu oprogramowania typu mirror.

Ta trójwymiarowa wizualizacja obrazów konfokalnych, przygotowana przy użyciu programu Amira, przedstawia biofilm mutantów S utworzony na powierzchni apatytowej zgodnie z opisananą procedurą. Komórki bakteryjne i mikrokolonie są widoczne w kolorze zielonym i są zanurzone w macierzy biofilmu zawierającej egzopolisacharydy. W kolorze czerwonym można wygenerować powiększony widok wybranego obszaru, który ilustruje specyficzne zależności strukturalne między bakteriami a EPS w skali mikro.

Użyj programu duos stat do ilościowego określenia stopnia kolokalizacji poszczególnych składników biofilmu, takich jak bakterie i egzopolisacharydy. Najpierw zdefiniuj ścieżkę do nowo opracowanego programu duo stat w programie MATLAB w wersji 5.1 i otwórz foldery z obrazami zawierającymi serie Z dwóch składników biofilmu. Następnie wybierz dwa kanały, które mają zostać skorelowane i przeanalizowane.

Dwa stosy obrazów muszą mieć identyczną wielkość pikseli we wszystkich wymiarach oraz taką samą liczbę obrazów w każdym stosie. Ustaw progi dla każdego kanału, postępuj zgodnie z instrukcjami w interfejsie oprogramowania i wprowadź dane do pliku przetwarzania danych w celu przeprowadzenia analizy. Rysunek ten pokazuje, w jaki sposób duo stack ilościowo interpretuje relację przestrzenną między bakteriami a DBS.

W obrębie biofilmu program Duo oblicza rozkład pionowy bakterii i DPS od powierzchni dysku do fazy ciekłej, co przedstawiono tutaj za pomocą zielonej linii dla bakterii i czerwonej linii dla EPS. Oblicza on również kolokalizację bakterii i DPS w całej grubości biofilmu. Jak pokazuje żółta linia, dane wskazują na wyższe proporcje EPS niż bakterii w całej głębokości biofilmu, a większość komórek bakteryjnych jest powiązana z EPS, szczególnie od warstw środkowych w górę. Duo stat z renderowaniem 3D zapewnia lepsze zrozumienie organizacji strukturalnej oraz oddziaływań między bakteriami a DPS w biofilmach.

Aby zapewnić uzyskanie wysokiej jakości RNA z biofilmu, zalecamy przeprowadzanie ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem specyficznym dla biofilmu opisanym w artykule autorstwa Curiana KU opublikowanym w 2007 roku. W czasopiśmie Analytical Biochemistry zastosowano standardowe protokoły do przygotowania mikromacierzy cDNA oraz ilościowych analiz Real-Time PCR. Aby ułatwić analizę dużych zbiorów danych generowanych przez eksperymenty z wykorzystaniem mikromacierzy, opracowaliśmy oprogramowanie do organizacji i eksploracji danych – Microarray Data Visualizer (MDV), które jest dostępne online pod adresem www.oralgen.anl.gov.

Przed przesłaniem danych do MDV należy przeprowadzić analizę statystyczną, np. test t-studenta dla prób zależnych z modelem losowej wariancji, korzystając z dostępnego online oprogramowania BRB array tool, przyjmując wartość graniczną P = 0,001 dla porównania klas. W niniejszym przykładzie przeprowadzono analizę biofilmów s mutton hodowanych w trzech różnych stężeniach cukru i w czterech punktach czasowych. Wykonano porównania parzyste, w wyniku których powstały trzy pliki BRB: warunek A 0,5% sucrose plus 1% starch versus 1% sucrose, warunek B 0,5% sucrose plus 1% starch versus 0,5% sucrose oraz warunek C 0,5% sucrose versus 1% sucrose.

Ten panel przedstawia liczbę genów zidentyfikowanych jako różnicowo wyrażone w każdym z badanych warunków i punktów czasowych, ocenionych za pomocą standardowego porównania klas z wykorzystaniem narzędzia BRB array, co skutkuje uzyskaniem dużej liczby genów określonych jako surowe dane BRB. W celu zademonstrowania MDV skupimy się na punkcie czasowym 30 godzin, korzystając z programu Excel. Przekonwertuj surowe dane BRB do plików tekstowych MDV rozdzielanych tabulatorami.

Należy usunąć wszystkie litery towarzyszące numerowi zakładki locus genu, na przykład w nazwie SMU dot 1432 C. Usuń literę C, otwórz MDV. Otwórz menu plików i wybierz opcję „select annotation source”. Gdy pojawi się okno dialogowe, wybierz opcję „flat file”.

Użyj przycisków przeglądania, aby wybrać pliki zawierające adnotacje dla danych klasyfikacji funkcjonalnej szlaków z numerami Gene Ontology oraz nazwy genów. Przejdź do menu Plik i zaimportuj każdy z plików przekonwertowanych do formatu MDV. Każdy plik reprezentuje pojedynczy warunek eksperymentalny.

Porównaj geny ekspresowane w każdym z warunków eksperymentalnych A, B oraz C. W tym przykładzie wykorzystamy funkcję diagramu Venna. W ramach tej demonstracji skupimy się na genach różnicowo ekspresowanych, które są ściśle związane z wpływem sacharozy i skrobi w kombinacji. Funkcja oparta na diagramie Venna służy do wizualizacji liczby unikalnych i wspólnych genów ekspresowanych w tych różnych warunkach i pomaga nam zidentyfikować te, które zostaną wybrane do dalszej analizy.

W tym miejscu wybieramy wyłącznie geny o różnej ekspresji, które występują unikalnie w warunku A i/lub B, z pominięciem tych wykrytych w warunku C, zaznaczonych tutaj na szaro. MDV znacznie zredukowało całkowitą liczbę analizowanych genów, jednocześnie odfiltrowując geny nieistotne dla badanego przypadku eksperymentalnego. Z menu plików wybierz opcję eksportu, aby zapisać dane.

Jako pliki ograniczone tabulatorami, mogą one zostać następnie otwarte w programie Excel, gdzie wyjściowe dane można uporządkować i przekształcić w pożądane reprezentacje graficzne. Organizacja danych w programie Excel umożliwia graficzne przedstawienie wyników MDV. Wykres ten przedstawia przegląd różnicowej ekspresji unikalnych funkcjonalnych podzbiorów genów, na które wpływa kombinacja skrobi i sacharozy na różnych etapach rozwoju biofilmu.

Wpływy na transkryptom mutantów S są bardziej wyraźne w 30. godzinie rozwoju biofilmu niż w innych punktach czasowych. Wynik ten pomógł nam precyzyjnie zidentyfikować specyficzne funkcjonalne podzbiory genów istotne dla naszej hipotezy roboczej, biorąc pod uwagę efekty czasowe, które ułatwiły proces selekcji genów i ich późniejszą walidację. Po zastosowaniu tej procedury można również przeprowadzić analizy biochemiczne i proteomiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzne odpowiedzi fizjologiczne i metaboliczne organizmów w obrębie biofilmów.

Tak kompleksowa i zintegrowana analiza z pewnością pomogłaby w lepszym zrozumieniu, w jaki sposób biofilmy modulują patogenność w jamie ustnej, która jest środowiskiem niezwykle dynamicznym i złożonym. Więcej szczegółów znajduje się w pliku PDF dołączonym do niniejszego artykułu wideo.