Name: Izolacja komórek nabłonka oddechowego myszy i narażenie na eksperymentalny dym papierosowy na granicy faz powietrza i cieczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj izolację komórek nabłonka oddechowego myszy i narażenie na dym papierosowy przy granicy faz powietrze-ciecz. Ta metoda umożliwia badanie toksyczności dymu tytoniowego na zdrowie płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Emeka Ifedigbo za pomoc techniczną oraz dr. Shivraj Tyagi za cenną wiedzę ekspercką. Dziękujemy również Harvard NeuroDiscovery Center za pomoc w zakresie mikroskopii. Praca ta była częściowo finansowana z grantu przeddoktorskiego American Heart Association 09PRE2250120 przyznanego Hilaire Lam oraz grantów NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, przyznanych A. M. K. Choi.

Cały protokół wymaga 2 dni na izolację komórek z tkanki zwierzęcej, 5-10 dni na proliferację komórek oraz dodatkowych 10-14 dni na różnicowanie komórek na granicy faz powietrze-ciecz. Dodatkowy dzień jest wymagany na ekspozycję komórek i pobranie próbek.
1. Izolacja komórek nabłonka tchawcopłucnego myszy (MTEC).
Uwaga: Wszystkie opisane poniżej procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Brigham and Women's Hospital/ Harvard Medical School Area.
Przed rozpoczęciem:
<ul>
	<li>Przygotować pożywkę Ham's F12 z antybiotykami. Do 250 mL podstawowej pożywki Ham's F12 (Cellgro) dodać 2,50 mL 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny (102 U/mL-102 mg/mL) oraz 250 μL 1000-krotnego roztworu Fungizone. Przechowywać w temperaturze 4°C do 4 tygodni.</li>
	<li>Przygotować 0,15% roztwór pronazy. Dodać 15 mg pronazy do 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Przygotować czystą powierzchnię roboczą oraz sterylne instrumenty chirurgiczne odpowiednie do operacji na małych zwierzętach, a także laminarny dygestorium do hodowli tkanek do izolacji komórek. Pozostały sprzęt jest standardowy dla hodowli komórek zwierzęcych, w tym inkubatory CO2 z nawilżaniem, chłodnia, laboratoryjne wirówki do komórek, mikroskop odwrócony oraz jednorazowe plastikowe pipety i naczynia hodowlane.</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenu I (50 μg/mL w 0,02 N kwasie octowym). Odpipetować 1,0 mL roztworu kolagenu do każdego dołka 12-dołkowej płytki transwell (Corning). Owinąć parafilmem i pozostawić na noc na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Przy użyciu komercyjnie dostępnej linii myszy (np. C57Bl/6, samce w wieku 6-8 tygodni), uśmierć zwierzęta za pomocą zatwierdzonej metody eutanazji, takiej jak narkoza indukowana CO2. Zazwyczaj 6 myszy dostarczy wystarczającą liczbę komórek (1,5-2,0 x 105 komórek/mysz), aby zasiać 12-dołkową płytkę transwell.</li>
	<li>Spryskaj truchła zwierząt 70% roztworem EtOH w celu sterylizacji pola operacyjnego.</li>
	<li>Za pomocą czystych nożyczek chirurgicznych i skalpela usuń skórę z okolic tchawicy i odsłoń tchawicę. Otwórz jamę brzuszną, przetnij wzdłuż mostka i usuń klatkę piersiową. Usuwaj tkanki, aż zostanie odsłonięty koniec tchawicy.</li>
	<li>Umieść tchawice w 50 mL probówce stożkowej zawierającej 30 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami, w lodzie.</li>
	<li>W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieś tkankę tchawicy do sterylnej szalki Petriego 100 mm zawierającej 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel tkankę łączną za pomocą sterylnej pincety i nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Przenieś tkankę tchawicy do nowej szalki Petriego 100 mm zawierającej 10 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami w celu wypłukania. Przetnij tchawice wzdłuż osi pionowej, aby odsłonić światło.</li>
	<li>Przenieś tchawice do probówki 50 mL zawierającej 10 mL 0,15% roztworu Pronazy i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Drugiego dnia przygotuj następujące odczynniki:
		<ul>
			<li>Przygotuj roztwór DNAzy I. Do 18 mL pożywki Ham's F12 z antybiotykami dodaj 2 mL roztworu stokowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 10 mg/mL oraz 10 mg surowej pancreaticznej DNAzy I. Rozlej na aliquoty po 1 mL i przechowuj w temperaturze -20°C (rozmrażać na lodzie przed użyciem).</li>
			<li>Przygotuj pożywkę Ham's F12 z antybiotykami i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Do 200 mL podstawowej pożywki Ham's F12 (Invitrogen) dodaj 50 mL inaktywowanej termicznie FBS, 2,5 mL 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny (102 U/mL-102 mg/mL) oraz 250 μL 1000-krotnego roztworu Fungizone.</li>
			<li>Przygotuj podstawową pożywkę MTEC z antybiotykami. Do 475,5 mL podstawowej pożywki DMEM/F12 (Cellgro) dodaj 7,5 mL 1 M roztworu HEPES, 10 mL 200 mM roztworu glutaminy, 2 mL 7,5% roztworu NaHCO3, 5 mL 100-krotnego roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 500 μL 1000-krotnego roztworu Fungizone.</li>
			<li>Przygotuj pożywkę MTEC z 10% FBS. Do 45 mL podstawowej pożywki MTEC z antybiotykami dodaj 5 mL inaktywowanej termicznie FBS.</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Ostrożnie przemieszaj probówkę (z kroku 1.8) ruchem kołyszącym 10-12 razy, a następnie pozostaw na 30-60 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Dodaj do probówki 10 mL pożywki Ham's F12 zawierającej 20% FBS i antybiotyki, a następnie przemieszaj 12 razy ruchem kołyszącym.</li>
	<li>Przygotuj 3 probówki stożkowe 15 mL zawierające 10 mL pożywki Ham's F12 z 20% FBS i antybiotykami.</li>
	<li>Wyjmij tchawice z roztworu Pronazy, odstawiając ten roztwór na lód. Przenieś tchawice do pierwszej probówki stożkowej z pożywką Ham's F12 i odwróć probówkę 12 razy. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Połącz roztwór Pronazy z trzema nadosadami z kroku 1.13 w jednej probówce 50 mL. Pozostałe tkanki odrzuć.</li>
	<li>Wiruj przy 1400 rpm (390 x g; wirówka Eppendorf 5810R wyposażona w rotor A-4-62) przez 10 min w temperaturze 4°C, a następnie odlej nadosad.</li>
	<li>Ostrożnie resuspenduj osad w 1 mL roztworu DNAzy (100-200 μL/tchawica) i inkubuj przez 5 min na lodzie.</li>
	<li>Wiruj przy 1400 rpm (390 x g) przez 5 min w temperaturze 4°C i odlej nadosad.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy w 8 mL pożywki MTEC zawierającej 10% FBS.</li>
	<li>Wysiej zawiesinę komórkową na płytki Primaria (Falcon). Inkubuj w temperaturze 37°C w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 przez 5 h (uwaga: jest to etap negatywnej selekcji fibroblastów).</li>
	<li>Zbierz zawiesinę komórkową z płytek i wypłucz płytki dwukrotnie 4 mL pożywki MTEC z 10% FBS. Połącz zawiesinę komórkową i wypłuczki w jednej probówce stożkowej 50 mL.</li>
	<li>Odlej 1 mL do cytospinowania i liczenia komórek. Wiruj w wirówce stołowej przez 5 min przy 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Usuń 500 μL i resuspenduj osad w pozostałym nadosadzie. Użyj 100 μL do liczenia komórek metodą barwienia żywotności błękitem trypanu. Odstaw 4 aliquoty po 100 μL do analizy cytospinowej.</li>
	<li>Wiruj pozostałe 15 mL zawiesiny komórkowej przy 1400 rpm (390 x g) w temperaturze 4°C przez 10 min.</li>
</ol>
2. Namnażanie i różnicowanie MTEC na granicy faz powietrze-ciecz
Przygotować roztwory zapasowe kwasu retinowego. Roztwór zapasowy A: Odważyć kwas retinowy w ciemności (Mr 300.44 g/mol), aby przygotować 5 mM roztwór zapasowy w 95% EtOH. Przechowywać w probówce owiniętej folią aluminiową w temperaturze -80°C. W razie potrzeby przygotować roztwór zapasowy B (5 μM), dodając 50 μL roztworu zapasowego A, 500 μL roztworu BSA (100 mg/ mL) oraz 49.5 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS). Przechowywać w probówce owiniętej folią aluminiową w temperaturze -80°C do 4 tygodni.
Przygotować pożywkę do proliferacji MTEC zawierającą kwas retinowy. Do 45,7 mL podstawowej pożywki MTEC z antybiotykami dodać 2,5 mL inaktywowanego ciepłem FBS, 1 mL roztworu zapasowego B kwasu retinowego, 250 μL roztworu insuliny (2 mg/mL insuliny w 4 mM HCl), 250 μL roztworu epidermalnego czynnika wzrostu (5 μg/mL EGF w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA), 200 μL ekstraktu z przysadki bydlęcej (15 mg/mL w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA), 50 μL roztworu transferryny (5 mg/mL transferryny w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA) oraz 50 μL roztworu toksyny cholerycznej (100 mg/mL w HBS zawierającym 1 mg/mL BSA). Gotową pożywkę wysterylizować poprzez filtrowanie i zużyć w ciągu 2 dni od przygotowania.
<ol>
	<li>Usunąć roztwór kolagenu z płytek transwell, pozostawić pod wyciągiem na 5 min, a następnie przemyć PBS 2 razy.</li>
	<li>Po wirowaniu zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki proliferacyjnej (500 μL), aby umożliwić wysianie 7,5 x 104-1,0 x105 komórek na dołek. Nanieść pipetą 500 μL zawiesiny komórkowej na powierzchnię apikalną wkładki z membrany poliwęglanowej transwell. Do komory bazalnej transwellu dodać 1,5 mL pożywki proliferacyjnej.</li>
	<li>Inkubować zanurzone kultury MTEC w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 95% powietrza i 5% CO2 przez 7-10 dni.</li>
	<li>Odczekać trzy dni przed pierwszą wymianą pożywki. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Monitorować kultury poprzez inspekcję wizualną oraz pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej za pomocą elektrody (EVOM Ohmvoltometer, World Precision Instruments, Sarasota, FL).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną konfluencję, a oporność nabłonka wyniesie 1000 Ω/cm2, komórki są gotowe do dyferencjacji w warunkach ALI.</li>
	<li>Przygotować pożywkę bazalną MTEC zawierającą 2% NuSerum. Dodać NuSerum do podstawowej pożywki MTEC do stężenia końcowego 2% V/V. Przed użyciem dodać kwas retinowy (Stock B) do stężenia końcowego 1 X 10-7 M. Przygotować świeżą pożywkę i zużyć w ciągu 2 dni.</li>
	<li>Pozostawić komórki do dyferencjacji na 10-14 dni, usuwając pożywkę apikalną i zastępując pożywkę bazalną 750 μL pożywki bazalnej MTEC zawierającej 2% NuSerum i kwas retinowy. Wymieniać pożywkę bazalną i przemywać stronę apikalną pożywką MTEC z 2% NuSerum co drugi dzień.</li>
</ol>
3. Aplikacja dymu papierosowego do hodowlanych komórek nabłonkowych
<ol>
	<li>Naraż stronę apikalną kultur w transwellach na główny strumień dymu papierosowego, korzystając z systemu ekspozycji komórek na dym papierosowy (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Zdjęcie aparatury znajduje się na Rysunku 1. Specyfikacje techniczne podano w Tabeli odczynników i sprzętu. W skrócie, aparatura składa się z pompy perystaltycznej, która pali każdego papierosa w ~7-8 zaciągnięciach, wciągając główny strumień dymu do linii z polipropylenu połączonej z wentylowaną komorą ekspozycyjną. W komorze ekspozycyjnej utrzymywana jest temperatura 37°C dzięki cyrkulacji wody oraz atmosfera 5% CO2 za pomocą linii gazowej. Komórki mogą być narażone na dym z badawczych papierosów referencyjnych Kentucky 3R4F z filtrem (The Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Zazwyczaj komórki są narażone na dym z 1-2 papierosów, co daje 100-200 mg/m3 całkowitej masy cząstek stałych (TPM). Kultury kontrolne są narażone na powietrze pokojowe przez analogiczny czas ekspozycji.</li>
	<li>Wartość TPM jest mierzona zgodnie z protokołem producenta dostarczonym z maszyną do palenia TE-10c (Teague Enterprises). W skrócie, filtr (Pallflex) jest umieszczany w stalowym uchwycie szeregowym na rurce próbnej prowadzącej z portu próbkowania w komorze palenia do pompy o stałym przepływie (jednostka próbkowania). Rurka wylotowa łączy jednostkę próbkowania z miernikiem gazu (Dry Gas Meter, ONM61,67, AEM). Filtr jest ważony przed i po pobraniu próbek gazu. Całkowita masa materiału osadzonego na filtrze w mg jest normalizowana do całkowitej objętości pobranego powietrza.</li>
	<li>Komórki można następnie zebrać w dowolnym punkcie czasowym (np. 0-24 h) po ekspozycji w celu przeprowadzenia standardowych procedur analitycznych (np. analiza Western blot, analiza mRNA itp.) lub mikroskopii (np. mikroskopia konfokalna lub elektronowa). Pożywki hodowlane mogą być również analizowane pod kątem uwalniania cytokin lub LDH w testach cytotoksyczności.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Pomyślna izolacja, proliferacja i różnicowanie nabłonka w warunkach ALI powinny doprowadzić do powstania nienaruszonej warstwy jednowarstwowej o morfologii brukowanej. Opór transepitelialny zdrowych kultur powinien wynosić około 1000-2000 Ω/cm2. Rysunek 2 przedstawia warstwę jednowarstwową mysich komórek nabłonka dróg oddechowych zabarwioną pod kątem markerów komórek nabłonkowych i rzęsek w warunkach kontrolnych oraz po ekspozycji na dym papierosowy. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne mikrografie elektronowe zdrowych kultur MTEC, obrazujące ultrastrukturę i morfologię rzęsek.
<img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Układ bioreaktora do hodowli komórkowej dla wzrostu tkanek; schemat etapów proliferacji i różnicowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przygotowanie komórek nabłonkowych przebiega w trzech fazach: etapie izolacji, etapie propagacji oraz etapie różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz (schemat). Komórki nabłonkowe są izolowane z tchawicy myszy, wysiewane na transwelle, gdzie proliferują w hodowli zanurzonej, a następnie przekształcane w hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz, w której ulegają pełnemu różnicowaniu. Eksperymenty są zazwyczaj przeprowadzane w 24tym dniu ciągłej hodowli. Zdjęcie przedstawia modelowy układ do ekspozycji hodowlanych komórek na główny strumień dymu papierosowego. System hodowli ALI w transwellach jest umieszczony wewnątrz specjalnie zaprojektowanego modułowego systemu dostarczania dymu papierosowego, w którym kontrolowana jest temperatura, wilgotność oraz poziom CO2.
<img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej i testu LDH; obrazy komórek (CTL, CS) i dane dotyczące cytotoksyczności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Hodowle komórek nabłonkowych utrwalono i zabarwiono na jądra (Hoechst 33258), F-aktynę (kolor zielony; faloidyna sprzężona z Alexa-Fluor 488) oraz marker rzęsek – acetylowaną α-tubulinę (kolor czerwony; przeciwciało wtórne sprzężone z Cy3). Dolne panele przedstawiają analogiczne obrazy komórek nabłonkowych wykonane 4 godziny po ekspozycji na dym papierosowy (2 papierosy, 150 mg/m3). (B) Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) mierzono w medium podstawowym 24 godziny po ekspozycji na wskazane różne dawki dymu papierosowego.
<img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Porównanie komórek rzęskowych, podstawnych i nierzęskowych na mikrografach elektronowych, analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Hodowle komórek nabłonkowych wyizolowanych z nabłonka tchawicy myszy na granicy powietrze-ciecz różnicują się w kilka podtypów, które w badaniu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wykazują cechy komórek rzęskowych, podstawnych i nierzęskowych 1. Komórki te są typowe dla rzekomo wielowarstwowego nabłonka oddechowego. Oznaczenia na rycinie odpowiadają: bb: ciałko podstawne, a: aksonema, m: mitochondria, n: jądro komórkowe, s: podłoże (membrana poliwęglanowa), mv: mikrokosmki

<ol><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).</li>
<li>Davidson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+epithelial+cells%3A+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cyst.+Fibros%22%5BJournal%5D)">Murine epithelial cells: isolation and culture.</a> J. Cyst. Fibros. 2, Suppl 3. 59-62 (2004).</li>
<li>Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+model+of+differentiated+murine+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).</li>
<li>Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.%3B+Global+Initiative+for+Chronic+Obstructive+Lung+Disease.+Global+strategy+for+the+diagnosis%2C+management%2C+and+prevention+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%3A+GOLD+executive+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary.</a> Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
<li>Macnee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease.</a> Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).</li>
<li>Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art.+Cellular+and+molecular+mechanisms+of+alveolar+destruction+in+emphysema%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).</li>
<li>Yao, H., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+on+the+role+of+inflammation+in+COPD+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).</li>
<li>van der Toorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+irreversibly+modifies+glutathione+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).</li>
<li>Slebos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+localization+and+function+of+heme+oxygenase-1+in+cigarette+smoke-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).</li>
<li>Kim, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+proteins+regulate+cigarette+smoke+induced+apoptosis%3A+protective+role+of+heme+oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1.</a> Autophagy. 4, 887-895 (2008).</li>
<li>Chen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).</li>
<li>Okuwa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+for+cigarette+smoke+using+a+whole+smoke+exposure+system%3A+A+comparison+of+smoking+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens.</a> Exp Toxicol Pathol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+in+vitro+models+of+cigarette+smoke+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure.</a> Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).</li>
<li>Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+alters+tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+1+and+matrix+metalloproteinase+9+levels+in+the+basolateral+secretions+of+human+asthmatic+bronchial+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro.</a> J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).</li>
<li>Rennard, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke in research.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).</li>
<li>Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoke+gets+in+your+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Smoke gets in your cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Protokół opisujący izolację komórek nabłonka tchawicy myszy został zaadaptowany z protokołów You et al., 1, oraz innych 2-3 z wprowadzonymi modyfikacjami. Jak w przypadku każdego protokołu opisującego izolację komórek, najistotniejszym aspektem jest unikanie kontaminacji patogenami bakteryjnymi lub grzybiczymi poprzez stosowanie rygorystycznych technik aseptycznych. Drugim krytycznym krokiem jest unikanie kontaminacji kultur fibroblastami, czego można uniknąć dzięki starannemu wycięciu tcha...

<table><tbody><tr><td>Ham&amp;rsquo;pożywka F12 1X</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-080-CM</td><td>z L-glutaminą</td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Grupa Roche</td><td>10165921001</td><td>&lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Z ogona szczura</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826-25</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>Z trzustki bydlęcej</td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td>Frakcja V</td></tr><tr><td>kwas retinowy</td><td>Kwas retinowy</td><td>R265-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Zrównoważony roztwór soli (BSS)</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>14175</td><td>Bez Ca++ lub Mg++</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Cellgro</td><td>MT-15-090-CM</td><td>Bez L-glutaminy lub HEPES-u</td></tr><tr><td>HEPES, 1M w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100ML</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B (Fungizone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1672346</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16634-50MG</td><td>Trzustka bydlęca</td></tr><tr><td>Apo-transferyna (ludzka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna choleryczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>&lt;em&gt;Vibrio cholerae&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Epidermalny czynnik wzrostu</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki wołowej</td><td>BD Biosciences</td><td>354123</td><td></td></tr><tr><td>NuSerum</td><td>BD Biosciences</td><td>355100</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>12 mm, pory 0,4 mm&lt;Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), co stanowi model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji tych komórek oraz poddawania ich działaniu głównego nurtu dymu papierosowego (CS) w celu zbadania odpowiedzi komórek nabłonka na ekspozycję na CS. Protokół składa się z trzech części: izolacji komórek nabłonka dróg oddechowych z tchawicy myszy, hodowli tych komórek na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako w pełni zróżnicowanych komórek nabłonka oraz dostarczania skalibrowanego głównego nurtu dymu papierosowego do tych komórek w hodowli. System hodowli ALI umożliwia hodowlę nabłonków oddechowych w warunkach bardziej zbliżonych do ich fizjologicznego środowiska niż zwykłe systemy hodowli w cieczy. Badanie molekularnych i komórkowych odpowiedzi płuc na ekspozycję na CS jest kluczowym elementem zrozumienia wpływu zanieczyszczenia powietrza na zdrowie ludzi. Wyniki badań w tym obszarze mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia etiologii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) oraz innych chorób związanych z paleniem tytoniu, które stanowią poważne globalne problemy zdrowotne.&gt;Poliwęglan</td></tr><tr><td>Szalka hodowlana Primaria 100 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>membrana Pallflex</td><td>Pall Corporation</td><td>EMFAB TX40H120-WW</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do palenia</td><td>Usługi EMI</td><td>ATCSALI-1</td><td>patrz Przypis*</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Komórki nabłonka płuc można izolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), tworząc model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji tych komórek i poddawania ich działaniu głównego nurtu dymu papierosowego (CS) w celu zbadania odpowiedzi komórek nabłonka na ekspozycję na CS. Protokół składa się z trzech części: izolacji komórek nabłonka dróg oddechowych z tchawicy myszy, hodowli tych komórek na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako w pełni zróżnicowanych komórek nabłonkowych oraz dostarczania skalibrowanego głównego nurtu CS do tych komórek w hodowli. System hodowli ALI umożliwia hodowlę nabłonków oddechowych w warunkach, które bardziej przypominają ich fizjologiczne środowisko niż zwykłe systemy hodowli w cieczy. Badanie molekularnych i komórkowych reakcji płuc na ekspozycję na CS jest kluczowym elementem zrozumienia wpływu zanieczyszczenia powietrza na zdrowie ludzi. Wyniki badań w tym obszarze mogą w dalszej kolejności przyczynić się do zrozumienia etiologii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) oraz innych chorób związanych z paleniem tytoniu, które stanowią poważne globalne problemy zdrowotne.&quot;&gt;Maszyna do palenia papierosów jest urządzeniem zaprojektowanym i wykonanym na zamówienie, 14&quot;x14&quot;x20&quot; Dwukomorowy, z płaszczem wodnym, lekko przyciemniany, przezroczysty, odporny na zaparowanie, 1/2&quot; gruba komora z poliwęglanu Lexan do ekspozycji na dym tytoniowy, z systemem odcięcia sterowanym czujnikiem poziomu wody i regulacją temperatury. W celu uzyskania zmiennej częstotliwości zaciągnięć zainstalowano jednostkę do palenia/zaciągania papierosami. Podczas pracy jednostka ta naśladuje inkubator w zakresie kontroli temperatury, wilgotności oraz stężenia dwutlenku węgla w systemie. System obejmuje: (I) dostosowaną jednostkę z podwójną komorą i płaszczem wodnym, która utrzymuje kontrolowane warunki dla eksperymentów z kulturami tkankowymi; (II) cyfrowy, wytrzymały i wysokoprecyzyjny system cyrkulacji temperatury wody z podwójną pompą, czujnikiem poziomu wody i regulacją temperatury; (III) jednostkę do palenia papierosów z pompą do zaciągnięć; (IV) sterownik cyklu pompy z regulacją częstotliwości; (IV) wysokoprecyzyjny uchwyt filtra liniowego wykonany ze stali nierdzewnej; (V) demontowalną pokrywę z zamontowanym przyłączem 11/2&quot; rozmiar osiowej jednorodności wentylatora mieszającego dym papierosowy. (VI) Kąpiel wodna średniej wielkości z uchwytem montażowym dla cyrkulatora wody. (VII) 1/2&amp;rsquo; gruba taca z pleksiglasu z uchwytami na pompę do zaciągów i uchwytem na kolektor popiołu z papierosów.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Komórki nabłonka płuc można izolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji tych komórek i poddawania ich działaniu głównego nurtu dymu papierosowego (CS) w celu zbadania odpowiedzi komórek nabłonka na ekspozycję na CS. Protokół składa się z trzech części: izolacji komórek nabłonka dróg oddechowych z tchawicy myszy, hodowli tych komórek na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako w pełni zróżnicowanych komórek nabłonka oraz dostarczania skalibrowanego głównego nurtu CS do tych komórek w hodowli. System hodowli ALI pozwala na hodowlę nabłonków oddechowych w warunkach bardziej zbliżonych do ich fizjologicznego środowiska niż zwykłe systemy hodowli w cieczy. Badanie molekularnych i komórkowych odpowiedzi płuc na ekspozycję na CS jest kluczowym elementem zrozumienia wpływu zanieczyszczenia powietrza na zdrowie ludzi. Wyniki badań w tym obszarze mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia etiologii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) oraz innych chorób związanych z paleniem tytoniu, które stanowią istotne globalne problemy zdrowotne.&quot;&gt;Opisaną maszynę można zastąpić podobnymi, dostępnymi w handlu maszynami do palenia, takimi jak urządzenia oferowane przez TSE systems (&lt;a href=&quot;http://www.tse-systems.com&quot;&gt;www.tse-systems.com&lt;/a&gt;).&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface  

Komórki nabłonka płuc można izolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji tych komórek i poddawania ich działaniu głównego nurtu dymu papierosowego (CS) w celu zbadania odpowiedzi komórek nabłonka na ekspozycję na CS. Protokół składa się z trzech części: izolacji komórek nabłonka dróg oddechowych z tchawicy myszy, hodowli tych komórek na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) jako w pełni zróżnicowanych komórek nabłonkowych oraz dostarczania skalibrowanego głównego nurtu CS do hodowanych komórek. System hodowli ALI umożliwia hodowlę nabłonków oddechowych w warunkach, które bardziej przypominają ich środowisko fizjologiczne niż zwykłe systemy hodowli w cieczy. Badanie odpowiedzi molekularnych i komórkowych płuc na ekspozycję na CS jest kluczowym elementem zrozumienia wpływu zanieczyszczenia powietrza na zdrowie ludzi. Wyniki badań w tym obszarze mogą ostatecznie przyczynić się do zrozumienia etiologii przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (COPD) oraz innych chorób związanych z paleniem tytoniu, które stanowią poważne globalne problemy zdrowotne.

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Komórki nabłonka płuc można izolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), tworząc model zróżnicowanego...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych w celu zbadania toksycznych skutków narażenia na dym tytoniowy. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie tchawic myszy, a następnie strawienie tchawic w roztworze pronazy. Drugim krokiem procedury jest zebranie komórek nabłonkowych i namnożenie hodowli.Trzecim krokiem jest różnicowanie kultur na granicy fazy powietrze-ciecz. Ostatnim etapem procedury jest poddanie komórek nabłonkowych działaniu dymu papierosowego w części apikalnej na granicy fazy powietrze-ciecz. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące w pełni zróżnicowaną monowarstwę komórek nabłonkowych w badaniu mikroskopii immunofluorescencyjnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, takie jak wpływ ekspozycji na dym tytoniowy na morfologię CLIA oraz biochemiczne markery uszkodzenia komórek indukowane dymem tytoniowym. Przygotowania do tej procedury należy rozpocząć na jeden dzień przed sekcją, przygotowując pożywkę Ham's F 12 z antybiotykami oraz pożywkę Ham's F 12 z antybiotykami i 20% F-B-S-M-T-E-C, która stanowi podstawowe medium z antybiotykami.Pożywka MTEC z 5% FBS, roztwor

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolacja komórek nabłonka oddechowego myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym papierosowy na powietrzu w interfejsie powietrze-ciecz

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Celem tego protokołu jest wystawienie ludzkich organotypowych 3D modeli tkanek oskrzelowych i nosowych na główny nurt dymu papierosowego (CS) na granicy powietrze-ciecz. Wpływ CS na tkanki jest następnie badany za pomocą testu aktywności cytochromu P450, pomiaru bicia rzęsek i podejścia opartego na biologii systemowej.

Ocena skutków powtarzającego się narażenia organotypowych modeli 3D hodowli tkanek oskrzelowych i nosowych na cały dym papierosowy

Opisany tutaj jest protokół do badania, jak ekstrakt z dymu papierosowego wpływa na kolonizację bakteryjną w komórkach nabłonka płuc.

Badanie wpływu dymu papierosowego na zakażenie Pseudomonas w komórkach nabłonka płuc

Ten protokół demonstruje badanie patofizjologicznych skutków dymu papierosowego (CS) za pomocą systemu ekspozycji na inhalację całego ciała (WBI) (WBIS) zbudowanego we własnym zakresie. System ten może wystawiać zwierzęta na działanie CS w kontrolowanych, powtarzalnych warunkach w celu zbadania wpływu CS na rozedmę płuc i hematopoezę.

Narażenie na dym papierosowy u myszy korzystających z systemu inhalacji całego ciała

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Protokół ten przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej, która izoluje żywotne komórki nabłonkowe typu II (AECII) z płuc noworodków, młodocień lub dorosłych myszy (zakażonych lub niezakażonych). Takie podejście umożliwia późniejszym badaniam molekularnym i/lub funkcjonalnym AECII identyfikację ich roli podczas zapalenia i infekcji płuc.

Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych

Poznaj izolację komórek nabłonka oddechowego myszy i narażenie na dym papierosowy przy granicy faz powietrze-ciecz. Ta metoda umożliwia badanie toksyczności dymu tytoniowego na zdrowie płuc.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Przeglądaj więcej filmów