Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych w celu zbadania toksycznych skutków narażenia na dym tytoniowy. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie tchawic myszy, a następnie strawienie tchawic w roztworze pronazy. Drugim krokiem procedury jest zebranie komórek nabłonkowych i namnożenie hodowli.

Trzecim krokiem jest różnicowanie kultur na granicy fazy powietrze-ciecz. Ostatnim etapem procedury jest poddanie komórek nabłonkowych działaniu dymu papierosowego w części apikalnej na granicy fazy powietrze-ciecz. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące w pełni zróżnicowaną monowarstwę komórek nabłonkowych w badaniu mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłej obturacyjnej choroby płuc, takie jak wpływ ekspozycji na dym tytoniowy na morfologię CLIA oraz biochemiczne markery uszkodzenia komórek indukowane dymem tytoniowym. Przygotowania do tej procedury należy rozpocząć na jeden dzień przed sekcją, przygotowując pożywkę Ham's F 12 z antybiotykami oraz pożywkę Ham's F 12 z antybiotykami i 20% F-B-S-M-T-E-C, która stanowi podstawowe medium z antybiotykami.

Pożywka MTEC z 5% FBS, roztwory stokowe kwasu retinowego DNA's one solution oraz pożywka do proliferacji MTEC zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. W dniu sekcji wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne, które będą wykorzystane podczas zabiegu. Upewnić się, że obszar sekcji jest czysty, a wszystkie narzędzia do sekcji znajdują się pod ręką.

Zdezynfekuj komorę laminarną. Następnie, pracując w komorze laminarnej, przygotuj 0,15% roztwór pronazy.

Dodaj 15 mg pronazy do 10 ml pożywki hams. F 12 z antybiotykami w 50 ml probówce stożkowej. Przechowuj w lodzie do czasu użycia.

Tchawice mysie są wypreparowywane z myszy. Stosując standardowe procedury chirurgiczne, należy zdezynfekować probówkę zawierającą tchawice i umieścić ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przenieść tkankę tchawicy do 100 milimetrowej szalki Petriego z medium Hams F 12 zawierającym antybiotyki. Za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej usunąć tkankę łączną z tchawic.

Następnie przenieś oczyszczone tchawice do drugiej 100 milimetrowej szalki Petriego zawierającej medium hams. F 12 z antybiotykami. Użyj nożyczek sekcyjnych, aby przeciąć tchawice wzdłuż osi pionowej i odsłonić światło.

Przenieś tchawice do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów roztworu Pronazy i umieść w lodówce w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj płytki transwell traktowane kolagenem one do użytku. Następnego dnia dodaj 50 miligramów kolagenu one na mililitr 0,02 N kwasu octowego; pipetuj jeden mililitr tego roztworu do każdego dołka płytki 12.

Dokładnie wypłucz płytkę wielodołkową. Owiń płytkę folią parafilmową i pozostaw ją na noc w temperaturze pokojowej w komorze do hodowli tkanek. Następnego dnia.

Delikatnie odwróć probówkę zawierającą tchawice mysie 10 do 12 razy. Następnie pozostaw zawartość probówki do inkubacji przez dodatkowe 30 do 60 minut w temperaturze four degrees Celsius. Pracując w komorze do hodowli tkanek, pipetuj 10 milliliters medium hams F 12 z antybiotykami i 20%FBS do probówki stożkowej zawierającej strawioną tkankę tchawicy i odwróć ją 12 razy.

Następnie do każdej z trzech probówek stożkowych o pojemności 15 ml pipetuj 10 ml pożywki Ham's F 12 z antybiotykami w 20% FBS. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby przenieść tkankę tchawicy z roztworu pronazy do pierwszej z probówek zawierających uzupełnioną pożywkę Ham's F 12.

Umieścić roztwór pronazy na lodzie, zamknąć probówkę zawierającą tkankę tchawicy i delikatnie odwrócić 12 razy w celu wymieszania. Następnie, używając pipety Pasteura, przenieść tkankę tchawicy do drugiej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwrócić tę probówkę 12 razy. Powtórzyć procedurę przenoszenia i odwracania, korzystając z ostatniej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.

Na koniec za pomocą pipety Pasteura usunąć i odrzucić tkankę tchawicy. Następnie wyjąć roztwór pronazy z lodu i połączyć trzy objętości po 15 ml uzupełnionego medium Ham's F 12 z roztworem pronazy. Próbkę wirować w schłodzonej wirówce w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 1 400 obr./min; po wirowaniu odrzucić nadsącz, a następnie nanieść pipetą około 100–200 µL roztworu DNAse I na każdą grudkę (pellet) i wymieszać.

Resuspendendując delikatnie poprzez opukiwanie. Inkubować komórki w lodzie przez pięć minut. Odwirować probówkę z prędkością 1 400 obr./min przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić nadsącz.

Następnie nanieś pipetą 8 ml pożywki MTEC zawierającej 10% FBS na osad i resuspenduj zawiesinę na płytce. Zawiesinę komórkową na płytce inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez pięć do sześciu godzin. Jest to etap selekcji negatywnej w celu usunięcia fibroblastów.

Po inkubacji należy zebrać zawiesinę komórkową z płytki Petriego i przenieść ją pipetą do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie płytkę należy dwukrotnie wypłukać czterema mililitrami pożywki MTEC zawierającej 10% FBS. Obie porcje płuczki należy przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórkową.

Do probówki typu Eppendorf pipetujemy 1 mL zawiesiny komórkowej. Alikwot ten należy zachować do analizy w cyto-wirówce oraz do liczenia komórek. Probówkę stożkową o pojemności 50 mL zawierającą pozostałe 15 mL zawiesiny komórkowej wirujemy przy 1 400 obr./min w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Podczas wirowania należy usunąć i zutylizować roztwór kolagenu z wcześniej przygotowanej płytki transwell. Pozostawić płytkę do wyschnięcia pod dygestorium przez pięć minut, a następnie dwukrotnie przemyć PBS, wykonując ostateczne płukanie. Odessać cały PBS i po wirowaniu nalać pipetą 1,5 milliliters medium do proliferacji do dolnej komory insertu transwell.

Odrzuć nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki do proliferacji, aby umożliwić wysianie od 7,5 × 10⁴ do 1 × 10⁵ komórek w 500 µL zawiesiny na dołek. Pipetuj 500 µL zawiesiny komórkowej na powierzchnię apikalną wkładki z membrany poliwęglanowej Transwell. Inkubuj zanurzone kultury MTEC w temperaturze 37 °C w wilgotnej inkubatorze zawierającym 95% powietrza i 5% CO2 przez 7–10 dni, wymieniając pożywkę co drugi dzień.

Zmierz oporność transepitelialną za pomocą interwalometru. Gdy oporność nabłonka osiągnie 1000 ohms per centimeter squared, a hodowle będą wydawać się zlane. Przekształć je w hodowlę LI poprzez usunięcie pożywki z części apikalnej.

Należy również zastąpić pożywkę podstawową pożywką podstawową MTEC zawierającą 2% nowej surowicy oraz kwas retinowy. Hodowle inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide przez 10 do 14 dni, aby umożliwić różnicowanie, wymieniając pożywkę co drugi dzień. W pierwszej kolejności należy przygotować maszynę do palenia zgodnie z instrukcjami producenta.

Zważ nieużywany filtr pole flex. Następnie umieść filtr w przelotowym uchwycie ze stali nierdzewnej na rurce próbnej prowadzącej z portu pobierania próbek w komorze dymnej do pompy o stałym przepływie. Połącz jednostkę pobierania próbek z miernikiem gazu za pomocą rurki wylotowej, wykorzystując system ekspozycji komórki CS.

Wystawić stronę apikalną kultur transworld na działanie głównego strumienia dymu z trzech papierosów referencyjnych R four F. Eksponować komórki na dym z jednego do dwóch papierosów. Kultury kontrolne wystawić na działanie powietrza pokojowego przez równoważny okres ekspozycji po uzyskaniu przyrostu masy podczas pobierania próbek gazu.

W przypadku filtra typu pool flex, całkowita ilość materiału osadzonego na filtrze w miligramach jest normalizowana. Przy całkowitej objętości pobranego powietrza dym z jednego do dwóch papierosów zazwyczaj daje od 100 do 200 miligramów TPM na metr sześcienny. Po ekspozycji na dym papierosowy należy zebrać komórki oraz pożywkę podstawową do dalszych analiz.

Jest to przykład zdrowej monowarstwy mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, zabarwionej pod kątem jąder komórkowych oraz markerów nabłonkowych. Prawidłowa izolacja, proliferacja i różnicowanie nabłonka charakteryzują się obecnością nienaruszonej monowarstwy o morfologii brukowej. Hodowle są w zasadzie wolne od fibroblastów.

Te zdjęcia z mikroskopii elektronowej są reprezentatywne dla zdrowych hodowli MTEC i przedstawiają ultrastrukturę różnych typów komórek oraz morfologię CELIA. Ten film z obrazowaniem żywych komórek pokazuje zdrową morfologię C hodowli MTEC. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować komórki nabłonka tchawki myszy, różnicować je na granicy powietrze-ciecz oraz poddawać je działaniu głównego nurtu dymu papierosowego.