Name: Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 i neuronach czuciowych Aplysia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę obrazowania translokacji PKC w żywych komórkach Sf9 i neuronach czuciowych Aplysia za pomocą fluorescencyjnego znacznika i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek kinazy C w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant Canadian Institutes of Health Research (CIHR) przyznany Wayne'owi S. Sossinowi. Carole A. Farah otrzymała stypendium podoktorskie z Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) oraz stypendium Conrada Harringtona. Autorzy chcieliby podziękować Joannie Bougie, Margaret Hastings i Margaret Labban za pomoc przy nagraniu wideo oraz Madeline Richmond Pool za pomoc w przygotowaniu graficznego przeglądu.

1. Przygotowanie i utrzymanie monowarstwowych kultur komórek Sf9
<ol>
 <li>Hodowlę i utrzymanie komórek Sf9 prowadzi się w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Komórki Sf9 pochodzą z komórek jajnika Spodoptera frugiperda (komórki Sf21) i mogą być zakupione jako komórki mrożone w pożywce Grace'a od firmy Invitrogen.</li>
 <li>Do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm2 z ukośnym szyjką należy wlać 8 mL pożywki dla owadów Grace'a, uzupełnionej (1X), z dodatkiem 30% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
 <li>Zamrożoną probówkę z komórkami Sf9 należy szybko rozmrozić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, delikatnie poruszając probówką przód-tył (przez około 1-2 minuty).</li>
 <li>Komórki Sf9 należy przenieść do kolby hodowlanej 75 cm2 i delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie, aby równomiernie rozmieścić komórki.</li>
 <li>Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 27°C aż do momentu przyczepienia się komórek.</li>
 <li>Usunąć starą pożywkę i zastąpić ją 10 mL świeżej pożywki dla owadów Grace'a z 30% FBS.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 27°C aż do uzyskania konfluencji komórek.</li>
 <li>Aby utrzymać kultury monowarstwy, należy usunąć starą pożywkę z konfluencyjnej kolby z komórkami Sf9 i dodać 5 mL pożywki dla owadów Grace'a z 10% FBS.</li>
 <li>Kilka razy lekko opukać ściankę kolby, aby odczepić komórki Sf9.</li>
 <li>Za pomocą pipety 10 mL i pipetora należy raz delikatnie zassać i wypuścić pożywkę, rozpylając ją na ściankach kolby podczas wypuszczania. Następnie przenieść komórki do sterylnej probówki polistyrenowej o objętości 15 mL.</li>
 <li>Do nowej kolby hodowlanej 75 cm2 dodać 2 mL zawiesiny komórek Sf9 do 8 mL pożywki dla owadów Grace'a z 10% FBS (rozcieńczenie 1:5 w celu utrzymania wzrostu w fazie logarytmicznej) i delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 27°C aż do uzyskania konfluencji komórek.</li>
</ol>
2. Ekspresja PKC znakowanych fluorescencyjnie w komórkach Sf9
<ol>
 <li>W celu przeprowadzenia eksperymentu z obrazowaniem na żywo, hoduj komórki Sf9 na szalkach hodowlanych MatTek z dnem szklanym 35 mm, o powierzchni szklanej 14 mm i grubości szkiełka od 0,16 do 0,19 mm.</li>
 <li>PKC znakowane białkami fluorescencyjnymi są ekspresjonowane w komórkach Sf9 przy użyciu odczynnika do transfekcji Cellfectin II zgodnie z zaleceniami producenta z modyfikacjami szczegółowo opisanymi poniżej.</li>
 <li>Dzień 1: Przed wysianiem komórek potraktuj każdą szalkę MatTek pożywką dla owadów Grace'a z 10% FBS przez co najmniej 30 minut.</li>
 <li>Policz komórki Sf9 z kroku 11 (powyżej) za pomocą hemacytomieru.</li>
 <li>Wysiej 0,05 x 106 komórek na każde szkiełko szklane MatTek w całkowitej objętości 150 μL. Pozostaw komórki do przytwierdzenia na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Dodaj 2 mL pożywki Grace'a uzupełnionej o 10% FBS do każdej szalki, dodając po 1 mL powoli, aby uniknąć odklejenia komórek.</li>
 <li>Inkubuj w temperaturze 27°C przez noc.</li>
 <li>Od tego momentu stosuj zalecenia producenta dotyczące transfekcji komórek Sf9 plazmidowym DNA.</li>
 <li>Dzień 2: Przeprowadź transfekcję komórek Sf9 znakowanymi fluorescencyjnie PKC przy użyciu odczynnika do transfekcji Cellfectin II. W tym systemie często przeprowadzaliśmy koekspresję PKC znakowanych ulepszonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (eGFP) oraz monomerycznym czerwonym białkiem fluorescencyjnym (mRFP) (szczegóły konstrukcji plazmidów zostały opisane wcześniej 2,5). Ekspresja jednego białka fluorescencyjnego naraz daje około 70-80% komórek wykazujących ekspresję 72 godziny po transfekcji. Koekspresja dwóch białek fluorescencyjnych obniża wydajność transfekcji do około 30% komórek wykazujących koekspresję. Przy koekspresji PKC znakowanego eGFP i PKC znakowanego mRFP, użyj 2x więcej plazmidowego DNA dla białka znakowanego mRFP w celu uzyskania optymalnej ekspresji białka.</li>
 <li>Wykonaj obrazowanie na żywo 48-72 godziny po transfekcji (dla optymalnej ekspresji białka odczekaj 72 godziny).</li>
</ol>
3. Ekspresja PKC znakowanych fluorescencyjnie w neuronach sensorycznych Aplysia
<ol>
 <li>Przygotowanie kultur komórek neuronalnych Aplysia zostało opisane w artykule wideo opracowanym przez Zhao i współpracowników 4.</li>
 <li>PKC znakowane białkami fluorescencyjnymi są ekspresowane w neuronach sensorycznych Aplysia przy użyciu procedury mikroiniekcji opisanej poniżej.</li>
 <li>Przygotować roztwór zapasowy 1% Fast Green (FCF) w wodzie destylowanej, przefiltrować go za pomocą strzykawki i filtra strzykawkowego 28 mm (0,20 μm). Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C.&nbsp;</li>
 <li>Mikroiniekcję neuronów sensorycznych można przeprowadzić w 1. lub 2. dniu po izolacji neuronów, jednak stwierdzono, że odczekanie 2 dni pozwala na lepszą adhezję komórek do szkiełka podstawowego.</li>
 <li>W 2. dniu po izolacji neuronów sensorycznych rozmrozić alikwot Fast Green i ponownie przefiltrować go za pomocą strzykawki i filtra strzykawkowego 28 mm (0,20 μm).</li>
 <li>Przygotować roztwór plazmidowego DNA w wodzie destylowanej zawierający 0,5% Fast Green. Można stosować stężenia plazmidowego DNA do 0,4 μg/μL, lecz nie zaleca się przekraczania tych wartości.&nbsp;</li>
 <li>Przefiltrować roztwór plazmidowego DNA / Fast Green za pomocą strzykawki 1 mL i filtra strzykawkowego 4 mm (0,20 μm).</li>
 <li>Odwirować roztwór plazmidowego DNA / Fast Green w mikrocentry fudze przy 16110 x g przez 15 minut.</li>
 <li>Przygotować ostre elektrody do mikroiniekcji neuronów za pomocą wyciągacza mikroelektrod (Sutter Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97). Używając włókna prostokątnego, wyciągnąć szklane mikroelektrody o średnicy zewnętrznej 1 mm, średnicy wewnętrznej 0,75 mm i długości 100 mm, stosując cienkościenne kapilary szklane z włóknem wewnątrz (World Precision Instruments TW100F-4). Więcej informacji na temat wyciągania elektrod do mikroiniekcji znajduje się w podręczniku Sutter electrode cookbook.</li>
 <li>Napełnić każdą elektrodę 2 μL roztworu plazmidowego DNA / Fast Green za pomocą końcówki do mikroładowania (eppendorf CA32950-050).</li>
 <li>Przenieść naczynie hodowlane MatTek z szklanym dnem zawierające kultury neuronalne Aplysia na stanowisko do mikroinjekcji.</li>
 <li>Stanowisko do mikroinjekcji składa się z następujących elementów: własnoręcznie wykonanego dużego szklanego stołu do podtrzymywania naczyń hodowlanych na stole izolacyjnym od wibracji (Kinetic Systems vibration isolation workstation), stereomikroskopu z zewnętrznym oświetleniem halogenowym, mikromanipulatora (Sutter Huxley Wall Type Micromanipulator, umożliwiającego zarówno grube, jak i ultraprecyzyjne pozycjonowanie w trzech osiach) oraz uchwytu mikroelektrody podłączonego do pompy pneumatycznej (World Precision Instruments PV820 Pneumatic Pico-Pump). Wejście ciśnieniowe pompy pneumatycznej jest połączone z butlą ze sprężonym azotem.</li>
 <li>Włożyć mikroelektrodę do uchwytu mikroelektrod.</li>
 <li>Obserwując pod stereomikroskopem, wprowadzić końcówkę mikropipety do jądra komórkowego.</li>
 <li>Podawać krótkie impulsy ciśnienia azotu (czas trwania od 10 do 100 ms; 20 lb/in2) aż do momentu, gdy jądro stanie się jednorodnie zielone.</li>
 <li>Inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze pokojowej i przechowywać w 4°C do czasu użycia. Aby uzyskać optymalną translokację PKC, przeprowadzić eksperyment obrazowania na żywo 20–24 godziny po iniekcji.</li>
</ol>
4. Wizualizacja translokacji PKC w żywych komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia
<ol>
 <li>Do obrazowania wykorzystujemy odwrócony mikroskop konfokalny Zeiss LSM510 z Axiovert 200.</li>
 <li>Protokół obrazowania jest taki sam dla komórek Sf9, jak i dla neuronów sensorycznych Aplysia , z wyjątkiem następujących kwestii: komórki Sf9 obrazowane są za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego x63, natomiast neurony sensoryczne Aplysia za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego x40. Komórki Sf9 obrazowane są w komorze z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną na poziomie 26-27oC, podczas gdy neurony sensoryczne Aplysia obrazowane są w temperaturze pokojowej utrzymywanej w okolicach 18-20oC.</li>
 <li>Używamy lasera argonowego o mocy 30 mW (wzbudzenie przy 488nm) z 50% wyjściową mocą lasera do obrazowania PKC znakowanego białkiem eGFP oraz lasera HeNe (wzbudzenie przy 543nm) do obrazowania PKC znakowanego białkiem mRFP. Linie laserowe argonowa i HeNe są tłumione do odpowiednio 4% i 50% transmitancji wyjściowej przed obrazowaniem, a otwór pinhole jest ustawiony na wartość jeden.</li>
 <li>Ważne jest, aby naczynie hodowlane było stabilnie zamocowane na stole obrazującym i aby uniknąć ruchu lub wibracji.</li>
 <li>Delikatnie usuń 1 mL pożywki hodowlanej z naczynia za pomocą pipety 10 mL, pozostawiając w naczyniu całkowitą objętość 1 mL.</li>
 <li>Wykonaj zdjęcia w sekcji środkowej komórek, w której widoczne jest jądro.</li>
 <li>Ustaw serię czasową 10-20 obrazów konfokalnych, wykonując zdjęcie co 30 sekund.</li>
 <li>Rozpocznij serię czasową.</li>
 <li>Po wykonaniu 2 zdjęć (po punkcie czasowym 30 sekund), dodaj 1 mL leku (stężenie 2X), delikatnie kapiąc go na komórki za pomocą pipety P1000. Lek jest dodawany w sposób ciągły przez około 30 sekund.</li>
 <li>Niektóre leki wywołują szybką translokację, która może być widoczna natychmiast po podaniu leku (w punkcie czasowym 60 sekund), podczas gdy inne wywołują wolną translokację, która osiąga optymalny poziom dopiero 5-10 minut po podaniu (Film 1 i Film 2).</li>
 <li>Jeśli lek wymaga wypłukania, użyj dwóch pipet 10 mL do przeprowadzenia płukania, delikatnie dozując bufor płuczący jedną pipetą po jednej stronie naczynia i odsysając pożywkę drugą pipetą z drugiej strony.</li>
 <li>Jeśli płukanie było skuteczne i jeśli efekt działania leku jest odwracalny, PKC powraca do cytozolu w ciągu 30-60 sekund.</li>
 <li>Zapisz film jako plik LSM.</li>
 <li>Użyj oprogramowania NIH Image J do otwarcia plików LSM i ilościowej analizy obrazów przed i po podaniu leku. Analiza ilościowa została opisana w innym opracowaniu 1.</li>
</ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisaliśmy technikę obrazowania translokacji PKC znakowanych fluorescencyjnie w czasie rzeczywistym w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia. Komórki Sf9 stanowią prosty system do obrazowania translokacji PKC, ponieważ ich hodowla i transfekcja są dość proste. W przeciwieństwie do nich, opanowanie mikroiniekcji w neuronach sensorycznych Aplysia wymaga czasu; może to potrwać kilka miesięcy. Trudności związane z tą techniką obejmują m.in. zatykanie się elektrod. Filtrowanie i wirowanie roztw...

<table><tbody><tr><td>zamrożone komórki Sf9</td><td>&lt;em&gt;*Spodoptera frugiperda*&lt;/em&gt; komórki jajnika</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;pożywka do owadów, suplementowana (1X), płynna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Stosować do hodowli komórek Sf9</td></tr><tr><td>Corning 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kolba do hodowli komórkowych z ukośną szyjką</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Stosować do hodowli komórek Sf9</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Odczynnik</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Suplement Grace&amp;rsquo;pożywki z FBS przed użyciem</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Do filtrowania roztworu Fast Green</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Służy do filtrowania roztworu plazmidowego DNA / Fast Green</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Użyć do przefiltrowania roztworu Fast Green</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Narzędzie</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Użyć do przefiltrowania roztworu DNA plazmidowego / Fast Green</td></tr><tr><td>szalka z szklanym dnem</td><td>Narzędzie</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Stosować do hodowli komórek Sf9 przed transfekcją i obrazowaniem</td></tr><tr><td>Odczynnik Cellfectin II</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Stosowane do ekspresji PKCs znakowanych fluorescencyjnie w komórkach Sf9</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Służy do wizualizacji mikroiniekcji roztworu plazmidowego DNA do &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; neurony czuciowe</td></tr><tr><td>Cienkościenne kapilary szklane</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Użyj do sporządzenia mikr&amp;#8211;elektrody do mikrowstrzykiwania</td></tr><tr><td>Końcówka do pipety mikrodozownika</td><td>Narzędzie</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Autoklawować przed napełnieniem mikro...&amp;#8211;elektrody do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump PV820 </td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Elementy stanowiska do mikoiniekcji</td></tr><tr><td>Mikr&amp;#8211;uchwyt elektrody</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Użyć do przytrzymania mikr&amp;#8211;elektroda </td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narzędzie</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Użyć do pozycjonowania mikr&amp;#8211;elektroda w układzie trójosiowym</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo translokacji pkc w komórkach sf9 oraz w neuronach sensorycznych aplysia

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Kinazy białkowe C (PKCs) są kinazami seryno-treoninowymi, które odgrywają centralną rolę w regulacji szerokiej gamy procesów komórkowych, takich jak wzrost komórek, uczenie się i pamięć. U kręgowców znane są cztery rodziny izoform PKC: klasyczne PKCs (α, βI, βII i γ), nowatorskie typu I PKCs (ε i η), nowatorskie typu II PKCs (δ i θ) oraz atypowe PKCs (ζ i ι). Klasyczne PKCs są aktywowane przez Ca2+ i diacyliglicerol (DAG), podczas gdy nowatorskie PKCs są aktywowane przez DAG, lecz są niezależne od Ca2+. Atypowe PKCs nie są aktywowane ani przez Ca2+, ani przez DAG. W Aplysia californica, naszym systemie modelowym do badania formowania pamięci, występują trzy specyficzne dla układu nerwowego izoformy PKC, po jednej z każdej głównej klasy: konwencjonalna PKC Apl I, nowatorska typu I PKC Apl II oraz atypowa PKC Apl III. PKCs są kinazami aktywowanymi lipidowo, dlatego aktywację klasycznych i nowatorskich PKCs w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe często korelowano z translokacją PKC z cytoplazmy do błony komórkowej. W związku z tym wizualizacja translokacji PKC w czasie rzeczywistym w żywych komórkach stała się nieocenionym narzędziem do wyjaśniania szlaków transdukcji sygnału prowadzących do aktywacji PKC. Na przykład technika ta pozwoliła nam ustalić, że różne izoformy PKC translokują w różnych warunkach, aby pośredniczyć w odmiennych typach plastyczności synaptycznej, oraz że aktywacja PKC Apl II przez serotoninę (5HT) wymaga produkcji zarówno DAG, jak i kwasu fosfatydowego (PA) do translokacji 1-2. Co istotne, możliwość wielokrotnej wizualizacji tego samego neuronu pozwoliła nam na przykład zmierzyć desensytyzację odpowiedzi PKC z niezwykłą dokładnością 3. W tym filmie demonstrujemy każdy etap przygotowania kultur komórek Sf9 (kultury neuronów sensorycznych Aplysia zostały opisane w innym artykule wideo 4), ekspresję PKC znakowanych fluorescencyjnie w komórkach Sf9 i w neuronach sensorycznych Aplysia oraz obrazowanie na żywo translokacji PKC w odpowiedzi na różne aktywatory z użyciem mikroskopii skaningowej laserem.

W tym filmie demonstrujemy wizualizację translokacji PKC w żywych komórkach z wykorzystaniem PKC znakowanych fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Kinazy białkowe C (PKC) są kinazami seryno-treoninowymi, które odgrywają centralną rolę w regulacji szerokiego spektrum procesów komórkowych, takich jak wzrost komórki i ...

Celem niniejszej procedury jest wizualizacja translokacji PKC znakowanej fluorescencyjnie w żywych komórkach. Jest to osiągane poprzez wstępne przygotowanie kultur komórek SF nine lub kultur neuronów sensorycznych z Plegia California. Drugim krokiem jest ekspresja znakowanych fluorescencyjnie pkcs w komórkach.Ostatnim krokiem jest obrazowanie translokacji PKC w odpowiedzi na różne aktywatory przy użyciu mikroskopii skaningowej laserem. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące różnicową regulację poszczególnych izoform PKC przez wtórne przekaźniki, takie jak diol glicerol, poprzez obrazowanie translokacji PKC w czasie rzeczywistym w żywych komórkach. Cześć, nazywam się Carol Ferra.Jestem adiunktem w laboratorium dr. Wayne'a Sawna w Instytucie Neurologicznym w Montrealu. Dzisiaj zaprezentuję obrazowanie na żywo translokacji PKC w neuronach sensorycznych Aplysia. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu plastyczności synaptycznej, takie jak sposób aktywacji różnych izoform PKC podczas formowania pamięci.Aby przygotować monowarstwy kultur komórek SF nine w komorze z laminarnym przepływem powietrza, do kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm² należy wlać 8 mL pożywki Grace'a dla owadów z dodatkiem 30% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie szybko rozmrozić zamrożoną probówkę z komórkami SF nine w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, poruszając probówką w przód i w tył przez około jedną do dwóch minut. Następnie przenieść komórki SF nine do kolby hodowlanej i delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki. Inkubować komórki przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 27 °C aż do ich przyczepienia.Następnie usunąć stare pożywkę z kolby i zastąpić ją kolejnymi 10 mililitrami świeżej pożywki dla owadów Grace'a z 30%FBS; inkubować komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza do momentu osiągnięcia konfluencji. Aby utrzymać hodowle monowarstwowe, usunąć starą pożywkę z kolby z konfluentnymi komórkami SF9 i dodać pięć mililitrów pożywki dla owadów Grace'a z 10%FBS; kilkakrotnie lekko uderzyć w bok kolby, aby odczepić komórki SF9. Następnie, używając pipety 10 mililitrów, delikatnie pipetować pożywkę w górę i w dół.Po rozpyleniu zawiesiny na ściance kolby podczas pipetowania w dół, przenieś komórki do sterylnej polistyrenowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek SF nine do ośmiu mililitrów pożywki dla owadów Grace'a z 10% FBS do nowej kolby do hodowli komórek o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych, zachowując stosunek rozcieńczenia jeden do pięciu. Aby utrzymać wzrost w fazie logarytmicznej, delikatnie potrząśnij kolbą ręcznie.Następnie ponownie inkubuj komórki w temperaturze 27 °C aż do osiągnięcia konfluencji. Po inkubacji komórki SF9 są gotowe do użycia w celu ekspresji fluorescencyjnie znakowanych pkcs, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej poprzedzającej ekspresję fluorescencyjnie znakowanych pkcs. Hodowle komórek neuronalnych z zwojów okrężniczych przygotowuje się w szklanych naczyniach hodowlanych z dnem typu MatTek, jak opisano wcześniej. Dwa dni po izolacji neuronów sensorycznych przefiltruj wcześniej przygotowany roztwór fast green, używając strzykawki i filtra strzykawkowego o średnicy 20 mm i rozmiarze porów 0,2 µm.Przygotuj w wodzie destylowanej zawierającej 0,5% fast green roztwór plazmidowego DNA kodującego E-G-F-P-P KC API two o stężeniu nieprzekraczającym 0,4 µg/µL. Przefiltruj roztwór plazmidowego DNA z fast green, używając strzykawki o pojemności 1 mL oraz filtra strzykawkowego o średnicy 4 mm i rozmiarze porów 0,2 µm. Następnie odwiruj roztwór plazmidowego DNA z fast green z prędkością 16 110 ×g przez 15 minut w mikrowirówce.Następnie, za pomocą wyciągacza mikroelektrod, przygotuj ostre elektrody do mikroiniekcji neuronów. Wyciągnij szklane mikroelektrody, korzystając z cienkościennych kapilar szklanych z włóknami wewnątrz. Napełnij każdą elektrodę 2 µL roztworu plazmidowego DNA z barwnikiem fast green.Wykorzystując końcówkę pipety do mikrodozowania, mikroiniekcję przeprowadza się na stanowisku do mikroiniekcji. Stanowisko to składa się z wykonanego własnoręcznie dużego szklanego podestu do utrzymywania naczyń hodowlanych na stole wibroizolacyjnym, stereoskopu z zewnętrznym oświetleniem halogenowym, mikromanipulatora oraz uchwytu mikroelektrody podłączonego do pompy pneumatycznej.Wejście ciśnieniowe pompy pneumatycznej jest podłączone do zbiornika ze sprężonym azotem. Przenieś naczynie hodowlane Matech z dnem szklanym zawierające hodowle neuronów z obszaru plegii do stacji mikroiniekcyjnej i umieść mikroelektrodę w uchwycie na mikroelektrody. Obserwuj neurony pod mikroskopem stereoskopowym i wprowadź końcówkę mikropipety do jądra komórkowego.Podawaj krótkie impulsy ciśnienia azotu o czasie trwania od 10 do 100 milisekund i wartości 20 pounds per square inch, aż jądro stanie się jednorodnie zielone. Inkubuj komórki przez cztery godziny w temperaturze pokojowej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do momentu użycia; do obrazowania komórek SF nine oraz neuronów sensorycznych Drosophila wykorzystuje się odwrócony mikroskop konfokalny Zeiss LSM five 10 z obiektywem axia avert. 200.W niniejszym filmie zaprezentowano obrazowanie neuronów sensorycznych plegi. Szczegółowe informacje dotyczące obrazowania komórek SF nine znajdują się w protokole pisemnym. Do obrazowania białka PKC znakowanego EGFP należy użyć lasera argonowego o mocy 30 milliwatts z 50% mocą wyjściową lasera.Następnie należy osłabić wiązkę lasera Argonne do 4% transmitancji wyjściowej. Potem należy ustawić otwór w przysłonie (pinhole) na wartość jeden, ustabilizować naczynie hodowlane na stole obrazującym oraz zapobiec wszelkim ruchom lub wibracjom. Ostrożnie należy odessać jeden mililitr pożywki hodowlanej z naczynia za pomocą pipety o objętości 10 mililitrów, pozostawiając całkowitą objętość jeden mililitr.W naczyniu hodowlanym zlokalizuj środkową sekcję komórek, w której widoczne jest jądro. Ustaw serię czasową od 10 do 20 obrazów konfokalnych w odstępach czasowych wynoszących 30 sekund.Uruchom film i po wykonaniu drugiego zdjęcia wywołaj translokację, delikatnie dodając jeden mililitr leku o dwukrotnym stężeniu. Dodawaj lek kropla po kropli bezpośrednio na komórki w sposób ciągły przez około 30 sekund. W tym przypadku do wywołania szybkiej translokacji zastosowano serotoninę, która może być widoczna bezpośrednio po podaniu leku.Niektóre leki indukują powolną translokację, która osiąga optimum dopiero od 5 do 10 minut po podaniu leku. Wypłucz lek za pomocą dwóch pipet o pojemności 10 ml, delikatnie dozując bufor płuczący jedną pipetą z jednej strony szalki i pobierając medium drugą pipetą z drugiej strony. Jeśli płukanie jest skuteczne, a efekt działania leku jest odwracalny, PKC powróci do cytosolu w ciągu 30 do 60 sekund. Zapisz film jako plik LSM, zgodnie z instrukcją.Oto reprezentatywne wyniki obrazowania na żywo translokacji PKC w neuronach sensorycznych plegia. Wyrażono E-G-F-P-P KC APL two w neuronie sensorycznym i zarejestrowano serię 10 obrazów konfokalnych w odstępach czasowych 30 sekund. W tym przykładzie serotoninę dodano do naczynia po 30 sekundach rejestracji.W tym przykładzie przedstawiono obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach SF nine. E-G-F-P-P KC APL one oraz M-R-F-P-P KC APL two wykazano koekspresję w komórkach SF nine, a seria 10 obrazów konfokalnych została zarejestrowana w odstępach czasu wynoszących 30 sekund. Jeden dwa DIOCTYL SN glycerol.Przepuszczalny przez błony komórkowe analog gliceryny DYL dodano do szalki po 30 sekundach rejestracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ekspresować fluorescencyjnie znakowane pkcs w neuronach sensorycznych aplazji oraz jak obrazować translokację PKC w żywych komórkach.

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawienie w czasie rzeczywistym translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach czuciowych Aplysia

W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu obserwacji asymetrycznego podziału komórek progenitorowych organów sensorycznych oraz komórek epidermy w nienaruszonych poczwarkach...

Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Źródło: Jongbloets, B. C., et al. Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo. J. Vis. Exp. (2019) Ten film demonstruje procedurę mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej do wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachłanających głowę podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej 

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Ten protokół opisuje zastosowania immobilizacji próbki za pomocą skrzepów fibryny, ograniczając dryf i umożliwiając dodawanie i wymywanie odczynników podczas obrazowania na żywo. Próbki przenosi się do kropli pożywki zawierającej fibrynogen na powierzchni szkiełka nakrywkowego, po czym indukuje się polimeryzację przez dodanie trombiny.

Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół krokowy, jak wykorzystać zintegrowany wielofunkcyjny i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczne obrazowanie wielokanałowe i analizę mechanobiologiczną w celu wyjaśnienia mechano-wrażliwości białka związanego z Tak (YAP).

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę obrazowania translokacji PKC w żywych komórkach Sf9 i neuronach czuciowych Aplysia za pomocą fluorescencyjnego znacznika i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek kinazy C w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie na żywo translokacji PKC w komórkach Sf9 oraz w neuronach sensorycznych Aplysia

Przeglądaj więcej filmów