Name: Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity) Profilowanie polarnych glicerolipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w połączeniu z chromatografią gazowo-cieczową (GLC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Poznaj metodę profilowania polarnych glicerolipidów w Arabidopsis thaliana przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej i gazowo-cieczowej. Technika ta umożliwia ilościową analizę składu kwasów tłuszczowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana z grantu przyznanego Christophowi Benningowi przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (US National Science Foundation).

1. Ekstrakcja lipidów
<ol>
<li>Ekstrakcję lipidów rozpocznij od zebrania 30 mg liści 4-tygodniowej Arabidopsis z roślin hodowanych na podłożu utwardzonym agarem lub w glebie, a następnie przenieś je do 1,5 mL polipropylenowych probówek reakcyjnych. Świeże liście można zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
<li>Do każdej próbki dodaj 300 μL rozpuszczalnika do ekstrakcji składającego się z metanolu, chloroformu i kwasu mrówkowego (20:10:1, v/v/v). Wstrząsaj energicznie (używając wstrząsarki lakierniczej lub podobnej) przez 5 minut.</li>
<li>Dodaj 150 μL 0,2 M kwasu fosforowego (H3PO4), 1 M chlorku potasu (KCl) i krótko wymieszaj w vortexie.</li>
<li>Wiruj przy 13 000xg w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Lipidy rozpuszczone w dolnej fazie chloroformowej zostaną naniesione na płyty TLC.</li>
</ol>
2. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)15
<ol>
<li>Aby przygotować płytki TLC, zanurz na 30 s płytkę TLC powleczoną żelem krzemionkowym o wymiarach 20 cm x 20 cm z paskiem do nakładania próbek w 0,15 M roztworze siarczanu amonu ((NH4)2SO4). Po 30 sekundach zanurzania susz płytkę przez co najmniej 2 dni w zamkniętym pojemniku. Podczas aktywacji sublimacja amoniaku pozostawia kwas siarkowy, który protonuje fosfatydyloglicerol, co jest niezbędne do jego oddzielenia od innych glicerylipidów.</li>
<li>W dniu eksperymentu aktywuj płytki TLC, wypalając je w piekarniku w temperaturze 120 °C przez 2,5 godziny.</li>
<li>Po ochłodzeniu aktywowanych płytek do temperatury pokojowej, narysuj ołówkiem prostą linię (1,5 cm od krawędzi płytki) w poprzek płytki w punkcie startowym chromatogramu.</li>
<li>W dygestorium powoli nanieś 3 x 20 μL ekstraktu lipidowego z dolnej fazy chloroformowej, używając pipety 20 μL z żółtymi plastikowymi końcówkami 200 μL, pod słabym strumieniem N2. W tym celu do regulatora butli z N2 podłączono rurkę Tygon. Plamka powinna mieć średnicę mniejszą niż 1 cm. Każda płytka może pomieścić do 10 próbek (w przypadku planowania późniejszej analizy GLC).</li>
<li>Podczas całkowitego wysychania plamek lipidowych w dygestorium, przygotuj rozwijający układ rozpuszczalników składający się z acetonu, toluenu i wody (91 mL: 30 mL: 7,5 mL). Wysoka względna wilgotność powietrza w otoczeniu może wpłynąć na rozdzielenie. W takim przypadku należy zmniejszyć ilość wody do proporcji (91 mL: 30 mL: 7,0 mL), aby uzyskać pożądane rozdzielenie.</li>
<li>Wlej 80 mL rozpuszczalnika rozwijającego do szczelnej komory rozwijania TLC (D: W: S = 27,0: 26,5: 7,0 cm/cm/cm) i umieść płytkę w komorze końcem z próbkami skierowanym w dół. Zamknij komorę za pomocą zacisku. Rozpuszczalnik będzie przemieszczał się w górę płytki, a lipidy zostaną rozdzielone. Czas rozwijania wynosi około 50 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie odległość 1 cm od górnej krawędzi płytki, ostrożnie wyjmij płytkę z komory i całkowicie wysusz w dygestorium przez około 10 minut.</li>
<li>Lipidy rozdzielone metodą TLC można barwić odwracalnie krótko jodem w celu analizy ilościowej lub nieodwracalnie kwasem siarkowym bądź α-naftolem.
<ol>
<li>Wypalanie kwasem siarkowym: spryskaj płytkę 50% kwasem siarkowym w wodzie za pomocą szklanej butelki z atomizerem w dygestorium i wypalaj w temperaturze 120 °C przez 15 minut (Rycina 2A).</li>
<li>Barwienie α-naftolem dla glikolipidów: spryskaj płytkę 2,4% (m/v) α-naftolem w 10% (v/v) kwasie siarkowym i 80% (v/v) etanolu i wypalaj w temperaturze 120 °C przez 3-5 minut, aż prążki glikolipidów zabarwią się na różowo lub fioletowo (Rycina 2B). Nadmierne traktowanie doprowadzi do zwęglenia wszystkich lipidów ze względu na obecność kwasu siarkowego w odczynniku.</li>
<li>Barwienie jodem: w dygestorium umieść płytkę w zamkniętej komorze TLC z kryształkami jodu (w tacy na dnie, co prowadzi do nasycenia atmosfery oparami jodu, aż lipidy staną się widoczne). Nie wystawiaj płytki na działanie jodu zbyt długo, ponieważ może on kowalencyjnie modyfikować wielonienasycone kwasy tłuszczowe (Rycina 2C). Alternatywnie, aby uniknąć utleniania lipidów, należy barwić jedynie standardowe ścieżki przeplatane ścieżkami z próbkami, używając pipety Pasteura zatkanej watą szklaną z kryształkami jodu, przez którą przepływa N2 nad poszczególnymi ścieżkami standardów.</li>
</ol>
</li>
</ol>
3. Reakcja otrzymywania metyloestrów tłuszczowych kwasów tłuszczowych (FAME)16
<ol>
<li>Za pomocą żyletki usuń krzemionkę z obszarów wokół zidentyfikowanych plamek lipidowych na płytce TLC. Zeskrob krzemionkę zawierającą lipidy i za pomocą lejka przelej proszek do szklanej probówki z nakrętką wyłożoną teflonem (PTFE).</li>
<li>Do każdej próbki dodać za pomocą pipety szklanej 1 ml 1 N kwasu solnego (HCl) w bezwodnym metanolu.</li>
<li>Dodaj 100 μL 50 μg ml-1 kwas pentadekanowy (15:0) przy użyciu 200 μL do każdej próbki pipetować jako standard wewnętrzny za pomocą 200 μL pipetą z 200 μL żółty plastikowy końcówka. Jako próbę kontrolną należy zachować probówkę zawierającą wyłącznie kwas pentadecenowy w metanolowym roztworze HCl. Probówki szklane należy szczelnie zamknąć nakrętkami z wyściółką teflonową.</li>
<li>Inkubować probówki szklane w 80 °C kąpiel wodna przez 25 minut. Probówki muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec odparowywaniu rozpuszczalnika.</li>
<li>Po ochłodzeniu probówek dodać 1 ml 0,9% chlorku sodu, a następnie 1 ml heksanu i intensywnie wymieszać na wirówce vortex. Próbki wirować z przyspieszeniem 1000xg przez 3 minuty.</li>
<li>W dygestorium należy usunąć heksan/górną warstwę próbki za pomocą pipety Pasteura i przenieść ją do nowej szklanej probówki o wymiarach 13x100 mm.</li>
<li>Odparować heksan w powolnym strumieniu N22 bez całkowitego wysuszania.</li>
<li>Rozpuścić otrzymane metyloestry kwasów tłuszczowych w 60 μL heksan. Przenieść próbki do fiolek do autopróbniku i szczelnie zamknąć. Próbki można przechowywać w 4 °C dla krótkoterminowego i -20 °C przez kilka dni.</li>
</ol>
4. Chromatografia gazowo-cieczowa (GLC)10
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem GLC należy upewnić się, że butle z helem, wodorem i powietrzem są napełnione.</li>
<li>Do zbiornika z rozpuszczalnikiem należy dodać odpowiednią ilość heksanu, a pojemnik na odpady musi być pusty. Do rozdziału metyloestrów kwasów tłuszczowych do urządzenia należy podłączyć kolumnę DB-23.</li>
<li>Umieść fiolki w autosamplerze. Uruchom oprogramowanie Chemstation do GLC na komputerze systemowym.</li>
<li>Ustaw temperaturę wlotu na 250 °C, przepływ helu na 48.6 mL min-1 i ciśnienie na 21.93 psi. Stosunek podziału (split ratio) wynosi 30.0: 1.</li>
<li>Temperaturę termostatu ustaw początkowo na 140 °C na 2 min, a następnie podnieś do 160 °C z szybkością 25 °C min-1. Następnie ustaw wzrost temperatury od 160 °C do 250 °C z szybkością 8 °C min-1 i utrzymuj 250 °C przez 4 min, po czym obniż temperaturę do 140 °C z szybkością 38 °C min-1. Jeden pomiar trwa około 21 minut.</li>
<li>Temperatura detektora zapłonowego (FID) wynosi 270 °C przy przepływie wodoru 30.0 mL min-1, przepływie powietrza 400 mL min-1 i przepływie helu 30.0 mL min-1.</li>
<li>Wprowadź liczbę fiolek i nazwy próbek do tabeli sekwencji pomiarowej. Ustaw wstrzykiwacz 10 μL tak, aby wstrzyknął 2 μL próbki z każdej fiolki.</li>
<li>Po przygotowaniu instrumentu uruchom sekwencję pomiarową.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykłady nieodwracalnego barwienia lipidów rozdzielonych metodą TLC z 4-tygodniowych siewek Arabidopsis przedstawiono na Rysunku 2. Lipidy zabarwione kwasem siarkowym (Rysunek 2A) ulegają zwęgleniu i pojawiają się jako brązowe plamy. Do barwienia glikolipidów, takich jak MGDG, DGDG, SQDG itp., zaleca się stosowanie α-naftolu. Glikolipidy zabarwione α-naftolem przyjmują kolor różowo-fioletowy, podczas gdy pozostałe lipidy polarne barwią się na żółto (Rysunek 2B). Barwienie jodem jest odwracalne i nadaje lipidom żółtawy kolor, który znika po krótkim czasie w miarę odparowywania jodu (Rysunek 2C). W skrócie, lipidy zabarwione jodem można poddać analizie GLC, choć aby ograniczyć rozkład lipidów, preferowane jest stosowanie lipidów niezabarwionych.
W przypadku pomyślnego przeprowadzenia procedury, po analizie GLC zaobserwowany zostanie charakterystyczny sygnał reprezentujący poszczególne estry metylowe kwasów tłuszczowych (Rysunek 3). Estry metylowe kwasów tłuszczowych o krótszym łańcuchu węglowym i mniejszej liczbie wiązań podwójnych wykazują krótszy czas retencji przy użyciu kolumny DB-23. Profilowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych jest czułym narzędziem do identyfikacji mutantów o zmienionym składzie lipidowym. Na Rysunku 4 widać, że molowy stosunek kwasów tłuszczowych MGDG18:3 jest zmniejszony u mutanta tgd4-1 w porównaniu do typu dzikiego18. Stosunek molowy każdego lipidu oblicza się, dzieląc liczbę moli estrów metylowych kwasów tłuszczowych dla jednej klasy lipidów przez sumę moli wszystkich klas lipidów. Na przykład, aby obliczyć stosunek molowy MGDG:
(MGDG) mol% = ∑ [FAMEs(MGDG)] / ∑ [FAMEs(total)] x100%
Można porównać wynikowe stosunki molowe każdej klasy lipidów dla typu dzikiego oraz mutanta. Na przykład mutant tgd4-1 wykazuje zwiększone względne ilości MGDG i PG, ale zmniejszone ilości DGDG i PE (Rycina 5)18.

<img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Schemat ekstrakcji lipidów; metoda TLC; siewki Arabidopsis; reakcja FAME; proces analizy GLC." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat analizy lipidów polarnych z wykorzystaniem siewek Arabidopsis. Lipidy całkowite są ekstrahowane z 4-tygodniowych siewek Arabidopsis i rozdzielane metodą TLC. Rozdzielone lipidy można zeskrobać z płytek TLC w celu przeprowadzenia transestryfikacji, a następnie analizy GLC.
<img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Schemat chromatografii lipidów z MGDG, PG, DGDG dla analizy próbek i wyników rozdziału." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Rozdział lipidów na płytkach TLC. Ekstrakty lipidowe z 35 mg (masy świeżej) siewek typu dzikiego są rozdzielane metodą TLC i barwione kwasem siarkowym (A), α-naftolem (B) lub oparami jodu (C). Dla każdej metody barwienia przedstawiono trzy powtórzenia. DGDG, digalaktozyldiacyloglicerol; MGDG, monogalaktozyldiacyloglicerol; PC, fosfatydylocholina; PE, fosfatydyloetanoloamina; PG, fosfatydyloglicerol; PI, fosfatydyloinozytol; SQDG, sulfochinowozyldiacyloglicerol.
<img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Proces chromatografii; sygnał detektora w funkcji czasu retencji; analiza piku chromatogramu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza GLC estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAMEs) pochodzących z MGDG typu dzikiego. FAMEs są rozdzielane na kolumnie kapilarnej o długości 30 m i detekowane za pomocą detektora FID. Jako standard wewnętrzny zastosowano kwas pentadekanowy (15:0).
<img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy składu kwasów tłuszczowych dla Col2, tgd4-1; porównanie danych, mol% 16:0-18:3, wyniki eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Profil kwasów tłuszczowych MGDG w typie dzikim Col2 (białe słupki) i mutancie tgd4-1 (czarne słupki). Kwasy tłuszczowe przedstawiono jako liczbę węgli, a następnie liczbę wiązań podwójnych. Przedstawiono średnią z trzech powtórzeń oraz odchylenia standardowe.
<img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Wykres słupkowy składu lipidów przedstawiający mol% MGDG, PG, DGDG, SQDG, PE, PC w Col2 vs. tgd4-1." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Skład lipidów polarnych typu dzikiego Col2 (białe słupki) oraz mutanta tgd4-1 (czarne słupki). Przedstawiono średnie z trzech powtórzeń, a odchylenia standardowe zaznaczono słupkami błędów.

<ol><li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis%3A+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li>
<li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li>
<li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li>
<li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li>
<li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li>
<li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li>
<li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones%2C+lipids%2C+channels+and+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li>
<li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li>
<li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+partition+chromatography%3B+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li>
<li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li>
<li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling%2C+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis%2C+TGD3%2C+involved+in+chloroplast+lipid+import%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li>
<li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography%3B+methods%2C+influencing+factors+and+an+example+of+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li>
<li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li>
<li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

TLC sprzężone z GLC stanowi niezawodne i szybkie narzędzie do ilościowej analizy lipidów polarnych w roślinach. Pozwala na identyfikację niewielkich zmian w składzie lipidów; dlatego metoda ta była stosowana do wielkoskalowego przesiewania mutantów z zaburzeniami w szlakach metabolicznych lipidów polarnych1,20. Metoda ta jest również szeroko wykorzystywana do monitorowania aktywności enzymów wykorzystujących lipidy polarne jako substrat.2,6,7
Oprócz liści, w ten sam sposób można określić skład lipidowy innych tkanek roślinnych, takich jak korzenie i nasiona, lub frakcji subkomórkowych, takich jak chloroplasty i mitochondria. 
Zastosowany tutaj układ rozpuszczalników (aceton, toluen, woda) jest zoptymalizowany pod kątem rozdziału glikolipidów i fosfolipidów w roślinach. Jednak w mutantach tgd1,2,3,4 oraz w izolowanych chloroplastach TGDG współeluje z PE, natomiast tetragalaktosylodiacyloglicerol współeluje z PC. W takim przypadku stosuje się układ rozpuszczalników składający się z chloroformu, metanolu, kwasu octowego i wody (85: 20: 10: 4, v/v/v/v)13. Czasami, w celu dokładniejszego rozdziału glikolipidów i fosfolipidów, wykonuje się dwuwymiarową TLC z użyciem dwóch różnych układów rozpuszczalników19. Ponadto tkanki roślinne można poddać bezpośrednio reakcji FAME, a następnie analizie GLC, aby określić całkowity profil kwasów tłuszczowych bez wstępnego rozdziału metodą TLC5. Oprócz zaprezentowanego systemu TLC-GLC, inną metodą wykorzystywaną do profilowania lipidów jest bezpośrednia tandemowa spektrometria mas z jonizacją przez rozpylanie elektryczne17. W tej metodzie pomija się wstępny rozdział chromatograficzny lipidów w ekstrakcie. Metoda ta wymaga jednak drogiej aparatury i doświadczonego personelu, co czyni ją mniej użyteczną w rutynowych analizach laboratoryjnych lub w badaniach przesiewowych mutantów.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Metanolowy HCl 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Rozcieńczyć do 1N metanolem</td></tr><tr><td>Płytki TLC Si250-PA</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Z warstwą wstępnego absorbenta</td></tr><tr><td>Komora TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka PTFE</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>System GLC</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna DB-23</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do GLC</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętki do fiolek GLC</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie polarnych glicerolipidów arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (tlc) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Błony biologiczne oddzielają komórki od środowiska. Od pojedynczej komórki po wielokomórkowe rośliny i zwierzęta, glicerolipidy, takie jak fosfatydylocholina czy fosfatydyloetanoloamina, tworzą błony dwuwarstwowe, które pełnią funkcję zarówno granic, jak i interfejsów wymiany chemicznej między komórkami a ich otoczeniem. W przeciwieństwie do zwierząt, komórki roślinne posiadają specjalną organellę do fotosyntezy – chloroplast. Złożony system błon chloroplastu zawiera unikalne glicerolipidy, a mianowicie glikolipidy pozbawione fosforu: monogalaktosylodiacyloglicerol (MGDG), digalaktosylodiacyloglicerol (DGDG) oraz sulfokwinowosylodiacyloglicerol (SQDG)4. Role tych lipidów wykraczają poza funkcje czysto strukturalne. Glikolipidy te oraz inne glicerolipidy zostały zidentyfikowane w strukturach krystalicznych fotosystemu I i II, co wskazuje na udział glicerolipidów w procesie fotosyntezy8,11. Podczas niedoboru fosforanów, DGDG jest transportowany do błon pozaplastydialnych w celu zrekompensowania utraty fosfolipidów9,12.
Większość naszej wiedzy na temat biosyntezy i funkcji tych lipidów została uzyskana dzięki połączeniu badań genetycznych i biochemicznych z użyciem Arabidopsis thaliana14. Podczas tych badań niezbędna dla przesiewania i analizy mutantów lipidowych była prosta procedura analizy lipidów polarnych, która zostanie tutaj szczegółowo omówiona. Wyciąg lipidowy z liści jest najpierw rozdzielany za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), a glicerolipidy są barwione odwracalnie oparami jodu. Poszczególne lipidy są zeskrobane z płytek TLC i przekształcane w metyloestry kwasów tłuszczowych (FAMEs), które następnie analizuje się za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (FID-GLC) (Rycina 1). Metoda ta okazała się niezawodnym narzędziem do przesiewania mutantów. Na przykład mutanty tgd1,2,3,4, zaburzone w transporcie lipidów z retikulum endoplazmatycznego do plastydów, zostały odkryte na podstawie akumulacji nieprawidłowego galaktoglicerolipidu: trigalaktosyldiacyloglicerolu (TGDG) oraz spadku względnej ilości grup acylowych 18:3 (węgle : wiązania podwójne) w lipidach błonowych 3,13,18,20. Metoda ta znajduje zastosowanie również w oznaczaniu aktywności enzymatycznej białek wykorzystujących lipidy jako substrat6.

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Błony biologiczne oddzielają komórki od środowiska. Od pojedynczej komórki po wielokomórkowe rośliny i zwierzęta, glicerylipidy, takie jak...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie składu lipidów polarnych siewek Arabidopsis. Jest to osiągane poprzez wstępną ekstrakcję lipidów z siewek, a następnie rozdział lipidów polarnych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.Następnie konkretne plamki lipidowe są izolowane z płytki cienkowarstwowej i przekształcane w estry metylowe kwasów tłuszczowych poprzez przeestryfikację. Końcowym etapem procedury jest ilościowe oznaczenie składu estrów metylowych kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące stosunek molowy oraz profil kwasów tłuszczowych każdego lipidu polarnego w typie dzikim oraz mutancie.Witajcie, nazywam się Christophe Benning. Wielu z Państwa pytało nas o sposób przeprowadzenia analizy ilościowej lipidów polarnych. Stosujemy bardzo prostą i niezawodną metodę, która sprawdziła się podczas przesiewania mutantów na dużą skalę w roślinie modelowej Arabidopsis thaliana.Inne doskonałe metody, takie jak profilowanie lipidów oparte na spektrometrii mas, wymagają kosztownej aparatury oraz dużego doświadczenia i przeszkolenia. Stosujemy dwuetapową procedurę, która obejmuje prostą chromatografię cienkowarstwową w połączeniu z oznaczaniem ilościowym metyloestrów kwasów tłuszczowych po izolacji mutantów. Zazwyczaj wymagana jest bardziej ilościowa analiza.Jest to realizowane poprzez izolację lipidów błonowych z płytki cienkowarstwowej i przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są oznaczone za pomocą chromatografii gazowej. Metoda ta jest wysoce powtarzalna, a jej wyniki są porównywalne z bardziej złożonymi technikami opartymi na spektrometrii mas, co dowodzi skuteczności procedury. Zen Wang, doktorant z mojego laboratorium, rozpoczyna ekstrakcję lipidów od pobrania 30 mg liści czterotygodniowych roślin Arabidopsis, wyhodowanych na podłożu z agarem lub w glebie. Liście należy przenieść do 1,5 ml polipropylenowych probówek reakcyjnych.Do każdej próbki dodać 300 µL rozpuszczalnika do ekstrakcji składającego się z metanolu, chloroformu i kwasu mrówkowego. Próbki energicznie wstrząsać przez pięć minut. Następnie dodać 150 µL 0,2 M kwasu fosforowego, 1 M chlorku potasu i wymieszać na wortexie.Próbkę krótko odwiruj z prędkością 13 000 ×g przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej lipidy rozpuszczone w dolnej fazie chloroformowej nanosi się na płytki do chromatografii cienkowarstwowej. Aby przygotować płytki TLC, zanurz płytkę TLC o wymiarach 20 na 20 cm powleczoną żelem krzemionkowym z paskiem do nakładania w 0,15 M roztworze siarczanu amonu.Po zanurzeniu na 30 sekund suszyć płytkę przez co najmniej dwa dni w zamkniętym pojemniku. Podczas aktywacji sublimacja amoniaku pozostawia kwas siarkowy, który protonuje fosforan i glicerol, co jest niezbędne do oddzielenia go od innych lipidów glicerolowych. W dniu eksperymentu aktywować płytki TLC, wypiekając je w piekarniku w temperaturze 120 °C przez dwie i pół godziny.Po ochłodzeniu aktywowanych płytek do temperatury pokojowej, należy narysować ołówkiem linię prostą w poprzek płytki w miejscu startu chromatogramu. W dygestorium, przy użyciu rurki tigon podłączonej do regulatora butli z azotem, należy zapewnić strumień gazu azotowego, a następnie powoli nanieść trzykrotnie po 20 µL ekstraktu lipidowego z dolnej fazy chloroformowej na płytkę, używając pipety 20 µL z żółtym plastikowym końcem 200 µL pod powolnym strumieniem azotu. Stosowanie pipety 20 µL pozwala utrzymać średnicę plamy poniżej jednego centymetra.Każda płytka może pomieścić do 10 próbek podczas całkowitego wysychania plam lipidowych. W dygestorium należy przygotować rozwijający rozpuszczalnik składający się z acetonu, toluenu i wody. Nalać 80 ml rozpuszczalnika rozwijającego do szczelnej komory rozwijającej TLC i umieścić płytkę w zbiorniku.Zamknij szczelnie zbiornik, kierując koniec z próbką w dół. Dzięki zastosowaniu zacisku rozpuszczalnik będzie wznosić się w górę płyty, co spowoduje rozdzielenie lipidów. Czas wywoływania wynosi około 50 minut w temperaturze pokojowej.Gdy czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość jednego centymetra od górnej krawędzi płytki, ostrożnie wyjmij płytkę z komory i pozostaw do całkowitego wyschnięcia w dygestorium przez 10 minut. Lipidy rozdzielone metodą TLC można barwić odwracalnie, krótko eksponując je na działanie jodu w celu przeprowadzenia analizy ilościowej, lub barwić nieodwracalnie kwasem siarkowym lub alpha natal. Aby przeprowadzić barwienie nieodwracalne, należy poddać płytkę zwęglaniu kwasem siarkowym.Spryskać płytkę 50% kwasem siarkowym w wodzie za pomocą szklanego atomizera w komorze z wyciągiem i wypiec w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 15 minut. W przeciwnym razie, podczas barwienia glikolipidów $\alpha$-naftolem, spryskać płytkę 2,4% (masa/objętość) $\alpha$-naftolem w 10% (objętość/objętość) kwasie siarkowym i 80% (objętość/objętość) etanolu. Wypiec płytkę w temperaturze 120 stopni Celsjusza od trzech do pięciu minut, aż plamy glikolipidów zabarwią się na różowo lub fioletowo.Przeprowadź barwienie jodem. W dygestorium przygotuj zamknięty zbiornik do chromatografii warstwowej (LC) z kryształkami jodu w tacy na dnie zbiornika, co doprowadzi do nasycenia atmosfery oparami jodu. Umieść płytkę TLC w zbiorniku, aby wystawić ją na działanie jodu, aż lipidy staną się widoczne. Nie wystawiaj płytki na działanie jodu zbyt długo, ponieważ jod może tworzyć wiązania kowalencyjne.Zmodyfikuj wielonienasycone kwasy tłuszczowe. Za pomocą żyletki usuń krzemionkę otaczającą zidentyfikowane plamy lipidów z płytki TLC i zeskrob krzemionkę zawierającą lipidy. Używając lejka, przenieś proszek krzemionkowy do szklanej probówki z zakrętką wyłożoną teflonem.Do każdej próbki dodać za pomocą pipety szklanej 1 ml 1 M kwasu solnowodcowego w bezwodnym metanolu. Następnie, używając pipety o pojemności 200 µL z żółtym plastikowym końcem 200 µL, dodać do każdej próbki 100 µL kwasu pentadekanowego o stężeniu 50 µg/ml jako standard wewnętrzny. Należy również przygotować probówkę zawierającą wyłącznie kwas pentadekanowy w metanolowym kwasie solnym jako próbkę kontrolną.Szczelnie zamknąć probówki szklane zakrętkami z wyłożonym teflonem. Inkubować probówki szklane w kąpieli wodnej o temperaturze 80 °C przez 25 minut. Probówki muszą zostać uszczelnione w taki sposób, aby rozpuszczalnik nie wyparował po ich ostygnięciu.Dodaj 1 mL 0,9% chlorku sodu, a następnie 1 mL heksanu, po czym energicznie wymieszaj na wirówce i odwiruj próbki z prędkością 1000 ×g przez trzy minuty. Po wirowaniu usuń górną warstwę heksanu z próbki za pomocą pipety Pasteura w dygestorium i przelej ją do nowej szklanej probówki o wymiarach 13 × 100 mm. Odparuj heksan w wolnym strumieniu azotu, nie doprowadzając do całkowitego wysuszenia, a następnie rozpuść otrzymane metylowe estry kwasów tłuszczowych w 60 µL heksanu. Przenieś próbki do fiolek do autosamplera, a następnie szczelnie zakręć.Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas oraz w temperaturze -20 °C przez kilka dni przed rozpoczęciem analizy GLC. Należy upewnić się, że butle z helem, wodorem i powietrzem są odpowiednio napełnione, do zbiornika z rozpuszczalnikiem dodano wystarczającą ilość heksanu, a pojemnik na odpady jest pusty w celu przeprowadzenia rozdziału estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Do urządzenia należy podłączyć kolumnę DB 23.Umieść fiolki w autosamplerze. Uruchom oprogramowanie ChemStation dla GLC na komputerze systemowym. Ustaw temperaturę wtryskiwacza na 250 °C przy przepływie helu wynoszącym 48,6 ml/min oraz ciśnieniu 21,93 PSI.Stosunek podziału wynosi 30:1. Temperaturę pieca ustawiono początkowo na 140 °C na dwie minuty, a następnie zwiększano ją do 160 °C z szybkością 25 °C na minutę. Następnie ustawiono wzrost temperatury ze 160 °C do 250 °C z szybkością 8 °C na minutę, z utrzymaniem temperatury 250 °C przez cztery minuty, a następnie obniżeniem jej do 140 °C z szybkością 38 °C na minutę.Przy zastosowaniu tego profilu temperatury jeden bieg trwa około 21 minut. Temperatura detektora jonizacji płomieniowej wynosi 270 °C przy przepływie wodoru 30 ml/min. Przepływ powietrza wynosi 400 ml/min, a przepływ helu 30 ml/min.Wprowadź liczbę fiolek i nazwy próbek do tabeli sekwencji analizy. Ustaw wtryskiwacz 10 µL tak, aby wstrzykiwał 2 µL próbki z każdej fiolki. Gdy instrument będzie gotowy, uruchom sekwencję analizy.Tutaj przedstawiono przykłady barwienia lipidów rozdzielonych metodą TLC z czterotygodniowych siewek Arabidopsis. Lipidy barwione kwasem siarkowym ulegają zwęgleniu i pojawiają się jako brązowe plamki. Do barwienia glikolipidów, takich jak M-G-D-G-D-G-D-G i SQ dg, zaleca się stosowanie alpha natal.Glikolipidy barwione za pomocą alpha natal przybierają różowo-fioletowy kolor, podczas gdy inne lipidy polarne barwią się na żółto. Barwienie jodem jest odwracalne i nadaje lipidom żółtawy kolor, który znika po krótkim czasie w miarę odparowywania jodu. W skrócie, lipidy barwione jodem mogą być poddane analizie GLC, choć preferowane są lipidy niebarwione, aby ograniczyć rozkład lipidów, o ile proces ten zostanie przeprowadzony pomyślnie.Po przeprowadzeniu GLC zaobserwowane zostaną charakterystyczne sygnały reprezentujące różne metyloestry kwasów tłuszczowych; metyloestry kwasów tłuszczowych z krótszymi łańcuchami węglowymi i mniejszą liczbą wiązań podwójnych wykazują krótszy czas retencji przy użyciu kolumny DB 23. Profilowanie metyloestrów kwasów tłuszczowych jest czułym narzędziem do identyfikacji mutantów o zmienionym składzie lipidowym.Molowy stosunek trzech kwasów tłuszczowych w MGDG 18 jest zmniejszony u mutanta TGD four dash one w porównaniu z typem dzikim. Obliczono go poprzez podzielenie moli estrów metylowych kwasów tłuszczowych dla jednej klasy lipidów przez mole estrów metylowych kwasów tłuszczowych wszystkich klas lipidów. Obliczone w ten sposób stosunki molowe dla każdej klasy lipidów u typu dzikiego oraz mutanta mogą zostać tutaj porównane. Wyraźnie widać, że mutant TGD four dash one wykazuje zwiększone względne ilości MGDG i pg, ale zmniejszone ilości D-G-D-G-N-P-E. Chromatografia cienkowarstwowa umożliwia równoległe badanie wielu próbek i pozwala na wizualną ocenę głównych różnic w profilach lipidowych.Ponadto, analizując warstwę TLC, badają Państwo w rzeczywistości wiele enzymów i genów niezbędnych do syntezy lipidów, a co za tym idzie – profil lipidowy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat analizy składu lipidów polarnych za pomocą TOC i GOC. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Arabidopsis thaliana Profilowanie polarnych glicerolipidów za pomocą chromatografii na warstewce cienkowarstwowej (TLC) w połączeniu z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Kutykula roślinna to woskowa zewnętrzna powłoka roślin, której główną funkcją jest zapobieganie utracie wody, ale stanowi ona również istotną barierę przeciwko wnikaniu mikroorganizmów patogennych. W tym filmie prezentujemy analizę mutantów kutykuli roślinnej zidentyfikowanych za pomocą metod genetyki forward i reverse.

Wykorzystanie mutantów Arabidopsis eceriferum do badania biosyntezy kutykuli roślinnej

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Przedstawiono szybki i skuteczny protokół izolacji kropelek lipidów plastoglobul związanych z różnymi organizmami fotosyntetycznymi. Pomyślne przygotowanie wyizolowanych plastoglobul jest kluczowym pierwszym krokiem, który poprzedza szczegółowe badania molekularne, takie jak analizy proteomiczne i lipidomiczne.

Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii

Poznaj metodę profilowania polarnych glicerolipidów w Arabidopsis thaliana przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej i gazowo-cieczowej. Technika ta umożliwia ilościową analizę składu kwasów tłuszczowych.

Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik pospolity) Profilowanie polarnych glicerolipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w połączeniu z chromatografią gazowo-cieczową (GLC) (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Przeglądaj więcej filmów