Name: Przygotowanie i hodowla plastrów słuchowych pnia mózgu kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Naucz się przygotowywać plastry słuchowego pnia mózgu kurczaka do badań fizjologicznych in vitro i długoterminowych hodowli organotypowych. Ta metoda pozwala zachować funkcjonalność neuronalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Obecni i byli członkowie laboratorium Rubela.

1. Przygotowanie obszaru sekcyjnego
<ol>
<li>Stale nasycać sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) mieszaniną 95% O2 / 5% CO2 (pH w zakresie 7,2-7,4, osmolalność 295-310 mOsm/l).</li>
<li>Podczas napowietrzania ACSF oczyścić obszar roboczy 70% EtOH. Należy również oczyścić wibrotom oraz ostrze do cięcia. Ostrze przepłukać wodą destylowaną (dH2O).</li>
<li>Umieścić czystą podkładkę chłonną na obszarze sekcyjnym wraz z odpowiednimi narzędziami do sekcji.</li>
<li>Przykleić blok agaru (40 mg agarozy / mL, tj. 4%, w dH2O) do stolika komory tnącej wibrotomu*. 
*Wskazówka: przygotować agar przed sekcją. Gotowy agar przechowywać w przykrytej szalce Petriego w lodówce. Agarozę zakupiono od EMD Chemicals lub Invitrogen.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek 6-dołkowych z pożywką hodowlaną
<ol>
<li>W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza napełnić jedną studnię płytki 6-dołkowej na każde zwierzę 1 mL pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 35°C i 5% CO2.</li>
<li>Przygotować odpowiednią liczbę wkładów z membraną hodowlaną i umieścić je w komorze do późniejszego użycia.</li>
</ol>
3. Izolacja pnia słuchowego mózgu kurczaka
<ol>
<li>Umieść jajo pod jasnym źródłem światła, aby zlokalizować wypełnioną powietrzem przestrzeń pozbawioną zarodka (zazwyczaj znajduje się ona po szerokiej stronie jaja).</li>
<li>Rozbij szeroką stronę jaja, odsłaniając worek błoniowy. Wykonaj skalpelem nacięcie w worku błoniowym i delikatnie wyjmij głowę zarodka kurczaka.</li>
<li>Szybko oddziel głowę za pomocą nożyczek.</li>
<li>Umieść końcówkę żyletki nieco za oczami i pomiędzy nimi. Wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki w kierunku od rostralnego do kaudalnego, wywierając jedynie lekki nacisk*. 
*Wskazówka: siła nacisku zależy od wieku zarodka (im młodszy zarodek, tym mniejszy nacisk; im starszy, tym większy)</li>
<li>Delikatnie odsuń skórę i pióra, aby odsłonić czaszkę i zweryfikować nacięcie w linii środkowej.</li>
<li>Odseparuj część rostralną czaszki, przecinając ją żyletką. Ustaw ostrze za oczami i szybko przetnij całą czaszkę oraz tkankę mózgową*. 
*Wskazówka: do całkowitego usunięcia sekcji rostralnej wymagany jest silny nacisk.</li>
<li>Małymi nożyczkami wykonaj nacięcia od linii środkowej na zewnątrz w części kaudalnej czaszki, nieco przed widocznymi mięśniami szyi po obu stronach głowy. Odsuń czaszkę i tkankę, aby odsłonić móżdżek i mózg.</li>
<li>Delikatnie usuń pień mózgu z podstawy czaszki, przecinając przytwierdzoną tkankę małymi nożyczkami. Po przecięciu całej tkanki pień mózgu powinien swobodnie oddzielić się od czaszki*. 
*Wskazówka: może być konieczne obrócenie czaszki (mózgiem do dołu), aby przeciąć przytwierdzoną tkankę.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pnia mózgu do krojenia
<ol>
<li>Po wyjęciu z czaszki należy przytwierdzić pień mózgu za pomocą pinezek przez tectum opticum.</li>
<li>Całkowicie usunąć móżdżek, delikatnie odcinając nóżki móżdżku małymi nożyczkami, aby odsłonić dno czwartej komory.</li>
<li>Za pomocą pęsety usunąć wszelkie tkanki błoniaste i naczynia krwionośne z powierzchni pnia mózgu, a następnie wykonać cięcia boczne przez tectum opticum w celu wyizolowania pnia mózgu.</li>
<li>Nanieść niewielką ilość superkleju na stolik wibratomu przed blokiem agarowym (w stronę ostrza wibratomu).</li>
<li>Używając pęsety, delikatnie i szybko unieść pień mózgu w obrębie rdzenia kręgowego i umieścić tkankę na superkleju stroną rostralną dołu, a stroną grzbietową w stronę ostrza wibratomu*. 
*Wskazówka: nadmiar kleju należy wchłonąć ręcznikiem Kim-wipe lub papierem filtracyjnym przed kolejnym krokiem.</li>
<li>Delikatnie wlać natleniony ACSF na stolik wibratomu*. 
*Uwaga: ten ACSF może być stale napowietrzany mieszanką O2/CO2. Jednak napowietrzanie ACSF w tak małej objętości roztworu powoduje niepożądane przemieszczenia (i możliwe uszkodzenia) skrawków pnia mózgu. Jeśli procedura jest przeprowadzana szybko, wystarczy użyć ACSF wcześniej natlenionego podczas sekcji.</li>
<li>Ostrze wibratomu powinno być ustawione pod kątem 20-2°. Uruchomić wibratom (oscylację należy ustawić na maksymalną amplitudę) i przesunąć stolik w górę w stronę ostrza tak, aby górna część tkanki była równoległa do ostrza przed rozpoczęciem cięcia.</li>
<li>Szybko przesunąć ostrze w stronę tkanki pnia mózgu. Znacznie zwolnić bezpośrednio przed kontaktem ostrza z tkanką.</li>
<li>Rozpocząć cięcie tkanki przy najwolniejszym możliwym ruchu do przodu. Po przejściu przez cały przekrój koronarny tkanki, delikatnie odsunąć skrawek od ostrza za pomocą pędzla, kawałka szkła lub wypalanej pipety zakończonej gumową gruszką.</li>
<li>Obniżyć stolik o 30-500 μm i powtórzyć cięcie. Powtarzać czynność do czasu pojawienia się charakterystycznych struktur anatomicznych w tkance pnia mózgu. W tym momencie tkankę pnia mózgu zawierającą struktury słuchowe należy ciąć w grubości 20-10 μm, w zależności od wieku tkanki i potrzeb eksperymentalnych.</li>
<li>Uważnie przechowywać użyteczne skrawki w kolejności ich wycinania; tzn. 1szy skrawek reprezentuje najbardziej kaudalny obszar obwodu (przetwarzanie dźwięków o niskiej częstotliwości), a ostatni skrawek reprezentuje najbardziej rostralny przekrój (przetwarzanie wysokich częstotliwości)*. 
*Uwaga: w celu rozmieszczenia skrawków do hodowli należy przejść do sekcji 6. W kwestii przechowywania do fizjologii in-vitro patrz następna sekcja.</li>
</ol>
5. Przechowywanie skrawków do fizjologii in-vitro
<ol>
<li>W zależności od wieku zarodka kurczaka i grubości plastra, z każdego zwierzęcia powinno uzyskać się od 1 do 6 plastrów.</li>
<li>Ostrożnie umieść poszczególne plastry w komorze, używając wypalanej szklanej pipety wyposażonej na jednym końcu w gumową gruszkę. Komory powinny być ponumerowane. Umieść tylko jeden plaster w danej studzience, aby zachować specyficzność tonotopową (np. plaster najbardziejstyczny w komorze 1, a plaster najbardziej głowowy w ostatniej komorze). Komora powinna być wypełniona ACSF i stale napowietrzana mieszaniną 95% O2 / 5% CO2 (pH 7.4, osmolarity 295-310 mOsm/l).</li>
<li>Pozostaw plastry do wyrównania stanu równowagi, umieszczając komorę w ciepłej kąpieli (36° C) na około 1 godzinę.</li>
<li>Wyjmij komorę z ciepłej kąpieli i pozostaw do odpoczynku w temperaturze pokojowej przez około ½ godziny.</li>
<li>Po ½ godzinie w temperaturze pokojowej plastry można przenieść z komory przechowawczej do komory rejestracyjnej o objętości ~0.5 mL zamontowanej na mikroskopie do eksperymentów elektrofizjologicznych.</li>
<li>Plastry mogą być wykorzystywane przez maksymalnie ~6 godzin po wyjęciu z ciepłej kąpieli.</li>
</ol>
6. Przygotowanie organotypowych kultur plastrów 8
<ol>
<li>Bezpośrednio po procedurze cięcia (patrz Rozdział 6) przenieść skrawki wraz z ~50 μL ACSF, używając wypalanej szklanej pipety z gumową gruszką na jednym końcu, do płytki 48-dołkowej umieszczonej na lodzie. Jeden skrawek na dołek*. 
*Wskazówka: Skrawki powinny mieć grubość od 30 μm do 10 μm.</li>
<li>Po zebraniu skrawków przenieść płytkę 48-dołkową do komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Wyjąć z inkubatora płytkę 6-dołkową zawierającą pożywkę hodowlaną i przenieść ją do komory.</li>
<li>Tuż przed umieszczeniem skrawków z jednego mózgu na membranach, umieścić jeden z przygotowanych wkładów membranowych (patrz Rozdział 2.2) w dołku z pożywką hodowlaną. Upewnić się, że pod membraną nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Za pomocą szklanej pipety przenieść skrawek w kropli ACSF na membranę hodowlaną i usunąć nadmiar ACSF za pomocą mikropipety. Powtórzyć czynność dla pozostałych skrawków (maksymalnie 4 skrawki na membranę)*. 
*Wskazówka: Należy dopilnować, aby skrawki nie stykały się ze sobą i były umieszczone centralnie na membranie, tak aby nie dotykały jej krawędzi.</li>
<li>Powtórzyć procedurę dla tak wielu skrawków mózgu, jak jest to wymagane*. 
*Wskazówka: Jeśli hodowle będą manipulowane w późniejszym czasie, korzystne może być ograniczenie liczby membran do 3 na płytkę 6-dołkową, aby skrócić czas przebywania hodowli poza inkubatorem.</li>
<li>Wymieniać pożywkę hodowlaną 3 razy w tygodniu w komorze: usunąć starą pożywkę za pomocą rurki próżniowej ze sterylną końcówką, podczas gdy wkład membranowy jest uniesiony z dołka za pomocą pęsety. Dodać 1 mL świeżej pożywki hodowlanej dołka, gdy wkład membranowy jest nadal uniesiony. Po wymianie całej pożywki umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:

<img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig1.jpg" alt="Schemat obwodów neuronalnych oraz obrazy eksperymentalnych skrawków mózgu ilustrujące badanie połączeń synaptycznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Obwody binauralne pnia mózgu słuchowego kurczaka. (A) Schemat przekroju wieńcowego oraz (B-F) in vitro obrazy przekrojów pnia słuchowego kurczaka. Schemat w (A) przedstawia pobudzeniwe wejścia aferentne z nerwu słuchowego (AN) do jądra magnocelularnego (NM) i jądra angularis (NA). NM przesyła obustronne sygnały pobudzające do jądra laminaris (NL) po obu stronach pnia mózgu. Hamujące wejście z jądra oliwkowego górnego (SON) rzutuje na NA, NM i NL. in vitro przekroje w (B-F) to obrazy sekwencyjne (200 μm każdy) od części ogonowej (B) do części rostralnej (F) pnia mózgu słuchowego kurczaka, reprezentując kolejno obszary niskich i wysokich częstotliwości. Obwody te odpowiadają za kodowanie właściwości czasowych dźwięku, wykorzystywanych głównie do lokalizacji dźwięku. Pasek skali na (B) = 500 μm i dotyczy obrazów w (C-F). Strzałki w (D) wskazują na jednowarstwową warstwę ciał komórkowych NL.

<img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig2.jpg" alt="Technika patch-clamp; porównanie elektrofizjologiczne; wykres przebiegu napięcia; skala 50 mV/50 ms." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Hodowane neurony wykazują prawidłowe właściwości odpowiedzi fizjologicznej. Nałożone zmiany napięcia błony w odpowiedzi na hiperpolaryzujące i depolaryzujące skoki prądu z ostrych (A&amp;C) oraz hodowlaną tkanką po 4 (B) i 7 (D) dniach hodowli (DIC). Zwróć uwagę na zmiany w „ugięciu” (sag) napięcia hiperpolaryzacyjnego, silną redukcję prądu wychodzącego oraz generowanie pojedynczych potencjałów czynnościowych (AP), które rozwijają się w podobny sposób w metodzie hodowli skrawków, co w ekwiwalentnej wiekowo tkance świeżej. Wstrzyknięcia prądu trwały 20 ms, z krokami 50–100 pA. Potencjały spoczynkowe błony (RMP) wynosiły od -5 do -60 mV.

<img src="/files/ftp_upload/2527/2527fig3.jpg" alt="Obraz fluorescencyjny sieci neuronalnej; schemat neuronów; badanie obszaru mózgu; obraz z mikroskopii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Struktura anatomiczna w skrawkach hodowlanych. Lewa połowa pnia słuchowego mózgu kurczaka w stadium E1 po 7 dniach hodowli (DIC). Na zielono zaznaczono przeciwciało przeciwko białku MAP2 (białku związanemu z mikrotubulami 2), które występuje w somie i dendrytach. Grupa neuronów jądra magnocelularnego (NM) oraz ich aksony zostały zaznaczone na czerwono poprzez elektroporację barwnika Alexa dextran. Widoczne są zarówno NM, jak i linia komórkowa NL. Można dostrzec ipsilateralne zakończenia aksonów NM rzutujące na grzbietowe dendryty NL (białe groty strzałek).

<ol><li>Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+to+GABAergic+inhibition+dependent+on+increases+in+Kv1-type+K%2B+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents.</a> J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).</li>
<li>Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+membrane+conductance+improves+coincidence+detection+in+the+nucleus+laminaris+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken.</a> J Physiol. 540, 529-542 (2002).</li>
<li>Gao, H., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+intrinsic+and+synaptic+properties+of+chicken+nucleus+laminaris+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons.</a> Neuroscience. 153, 131-143 (2008).</li>
<li>Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+glutamatergic+synaptic+transmission+in+binaural+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).</li>
<li>Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+in+the+chick%3A+ontogeny+of+postsynaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses.</a> J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).</li>
<li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).</li>
<li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken%3A+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+underlying+the+firing+of+neurons+in+the+avian+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).</li>
<li>Monsivais, P., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accommodation+enhances+depolarizing+inhibition+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons.</a> J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).</li>
<li>Lu, T., Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+elimination+of+endbulb+synapses+in+the+chick+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus.</a> J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).</li>
<li>Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonotopic+specialization+of+auditory+coincidence+detection+in+nucleus+laminaris+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick.</a> J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).</li>
<li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+for+preservation+of+timing+in+central+auditory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways.</a> Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).</li>
<li>Trussell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+for+coding+timing+in+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons.</a> Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).</li>
<li>Sorensen, S. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+and+integrity+of+synaptic+input+regulates+dendrite+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure.</a> J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przez kilka dziesięcioleci metoda przygotowania ostrych skrawków pnia mózgu kurczaka była wykorzystywana do badania przetwarzania słuchowego 9, 10. Podejście to dostarczyło ogromnej ilości danych fizjologicznych in-vitro na temat przetwarzania binauralnego zarówno w stanach rozwojowych, jak i u osobników dojrzałych 4, 11, 12. Znaczną wiedzę posiada się na temat tego wysoce wyspecjalizowanego obwodu oraz roli, jaką każde jądro odgrywa w czasowym przetwarzaniu dźwięku 13, 14. W rze...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACSF dla kurcząt&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td>130 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M-10576</td><td>26 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9333</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8282</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>423525000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pożywka do hodowli kurzych (przechowywać w 4&amp;#x00B0;C)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>zaawansowane minimum essential medium (z NEAA, pirogronianem sodu w stężeniu 110 mg/l, bez L-glutaminianu)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>48.00%</td></tr><tr><td>Earl&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2888</td><td>24.00%</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>1.00%</td></tr><tr><td>Roztwór glukozy (200 g/l, filtrowany sterylnie)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td>2.75%</td></tr><tr><td>surowica konia (inaktywowana termicznie, filtrowana sterylnie)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138</td><td>24.00%</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna*</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0781</td><td>1,00 ml&lt;br/&gt;* = w razie potrzeby dodać do 100 ml pożywki w celu zapobiegania kontaminacji</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specjalistyczny sprzęt&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowej Millicell-CM</td><td>PICMORG50</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Klastry do hodowli komórkowych 6-dołkowych</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Forma Scientific CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Inkubator z płaszczem wodnym</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

Słuchowy pień mózgu kurczaka to dobrze ugruntowany model badawczy, szeroko wykorzystywany do analizy anatomii i fizjologii przetwarzania słuchowego w różnych okresach rozwoju 1-4, a także mechanizmów kodowania czasowego w ośrodkowym układzie nerwowym 5-7.
Przedstawiamy tutaj metodę przygotowania skrawków pnia słuchowego mózgu kurczaka, które mogą być wykorzystane w ostrych procedurach eksperymentalnych lub do hodowli skrawków organotypowych w celu długoterminowych manipulacji eksperymentalnych.
Słuchowy pień mózgu kurczaka składa się z jądra kątowego (nucleus angularis), jądra wielkokomórkowego (magnocellularis), jądra laminarnego (laminaris) oraz oliwki górnej. Jądra te odpowiadają za binauralne przetwarzanie dźwięku, a preparaty z pojedynczych przekrojów wieńcowych zachowują całe obwody neuronalne. W rezultacie organotypowe hodowle przekrojów mogą stwarzać możliwość manipulowania wieloma parametrami rozwojowymi, takimi jak aktywność synaptyczna, ekspresja komponentów presynaptycznych i postsynaptycznych, ekspresja czynników kontrolujących pobudliwość oraz różnicowa ekspresja genów.
To podejście może zostać wykorzystane do poszerzenia ogólnej wiedzy na temat rozwoju, doprecyzowania i dojrzewania obwodów neuronalnych.

Słuchowy pień mózgu kurczaka składa się z jąder odpowiedzialnych za binauralne przetwarzanie dźwięku. Pojedyncza preparacja w przekroju wieńcowym zachowuje cały układ obwodów, podczas gdy podejście z wykorzystaniem kultur komórkowych zapewnia unikalną możliwość badania rozwoju struktury neuronalnej i funkcji słuchowej na poziomach molekularnym, komórkowym i sieciowym.

Przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Pień mózgu kurczaka w zakresie słuchu jest uznanym modelem badawczym, który jest szeroko wykorzystywany do badania anatomii i fizjologii przetwarzania słuchowego na poziomie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka do wykorzystania w badaniach fizjologii całych komórek in vitro lub w długoterminowych kulturach organotypowych. Cel ten osiąga się najpierw poprzez usunięcie zarodka z jaja. Drugim krokiem procedury jest wypreparowanie mózgu z czaszki oraz wyizolowanie obszaru pnia mózgu słuchowego.Trzecim krokiem procedury jest przygotowanie skrawków obszaru pnia mózgu na urządzeniu viome. Ostatnim krokiem procedury jest umieszczenie skrawków pnia mózgu w komorze do rejestracji fizjologicznych lub na płytkach Millipore do hodowli. W rezultacie można uzyskać zdrowe skrawki słuchowej części pnia mózgu z embrionów kurczęt, co potwierdzają rejestracje fizjologiczne lub długoterminowe hodowle organotypowe.Witam, nazywam się Armand Sidle. Ta metoda może dostarczyć cennych informacji na temat rozwoju słuchu u ptaków. Może być ona również wykorzystana do badania topograficznej regeneracji aksonów, dynamiki dendrytów, a także właściwości wewnątrzkomórkowych i synaptycznych, co jest możliwe dzięki unikalnej strukturze i funkcji tego binauralnego obwodu słuchowego.Zazwyczaj osoby rozpoczynające naukę tej techniki n

preparation-and-culture-of-chicken-auditory-brainstem-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie i hodowla kawałków pnia mózgu kurczaka

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Ten film pokazuje proces przygotowywania wycinków mózgu w kształcie klina w warunkach laboratoryjnych. Za pomocą wibratomu wytwarzany jest plasterek w kształcie klina z mózgu myszy o różnej grubości. Ten wycinek zawiera korzeń nerwu słuchowego umieszczony na grubszym końcu, podczas gdy neurony związane ze słuchem znajdują się na cieńszym końcu.

Przygotowanie klinowych wycinków mózgu do wizualizacji neuronów słuchowych

Film pokazuje przygotowanie plastrów móżdżku. Przedstawia szczegółową procedurę izolowania móżdżku od zarodka pisklęcia. Plastry są następnie przygotowywane z wypreparowanego móżdżku za pomocą rozdrabniacza tkanek do dalszej analizy eksperymentalnej.

Uzyskiwanie plastrów móżdżku z embrionalnego mózgu pisklęcia

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Tutaj opisujemy technikę mikrodysekcji, po której następuje wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego do zwoju akustycznego wczesnych zarodków piskląt w celu selektywnego śledzenia włókien aksonu słuchowego w nerwie i tyłomózgowiu.

Selektywne śledzenie włókien słuchowych w ptasim embrionalnym nerwie przedsionkowo-ślimakowym

Oscylacje są podstawowymi właściwościami sieci i są modulowane przez choroby i leki. Badanie oscylacji wycinków mózgu pozwala na scharakteryzowanie izolowanych sieci w kontrolowanych warunkach. Zapewniono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu do wywoływania oscylacji γ CA1.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Zewnętrzna warstwa granulatu móżdżku jest miejscem największego wzmocnienia tranzytu w rozwijającym się mózgu. W tym miejscu przedstawiamy protokół ukierunkowany na modyfikację genetyczną tej warstwy w szczycie proliferacji przy użyciu elektroporacji ex vivo i hodowli plastrów móżdżku z embrionalnych zarodków piskląt dnia 14.

Ex vivo Hodowla wycinków móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Integracja różnych wejść synaptycznych do neuronów jest najlepiej mierzona w preparacie, który zachowuje wszystkie jądra presynaptyczne dla naturalnego wyczucia czasu i plastyczności obwodów, ale wycinki mózgu zazwyczaj zrywają wiele połączeń. Opracowaliśmy zmodyfikowany wycinek mózgu, aby naśladować aktywność obwodów in vivo, zachowując jednocześnie możliwość eksperymentowania in vitro.

Przygotowanie In Vitro Wedge Slice do naśladowania połączeń obwodów neuronalnych in vivo

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania niekoronalnych warstw słuchowych pnia mózgu zarodka kurczaka w celu zbadania właściwości tonotopowych i trajektorii rozwojowych w obrębie jednego wycinka pnia mózgu. Przekroje te obejmują przekroje strzałkowe, poziome i poziome/poprzeczne obejmujące większe obszary tonotopowe w pojedynczej płaszczyźnie przekroju niż tradycyjne sekcje koronalne.

Krojenie embrionalnego słuchowego pnia mózgu kurczaka w celu oceny gradientów tonotopowych i mikroobwodów

Naucz się przygotowywać plastry słuchowego pnia mózgu kurczaka do badań fizjologicznych in vitro i długoterminowych hodowli organotypowych. Ta metoda pozwala zachować funkcjonalność neuronalną.

Przygotowanie i hodowla skrawków pnia mózgu słuchowego kurczaka

Przeglądaj więcej filmów