Name: Gromadzenie zbiorów danych kalorymetrii izotermicznej miareczkowania o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę kalorymetrii izotermicznej miareczkowania do identyfikacji modelu wiązania ligandu z makrocząsteczką. Technika ta umożliwia wyznaczenie parametrów termodynamicznych w badaniach biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR), Narodową Radę Badań nad Nauką i Inżynierią (NSERC) oraz stypendium szkoleniowe CIHR (dla L.F.). Dziękujemy prof. Gerardowi D. Wrightowi (McMaster University, Kanada) za plazmid ekspresyjny AAC(6)-Ii.

1. Przygotowanie roztworów zapasowych
<ol>
	<li>Oczyść interesującą makrocząsteczkę. (W tym przypadku aminoglikozydową N-6'-acetylotransferazę-Ii (AAC6'-Ii) wyizolowano zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu.13)</li>
	<li>Przygotuj 4 litry buforu do dializy. (W tym przypadku zastosowano 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, MW 238,3 g/mol), zawierającego 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, MW 292,2), o pH 7,5.)</li>
	<li>Przeprowadź dializę białka. Próbkę AAC(6')-Ii (5 mL o stężeniu 400 μM) należy poddać dializie w buforze do dializy (3 x 1,3 L). Końcowy roztwór do dializy należy zachować do przepłukania urządzenia oraz do rozcieńczania próbek.</li>
	<li>Przefiltruj końcowy roztwór do dializy przez filtr celulozowy 0,45 μm i przechowuj w temperaturze 4°C. Będzie on dalej określany jako „bufor roboczy”.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór białka przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, który został uprzednio dokładnie przepłukany buforem roboczym. Zmierz końcowe stężenie białka, stosując standardowy test (Bradforda, Lowry'ego itp.) lub pomiar absorbancji UV. Przechowuj białko w sposób zapewniający maksymalną stabilność długoterminową. (W przypadku AAC(6')-Ii oznacza to przechowywanie w 4°C. AAC(6')-Ii traci aktywność po zamrożeniu i rozmrożeniu).</li>
	<li>Przygotuj 200 μL 25 mM roztworu stokowego acetylokoenzymu A (AcCoA, ligand, MW 809,57), rozpuszczając 4,0 mg w buforze roboczym. Zamroź w temperaturze -78°C do momentu użycia.</li>
	<li>Wszystkie próbki białka i ligandu muszą pochodzić z tych samych roztworów stokowych, aby zminimalizować przypadkowe wahania stężenia między próbkami. W analizie stosowany jest pojedynczy współczynnik korekcyjny dla stężenia białka w całym zbiorze danych variable-c.10</li>
</ol>
2. Przygotowywanie próbek do ITC
<ol>
	<li>Rozcieńcz roztwór enzymu do wartości c równej 64, tak aby objętość końcowa wynosiła 2 mL. (W przypadku AAC(6')-Ii odpowiada to stężeniu 192 μM).</li>
	<li>Szybko rozmroź roztwór zapasowy ligandu (AcCoA) w wodzie z lodem.</li>
	<li>Przygotuj 0,5 mL roztworu AcCoA o stężeniu 10-krotnie wyższym niż liczba miejsc wiążących w białku, w tym przypadku 4 mM, rozcieńczając 80 μL roztworu zapasowego AcCoA w 420 μL buforu roboczego. Przenieś go do probówki do napełniania pipety. Szybko przenieś roztwór zapasowy AcCoA z powrotem do temperatury -78°C.</li>
	<li>Odgazuj białko i roztwory w próżni przez 5 min w temperaturze o 1°C niższej od zamierzonej temperatury roboczej (19 °C).</li>
</ol>
3. Przygotowanie strzykawki14
<ol>
	<li>Wsuń strzykawkę do iniekcji przez uchwyt strzykawki, aż zamocowany wcześniej zacisk strzykawki znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt.</li>
	<li>Nasuń drugi zacisk strzykawki na strzykawkę do iniekcji, aż zostanie on mocno dociśnięty do podstawy uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręć zacisk za pomocą dołączonego klucza imbusowego 0.050" Ball Point Hex Drive.</li>
	<li>Umieść uchwyt strzykawki w uchwycie pipety.</li>
	<li>Ostrożnie wsuń wstrzykiwacz pipety do strzykawki do iniekcji. Upewnij się, że końcówka tłoka została wprowadzona bezpośrednio do otworu strzykawki. Po całkowitym wsunięciu przykręć pierścień blokujący uchwytu strzykawki do wstrzykiwacza pipety.</li>
</ol>
4. Załadunek celi z próbką14
<ol>
	<li>Przemyj celę pomiarową co najmniej 50 mL buforu do elektroforezy, a następnie usuń pozostałą ciecz za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 2,5 ml z długą igłą.</li>
	<li>Powoli pobierz do czystej i suchej strzykawki 2,5 ml z długą igłą co najmniej 1,8 ml roztworu próbki białka. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadź igłę do celi pomiarowej i delikatnie dotknij jej dna. Podnieś końcówkę nieco (~1 mm) i delikatnie wstrzyknij roztwór AAC(6')-Ii do celi, aż nad górną krawędzią celi pomiarowej pojawi się nadmiar cieczy.</li>
	<li>Powoli podnieś igłę o około 1 cm, upewniając się, że ciecz pozostaje w przelewie. Szybko wciągnij i wstrzyknij niewielką ilość roztworu (~0,25 ml), aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza uwięzione w celi pomiarowej.</li>
	<li>Usuń cały nadmiar roztworu z przelewu. Można to osiągnąć, delikatnie przesuwając igłę wzdłuż krawędzi przelewu do wnętrza celi pomiarowej. Końcówka strzykawki napotka krawędź, co wyznacza pożądaną wysokość roztworu roboczego. Usuń całą ciecz znajdującą się powyżej tej linii.</li>
</ol>
5. Napełnianie strzykawki iniekcyjnej i uruchomienie analizy14
<ol>
	<li>Przymocuj plastikową strzykawkę do załadunku do otworu napełniającego.</li>
	<li>Opuść końcówkę tłoka do górnej krawędzi otworu napełniającego.</li>
	<li>Umieść roztwór AcCoA w rurce do napełniania pipety w dolnej części uchwytu pipety. Końcówka strzykawki nie powinna dotykać dna rurki napełniającej.</li>
	<li>Powoli pobierz roztwór do strzykawki, aż niewielka ilość cieczy dostanie się do rurki strzykawki do załadunku.</li>
	<li>Zamknij otwór napełniający, opuszczając końcówkę tłoka, i kliknij przycisk Close Fill Port. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogły powstać podczas załadunku, wykonaj procedurę odpowietrzania i ponownego napełnienia, klikając przycisk Purge-&gt;Refill 3 razy.</li>
	<li>Wyjmij rurkę napełniającą z uchwytu pipety i delikatnie przetrzyj końcówkę strzykawki.</li>
	<li>Chwyć zespół pipety i ostrożnie wprowadź strzykawkę do celi próbkowej. Postępuj powoli, ponieważ strzykawka może się łatwo wygiąć, dlatego wymagana jest szczególna ostrożność. Upewnij się, że strzykawka jest całkowicie włożona, dociskając podstawę pierścienia blokującego.</li>
	<li>Ustaw żądaną temperaturę pomiaru (w tym przypadku 20°C) i wybierz moc referencyjną nieco wyższą niż maksymalny oczekiwany przepływ ciepła podczas wstrzyknięcia (w tym przypadku 20μcal/sec).</li>
	<li>Zaprogramuj żądane objętości wstrzykiwania i opóźnienia. (W tym przypadku zastosowano 28 wstrzyknięć. Pierwsze wstrzyknięcie miało objętość 2 μL z opóźnieniem 60 s. Wszystkie kolejne wstrzyknięcia miały objętość 10 μL z opóźnieniami 330 s).</li>
</ol>
6. Kolejne uruchomienia
<ol>
	<li>W kolejnych próbach powtórz kroki 2-5, zmniejszając stężenia AAC(6')-Ii i AcCoA odpowiednio 2, 4, 8, 16 i 32-krotnie.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Należy zastosować procedurę dopasowania, która globalnie dopasowuje wszystkie izotermy do jednego zestawu parametrów wiązania, zgodnie z wcześniejszym opisem10.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 1. Kształt izoterm powinien zmieniać się wraz z koncentracją. Bardziej gwałtownych przejść należy spodziewać się dla wyższych wartości c (tj. wyższych stężeń białka i liganda) (Rysunek 2). 
W przypadku AAC(6')-Ii model sekwencyjny dwumiejscowy zapewnia lepsze dopasowanie niż model opisujący dwa zestawy identycznych, niezależnych miejsc o regulowanej stechiometrii. 
<img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="Wyniki kalorymetrii izotermicznej z krzywą miareczkowania przedstawiającą zmianę ciepła w funkcji stosunku molowego, schemat analizy danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Izotermy otrzymane w wyniku miareczkowania AcCoA (3.86 mM) do AAC(6')-Ii (192 μM). A) Surowy zapis ITC. B) Zintegrowane wartości wykorzystane do wyznaczenia parametrów wiązania (kwadraty) z dopasowaniem sekwencyjnym dla 2 miejsc (-). 
<img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="Wykresy izotermicznej kalorymetrii miareczkowania pokazujące krzywe oddziaływań wiążących, analiza termodynamiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Izotermy ITC dla AcCoA miareczkowanego do AAC(6')-Ii przy różnych stężeniach. Dane eksperymentalne (otwarte kółka) dopasowano do modelu niezależnego z 2 zestawami miejsc (przerywana linia purpurowa) oraz sekwencyjnego modelu 2 miejsc (linia ciągła niebieska). Model sekwencyjny 2 miejsc wykazuje wyraźnie lepszą zgodność ogólną. Zastosowane stężenia dla AAC(6')-Ii i AcCoA wynosiły odpowiednio: A) 6 μM, 0,25 mM, B) 12 μM, 0,25 mM, C) 24 μM, 0,5 mM, D) 48 μM, 1,0 mM, E) 96 μM, 1,9 mM oraz F) 196 μM, 3,86 mM.

<ol><li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li>
<li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2004%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Okhrimenko, O. ksana, J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li>
<li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li>
<li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li>
<li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase%3A+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li>
<li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC%286%27%29-Ii+from+Enterococcus+faecium%3A+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li>
<li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li>
<li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ITC+Data+Analysis+in+Origin%22">ITC Data Analysis in Origin</a>. , 7 edn, MicroCal. (2004).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Ta analityczna część dopasowania zmiennego-c została wcześniej szczegółowo opisana10. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy praktyczne aspekty gromadzenia zbiorów danych zmiennego-c odpowiednich dla tego podejścia. Niezbędne jest, aby wszystkie próbki białka i ligandu pobierano z tych samych roztworów stokowych. Dlatego ważne jest, aby początkowo przygotować wystarczającą ilość roztworu stokowego do przeprowadzenia całej serii eksperymentów. Zapewnia to stały stosunek AAC(6')-Ii do AcCoA we wszystkich doświad...

<table><tbody><tr><td>Acetylcholina&amp;#8211;Enzym A (AcCoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td></td></tr><tr><td>kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy Spectra/Por 2</td><td>Spectrum Labs</td><td>132678</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 &amp;mu;m)</td><td>VWR international</td><td>281445-477</td><td></td></tr><tr><td>filtry membranowe z azotanu celulozy (0,45 &amp;mu;m)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7184-004</td><td></td></tr><tr><td>VP-ITC</td><td>MicroCal</td><td>VP-ITC</td><td>Mikrokalorymetr użyty do pomiarów</td></tr><tr><td>ThermoVac</td><td>MicroCal</td><td>USB Thermo Vac</td><td>Stacja odgazowywania z kontrolą temperatury</td></tr></tbody></table>

gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest powszechnie stosowana do wyznaczania parametrów termodynamicznych związanych z wiązaniem ligandu z makromolekułą gospodarza. ITC posiada pewne zalety w stosunku do powszechnych metod spektroskopowych stosowanych do badania oddziaływań gospodarz-ligand. Na przykład ciepło wydzielane lub pochłaniane podczas oddziaływania dwóch komponentów jest mierzone bezpośrednio i nie wymaga zastosowania żadnych zewnętrznych reporterów. W związku z tym entalpia wiązania oraz stała asocjacji (Ka) są uzyskiwane bezpośrednio z danych ITC i mogą być wykorzystane do obliczenia wkładu entropowego. Co więcej, kształt izotermy zależy od wartości c oraz zastosowanego modelu mechanistycznego. Wartość c definiuje się jako c = n[P]tKa, gdzie [P]t oznacza stężenie białka, a n liczbę miejsc wiązania ligandu w gospodarzu. W wielu przypadkach wiele miejsc wiązania danego ligandu nie jest równoważnych, a ITC pozwala na charakterystykę termodynamicznych parametrów wiązania dla każdego pojedynczego miejsca wiązania. Wymaga to jednak zastosowania poprawnego modelu wiązania. Wybór ten może być problematyczny, jeśli różne modele mogą dopasować te same dane eksperymentalne. Wykazaliśmy wcześniej, że problem ten można obejść, przeprowadzając eksperymenty przy kilku wartościach c. Uzyskane izotermy dla różnych wartości c są dopasowywane jednocześnie do oddzielnych modeli. Następnie poprawny model jest identyfikowany na podstawie jakości dopasowania w całym zbiorze danych o zmiennej wartości c. Proces ten zastosowano tutaj do enzymu wywołującego oporność na aminoglikozydy, aminoglikozydowej N-6'-acetylotransferazy-II (AAC(6')-II). Chociaż nasza metodologia jest możliwa do zastosowania w każdym układzie, konieczność stosowania tej strategii jest lepiej widoczna w układzie makromolekuła-ligand wykazującym allosterię lub kooperatywność, a także wtedy, gdy różne modele wiązania dają w zasadzie identyczne dopasowania do tych samych danych. Z naszej wiedzy takie układy nie są dostępne w sprzedaży. AAC(6')-II jest homodimerem zawierającym dwa miejsca aktywne, wykazującym kooperatywność między dwiema podjednostkami. Jednak dane ITC uzyskane przy pojedynczej wartości c można równie dobrze dopasować do co najmniej dwóch różnych modeli: niezależnego modelu dwóch zestawów miejsc (two-sets-of-sites independent model) oraz sekwencyjnego (kooperatywnego) modelu dwóch miejsc (two-site sequential model). Poprzez zmianę wartości c, zgodnie z powyższym opisem, ustalono, że poprawnym modelem wiązania dla AAC(6')-II jest sekwencyjny model wiązania dwóch miejsc. W niniejszej pracy opisujemy kroki, które należy podjąć podczas przeprowadzania eksperymentów ITC, aby uzyskać zbiory danych odpowiednie do analiz zmiennej wartości c.

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest powszechnie stosowana do wyznaczania parametrów termodynamicznych związanych z wiązaniem liganda z gospodarzem...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie odpowiedniego modelu fizycznego opisującego wiązanie makrocząsteczki z jej ligandem oraz wyznaczenie powiązanych parametrów termodynamicznych. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszym kroku roztworu zapasu makrocząsteczki za pomocą rozległej dializy. Następnie wybrany ligand rozpuszcza się w końcowym buforze dializacyjnym, a w drugim kroku wyznacza się stężenia wszystkich komponentów.Próbki makrocząsteczek i ligandów są starannie rozcieńczane do szeregu różnych stężeń. Następnie przeprowadza się serię eksperymentów izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) przy kilku stężeniach zarówno ligandu, jak i białka, aby w ostatnim kroku procedury uzyskać szereg izoterm ITC. Analiza globalna serii eksperymentów jest wykonywana przy użyciu różnych modeli fizycznych, a model wykazujący najlepszą zgodność ogólną zostaje uznany za prawidłowy.Dzisiaj zaprezentuję metodę, która może pomóc w odpowiedzi na pytania z zakresu biofizyki, takie jak sposób wiązania ligandów przez cząsteczki białek, oraz dostarczyć dokładnych pomiarów parametrów wiązania, takich jak entropia i stałe asocjacji. Przed rozpoczęciem protokołu należy oczyścić badane białko; makrocząsteczką wykorzystaną w tej demonstracji jest immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I lub a C six prime one I. Aby rozpocząć, należy przygotować cztery litry buforu do dializy i schłodzić go do 4 °C. Następnie należy przeprowadzić dializę niewielkiej objętości roztworu makrocząsteczki.W tym przypadku pięć mililitrów 400 µM AAC C six prime, one eye w 1,3 litra buforu do dializy w temperaturze 4 °C. Proces ten można przeprowadzić w pomieszczeniu chłodniczym lub w lodówce, wymieniając bufor na świeży co osiem godzin i wykonując dializę łącznie trzy razy. Należy zachować końcowy roztwór po dializie.Przefiltrować 750 mililitrów końcowego roztworu do dializy przez filtr celulozowy o wielkości porów 0,45 mikrona i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bufor ten, nazywany od teraz buforem roboczym, będzie wykorzystywany do płukania oraz jako rozcieńczalnik. W przypadku próbek, dokładnie wypłukać filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 mikrona buforem roboczym.Nanieś próbkę białka i przefiltruj ją. Ostrożnie zbierz próbkę do probówki stożkowej przed przechowywaniem roztworu białka, a następnie wyznacz stężenie białka za pomocą standardowego testu białkowego. W tym przypadku stężenie białka jest mierzone poprzez ABSORBENCJĘ przy 280 nanometrach, a następnie oblicza się stężenie enzymu.Wykorzystując współczynnik ekstynkcji wygenerowany przez serwer proteomiczny EXI, należy przechowywać białko w sposób zapewniający maksymalną stabilność długoterminową. AAC C six prime one eye musi być przechowywane w temperaturze 4 °C, ponieważ traci aktywność po zamrożeniu i rozmrożeniu. Następnie rozpuszczono ligand oraz bufor do prowadzenia analizy. W tej demonstracji 4 mg acetylo-koenzymu A rozpuszczono w 200 µL buforu do prowadzenia analizy, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 25 mM.Ligand ten można przechowywać w temperaturze -78 °C do momentu przygotowania próbek do ITC. Najpierw należy obliczyć stężenie enzymu, aby uzyskać wartość C równą 64, zgodnie z opisem w protokole pisemnym dla AAC 6'1. Odpowiada to stężeniu 192 µM. Należy przygotować 2 ml roztworu makrocząsteczki o tym stężeniu, rozcieńczając roztwór zapasowy przefiltrowanym buforem roboczym. Rozmrozić roztwór acetalu koenzymu A w kąpieli wodno-lodowej. Po rozmrożeniu roztworu acetalu koenzymu A należy go delikatnie wymieszać. Obliczyć stężenie roztworu liganda, mnożąc stężenie makrocząsteczki przez liczbę miejsc wiązania i przez 10.Przygotować roztwór acetylo-koenzymu A, dodając 80 µL roztworu stokowego 25 mM acetylo-koenzymu A do 420 µL buforu roboczego i wymieszając. Przenieść rozcieńczony roztwór acetylo-koenzymu A do probówki do napełniania pipety, a pozostałą część roztworu stokowego 25 mM odłożyć do przechowywania w temperaturze -78 °C. Odgazować roztwory AC6'1I oraz acetylo-koenzymu A pod próżnią przez pięć minut w temperaturze 19 °C, co stanowi 1 °C poniżej pożądanej temperatury roboczej eksperymentu.Aby przygotować strzykawkę do iniekcji, należy wsunąć ją do uchwytu strzykawki, aż zamontowany wcześniej zacisk strzykawki znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt. Nasunąć drugi zacisk strzykawki na strzykawkę do iniekcji, aż zostanie on mocno dociśnięty do spodu uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręcić zacisk za pomocą dołączonego imbusowego klucza z kulistym końcem o rozmiarze 0.05 inch.Następnie umieść uchwyt strzykawki w uchwycie pipety. Delikatnie wsuń wtryskiwacz pipety do strzykawki wstrzykującej i upewnij się, że końcówka tłoka została wprowadzona bezpośrednio do otworu strzykawki. Po całkowitym wsunięciu przykręć pierścień blokujący uchwytu strzykawki do wtryskiwacza pipety.Przed wprowadzeniem roztworu próbki białka A a C six prime one eye, należy użyć systemu płukania komórki dostarczonego z instrumentem, aby wypłukać komórkę próbkową co najmniej 50 milliliters buforu płuczącego. Pozostały bufor należy usunąć z komórki próbkowej poprzez aspirację za pomocą szklanej strzykawki 2.5 milliliter z długą igłą. Roztwory z odgazowującego podciśnienia należy usunąć za pomocą drugiej, czystej i suchej długiej igły.Strzykawka 2,5 ml. Ostrożnie pobierz do strzykawki co najmniej 1,8 ml próbki białka A a C six prime one eye. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.Po napełnieniu strzykawki próbką białka, wprowadź igłę do kuwety z próbką i delikatnie dotknij jej dna. Podnieś igłę o około jeden milimetr i powoli wstrzyknij próbkę do kuwety, aż nad jej górną krawędzią pojawi się nadmiar cieczy. Aby usunąć z kuwety uwięzione pęcherzyki powietrza, podnieś igłę o około jeden centymetr, upewniając się, że w przelewie nadal znajduje się roztwór, a następnie szybko odciągnij i wstrzyknij około 0,25 mililitra roztworu.Następnie ostrożnie przesuń igłę w górę wzdłuż krawędzi otworu przelewowego. W studience z próbką igła napotka krawędź. Odciągnij cały płyn znajdujący się powyżej tej krawędzi, ponieważ wyznacza ona pożądaną wysokość roztworu prowadzącego.Aby napełnić strzykawkę do wstrzykiwania, przymocuj plastikową strzykawkę do nadmuchiwania do portu napełniającego i opuść końcówkę tłoka do górnej krawędzi portu. Następnie umieść rurkę do napełniania pipety z roztworem ligandu DGA na dnie uchwytu pipety. Upewnij się, że końcówka strzykawki nie dotyka dna rurki napełniającej i powoli pobieraj roztwór do strzykawki, aż niewielka jego ilość dostanie się do rurki strzykawki ładującej.Następnie zamknij port napełniający, opuszczając końcówkę tłoka. Wykonuje się to poprzez kliknięcie przycisku zamykania portu napełniającego. Następnie należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione podczas ładowania.Opróżnij i napełnij układ, klikając przycisk purge refill. Powtórz proces opróżniania i napełniania łącznie trzy razy. Po zakończeniu procesu opróżniania i napełniania wyjmij rurkę napełniającą z uchwytu pipety i delikatnie przetrzyj końcówkę strzykawki papierowym ręcznikiem laboratoryjnym.Teraz opuść strzykawkę zespołu pipetującego do próbki. Należy zachować ostrożność i postępować powoli, ponieważ igła może łatwo się wygiąć. Upewnij się, że strzykawka została całkowicie włożona, naciskając podstawę pierścienia blokującego.Po zabezpieczeniu strzykawki ustaw pożądaną temperaturę pracy i wybierz moc odniesienia, która jest nieco większa niż maksymalny oczekiwany przepływ ciepła podczas wtrysku. W tym przykładzie jako temperaturę pracy i moc odniesienia zastosowano odpowiednio 20 °C oraz 20 µcal/s. Następnie zaprogramuj pożądane objętości wtrysku oraz opóźnienia.W tym przypadku wykonuje się 28 wstrzyknięć, z których pierwsze ma objętość 2 µL i opóźnienie wynoszące 62 jednostki, a kolejne wstrzyknięcia mają objętość 10 µL z opóźnieniami wynoszącymi 332 jednostki. Przedstawiony tutaj eksperyment stanowi podstawę do stworzenia zbioru danych dla pojedynczego stężenia w celu wygenerowania niezbędnych dodatkowych krzywych. Proces ten należy powtórzyć, zmniejszając stężenia makrocząsteczki i ligandu.Należy upewnić się, że wszystkie próbki makrocząsteczek i ligandów pochodzą z tego samego roztworu gęstego, aby zminimalizować błędy w stężeniach. Przedstawiony tutaj surowy zapis izotermicznej kalorymetrii miareczkowej uzyskano z miareczkowania 3,86 mM ligandu acetylo-koenzymu A do 192 µM mikrocząsteczki A A C six prime one.Zintegrowane wartości ciepła wykorzystano do wyznaczenia parametrów wiązania za pomocą dopasowania sekwencyjnego dla dwóch miejsc. Wykres ten przedstawia izotermy uzyskane metodą ITC dla różnych stężeń ACE Koenzymu A oraz AAC C six Prime One Eye. Dane eksperymentalne, reprezentowane przez otwarte okręgi, dopasowano zarówno do modelu dwóch niezależnych zestawów miejsc, jak i do modelu sekwencyjnego dla dwóch miejsc.Lepsza zgodność jest obserwowana w przypadku sekwencyjnego modelu dwumiejscowego. Stężenia białek wykorzystane w badaniu są określone w tekście towarzyszącym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie bardzo wysokiej precyzji przy rozcieńczaniu, ponieważ zmiana stężeń może mieć drastyczny wpływ na uzyskane wyniki.

collecting-variable-concentration-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zbieranie danych kalorymetrii izotermicznej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Ten film demonstruje różnicową kalorymetrię skaningową - technikę badania interakcji między biomolekułą a ligandem. Wiązanie aptameru DNA i liganda termolabilnego bada się poprzez zastosowanie powtarzających się cykli ogrzewania i chłodzenia do próbki oraz uzyskanie skanów do analizy termodynamicznej.

Różnicowa kalorymetria skaningowa do badania interakcji DNA aptamer-termolabilny ligand

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa mierzy przepływ ciepła uwalnianego lub pochłanianego w reakcjach chemicznych. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania katalizy enzymatycznej. W tym artykule ogólnie opisano protokół konfiguracji instrumentalnej, prowadzenia eksperymentu i analizy danych, który jest stosowany do charakterystyki enzymatycznej hydrolizy mocznika za pomocą ureazy fasoli jack.

Gorąca kataliza biologiczna: kalorymetria miareczkowa izotermiczna w celu scharakteryzowania reakcji enzymatycznych

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Ten artykuł skupia się na wykorzystaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do badania i ilościowego określania termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami i białkami.

Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Obecny protokół opisuje użycie izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) do analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji wiązania między aptamerem DNA a tetracykliną, w tym przygotowania próbek, uruchamiania wzorców i próbek oraz interpretacji uzyskanych danych.

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Technika pozyskiwania i pomiaru mediatorów biochemicznych w ranie chirurgicznej w określonych punktach czasowych.

Pozyskiwanie i pomiar mediatorów nocyceptywnych i zapalnych w ranach pooperacyjnych

Poznaj metodę kalorymetrii izotermicznej miareczkowania do identyfikacji modelu wiązania ligandu z makrocząsteczką. Technika ta umożliwia wyznaczenie parametrów termodynamicznych w badaniach biochemicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Przeglądaj więcej filmów