Gromadzenie zbiorów danych kalorymetrii izotermicznej miareczkowania o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie prawidłowego modelu fizycznego opisującego wiązanie makrocząsteczki z jej ligandem oraz określenie związanych z tym parametrów termodynamicznych. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw roztworu podstawowego makrocząsteczki poprzez intensywną dializę. Interesujący ligand rozpuszcza się następnie w końcowym buforze do dializy, a w drugim etapie określa się stężenia wszystkich składników.

Próbki makrocząsteczek i ligandów są starannie rozcieńczane do serii różnych stężeń. Następnie przeprowadza się serię izotermicznej kalorymetrii miareczkowej lub eksperymentów ITC przy kilku stężeniach zarówno liganda, jak i białka, aby wytworzyć serię izoterm ITC w końcowym etapie procedury. Globalna analiza serii eksperymentów jest przeprowadzana przy użyciu różnych modeli fizycznych, a model dający najlepszą ogólną zgodność jest identyfikowany jako poprawny.

Dzisiaj pokażę Ci metodę, która może pomóc odpowiedzieć na pytania biofizyczne, takie jak to, w jaki sposób cząsteczki białek wiążą swoje ligandy i może zapewnić dokładne pomiary parametrów wiązania, takich jak entropia, entropia i stałe asocjacyjne przed rozpoczęciem tego protokołu. Oczyść białko będące przedmiotem zainteresowania, makrocząsteczka użyta w tej demonstracji to immuno GLYCOSIDE N six prime, subtelna transferaza 1 I lub C sześć prime I.To rozpocząć, przygotować cztery litry buforu do dializy i schłodzić do czterech stopni Celsjusza. Następnie poddać dializę niewielkiej objętości roztworu makrocząsteczkowego.

W tym przypadku pięć mililitrów 400 mikromolowych AAC C sześć prime, jedno oko na 1,3 litra buforu dializacyjnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Można to zrobić w chłodni lub lodówce, wymieniać się ze świeżym buforem co osiem godzin i dializować łącznie trzy razy. Zachowaj końcowy roztwór do dializy.

Przefiltruj 750 mililitrów końcowego roztworu dializacyjnego przez filtr celulozowy o wielkości 0,45 mikrona i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ten bufor, określany obecnie jako bufor bieżący, będzie używany do płukania i jako rozcieńczalnik. W przypadku próbek należy dokładnie przepłukać filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrona z działającym buforem.

Nałożyć próbkę białka i przefiltrować. Delikatnie zebrać próbkę w stożkowej probówce przed przechowywaniem roztworu białkowego, określić stężenie białka za pomocą standardowego testu białkowego. W tym przypadku stężenie białka mierzy się za pomocą ABSORBENCJI na 280 nanometrach i oblicza się stężenie enzymu.

Korzystając ze współczynnika ekstynkcji wygenerowanego z serwera proteomicznego EXI, przechowuj białko w sposób maksymalizujący długoterminową stabilność. AAC C sześć prime one eye musi być przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ponieważ nie zachowuje aktywności po zamrożeniu i rozmrożeniu, a następnie rozpuszczeniu liganda i uruchomieniu buforu. W tej demonstracji cztery miligramy acetylokoenzymu A rozpuszczono w 200 mikrolitrach buforu do biegania, aby uzyskać 25-milimolowy roztwór podstawowy.

Ten ligand może być przechowywany w temperaturze minus 78 stopni Celsjusza, dopóki nie będzie gotowy do użycia do przygotowania próbek ITC, najpierw oblicz stężenie enzymu, aby uzyskać wartość C 64, jak opisano w pisemnym protokole dla AAC sześć pierwszych I. Odpowiada to stężeniu 192 mikromolowe. Przygotować dwumililitrowy roztwór makrocząsteczki o tym stężeniu, rozcieńczając roztwór podstawowy przefiltrowanym buforem do pracy FIA osadzają koenzym a rozmrażanie, roztwór koenzymu acetalowego w lodowatej kąpieli wodnej. Po rozmrożeniu roztworu koenzymu acetalowego delikatnie obliczyć stężenie roztworu liganda, mnożąc stężenie makrocząsteczki przez liczbę miejsc wiązania pomnożoną przez 10.

Przygotować roztwór koenzymu acetylowego, dodając 80 mikrolitrów 25-milimolowego koenzymu ACE, roztworu podstawowego do 420 mikrolitrów buforu bieżącego i mieszając. Przenieść rozcieńczony roztwór koenzymu acetylowego ACE do probówki do napełniania pipetą i zwrócić pozostały 25-milimolowy roztwór podstawowy do temperatury minus 78 stopni Celsjusza w celu przechowywania. Odgazowuje roztwory a C 6 i subtelnego koenzymu A pod próżnią przez pięć minut w temperaturze 19 stopni Celsjusza, czyli o jeden stopień Celsjusza poniżej pożądanej eksperymentalnej temperatury pracy.

Aby ustawić strzykawkę do wstrzykiwań, należy włożyć strzykawkę przez uchwyt strzykawki, aż zacisk strzykawki zamontowany na prem znajdzie się na tej samej wysokości co uchwyt. Przełożyć drugi zacisk strzykawki na strzykawkę do wstrzykiwań, aż zostanie mocno dociśnięty do dolnej części uchwytu strzykawki. Delikatnie dokręć zacisk za pomocą dostarczonego długopisu sześciokątnego 0,05 cala.

Następnie umieścić uchwyt strzykawki w uchwycie na pipety. Delikatnie wsunąć wstrzykiwacz pipety do strzykawki iniekcyjnej i upewnić się, że końcówka tłoka jest wprowadzana bezpośrednio do otworu strzykawki. Po całkowitym włożeniu wkręcić pierścień blokujący uchwytu strzykawki w wtryskiwacz do pipet.

Przed załadowaniem roztworu próbki białka AA C sześć pierwszych jednoocznych, należy użyć systemu mycia komórek dostarczonego z przyrządem, aby umyć komórkę próbki co najmniej 50 mililitrami buforu do biegania. Usunąć pozostały bufor z celi próbki przez aspirację za pomocą długiej igły 2,5 mililitrowej szklanej strzykawki. Usuń roztwory z próżni odgazowującej za pomocą drugiej, czystej, suchej, długiej igły.

Strzykawka o pojemności 2,5 mililitra. Ostrożnie pobrać do strzykawki co najmniej 1,8 mililitra próbki białka pierwszego oka A, A, C, 6 prime. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Po załadowaniu strzykawki próbką białka włóż igłę do komórki próbki i delikatnie dotknij dolnej części komórki. Podnieś igłę o około jeden milimetr i delikatnie wstrzyknij próbkę do celi, aż nadmiar płynu będzie widoczny nad górną częścią celi próbki. Aby przepłukać komórkę z uwięzionych pęcherzyków powietrza, podnieś igłę o około jeden centymetr, upewniając się, że roztwór pozostał w przelewie, a następnie szybko wyjmij i wstrzyknij około 0,25 mililitra roztworu.

Teraz delikatnie przesuń igłę w górę wzdłuż boku przelewu. W dołku próbki igła uderzy w półkę. Wyciągnij całą ciecz powyżej tej półki, ponieważ półka wskazuje żądaną wysokość dla biegnącego roztworu.

Aby załadować strzykawkę do wstrzykiwań, należy przymocować plastikową rurkę do napełniania otworu napełniania i opuścić końcówkę tłoka do górnej części otworu napełniania. Teraz umieść rurkę do napełniania pipet z roztworem liganda DGA na dnie uchwytu pipety. Sprawdzić, czy końcówka strzykawki nie dotyka dna rurki do napełniania i powoli wciągać roztwór do strzykawki, aż niewielka ilość dostanie się do rurki strzykawki.

Następnie zamknij port napełniania, opuszczając końcówkę tłoka. Odbywa się to poprzez kliknięcie przycisku zamykania portu napełniania. Następnie, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione podczas załadunku.

Wyczyść i uzupełnij, klikając przycisk wyczyść ponowne napełnienie. Wyczyść i napełnij w sumie trzy razy. Po zakończeniu procesu napełniania przedmuchiwania wyjmij rurkę napełniającą z uchwytu pipety i delikatnie przetrzyj końcówkę strzykawki bibułką laboratoryjną.

Teraz zanurzyć strzykawkę zespołu pipet w próbce. Cóż, zachowaj ostrożność i postępuj powoli, ponieważ igła może się łatwo zgiąć. Upewnić się, że strzykawka jest całkowicie włożona, naciskając podstawę pierścienia blokującego.

Po zabezpieczeniu strzykawki należy ustawić żądaną temperaturę pracy i wybrać moc odniesienia, która jest nieco większa niż oczekiwany maksymalny przepływ ciepła podczas wstrzykiwania. W tym przykładzie 20 stopni Celsjusza i 20 mikrokalorii na sekundę są używane odpowiednio jako temperatura pracy i moc referencyjna. Następnie zaprogramuj żądane objętości i opóźnienia wtrysku.

W tym przypadku stosuje się 28 wstrzyknięć, z których pierwsze ma objętość dwóch mikrolitrów i 62. opóźnienie, a kolejne wstrzyknięcia mają objętość 10 mikrolitrów z 332. opóźnieniem. Przedstawiony tutaj eksperyment stanowi podstawę do wygenerowania zestawu danych dla pojedynczego stężenia w celu wygenerowania dodatkowych niezbędnych krzywych. Powtórz ten proces ze zmniejszającymi się stężeniami makrocząsteczek i ligandów.

Upewnij się, że wszystkie próbki makrocząsteczek i ligandów pochodzą z tego samego roztworu podstawowego, aby zminimalizować błąd stężeń. Pokazano tutaj surowy ślad kalorymetrii miareczkowania izotermicznego otrzymany z miareczkowania 3,86 milimolowego ligandu acetylokoenzymu A do 192 mikromolów mikrocząsteczki. A A C sześć pierwszych jeden.

Wartości zintegrowane z okiem wykorzystano do określenia parametrów wiązania z sekwencyjnym dopasowaniem w dwóch miejscach. Ten wykres przedstawia izotermy generowane przez ITC różnych stężeń ACE, koenzymu A i AAC C sześć Prime One Eye. Dane eksperymentalne reprezentowane przez otwarte okręgi były dopasowane zarówno do modelu niezależnego od dwóch zestawów miejsc, jak i do modelu sekwencyjnego z dwoma ośrodkami.

Lepsza zgodność jest widoczna w przypadku modelu sekwencyjnego z dwiema lokalizacjami. Stosowane stężenia białka są określone w towarzyszącym im tekście. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby być bardzo dokładnym w rozcieńczeniu, ponieważ zmiana stężeń może mieć drastyczny wpływ na wyniki.