Name: bierne podawanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum i innym patogenom grzybowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę biernego podawania przeciwciał monoklonalnych przeciwko Histoplasma capsulatum w myszach C57BL/6. Technika ta umożliwia badanie roli odporności humoralnej w ochronie przed histoplazmozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Hodowla H. Capsulatum
<ol>
	<li>Przygotować komorę bezpieczeństwa biologicznego do pracy z grzybem, oczyszczając ją 10% roztworem wybielacza, a następnie naświetlając promieniami UV przez 20 min. H. capsulatum w fazie drożdżakowej wymaga praktyk poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL) II, natomiast forma strzępkowa wymaga BSLIII. W kolejnych krokach należy używać formy drożdżakowej.</li>
	<li>Następnie przygotować probówkę stożkową 15 ml z 5 ml PBS. Pobrać kolonię H. capsulatum (szczep Hc ATCC G217B) z płytki z agarem BHI z krwią [glukoza 10 g/L, cysteina 0,1 g/L, penicylina-streptomycyna 1% i owcze erytrocyty 50 ml/L (Colorado Serum Co., Colorado, USA)] hodowanej w 37°C lub pobrać aLIKwot z zamrożonego banku drożdżaków w -80°C i dodać do PBS. Komórki intensywnie wymieszać na wortexie i wirować przy 1100 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadosad, nie naruszając osadu, i dodać 10 mL świeżego PBS. Powtórzyć tę procedurę trzy razy. Resuspendować komórki w 5 mL PBS i przenieść do probówki stożkowej 50 mL.</li>
	<li>Aby rozbić agregaty komórkowe, przepuścić zawiesinę komórek drożdżaków przez igłę 26G1/2 za pomocą strzykawki 10 mL pięć razy w komorze bezpieczeństwa biologicznego (stosując ochronę twarzy). Aby wyizolować małe, jednorodnie wielkościowe drożdżaki, wirować komórki przy 55 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć górne 1 ml.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową do sterylnej kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml pożywki HAM F12 (GIBCO) uzupełnionej o 16 g/L glukozy, 1 g/L kwasu glutaminowego, 8,4 mg/L cystyny oraz 6 g/L kwasu glutaminowego, a następnie hodować komórki w 37°C przez 48 h w inkubatorze z wytrząsaniem przy 150 rpm.</li>
</ol>
2. Hodowla hybridom i oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych
<ol>
	<li>Przenieść wybrane hybridomy do pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej, 10% NCTC, 1% nieessentialnych aminokwasów oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Hodować komórki w kolbie do hodowli komórkowej (Becton Dickenson) przez 5-7 dni w temperaturze 37°C/5%CO2.</li>
	<li>Następnie odwirować pożywkę z prędkością 1100 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej i zebrać cały nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
	<li>W kolejnym kroku oczyścić nadsącz pozbawiony komórek przy użyciu żywicy białka A/G metodą FPLC.</li>
	<li>Stężenie mAb można następnie obliczyć za pomocą testu capture ELISA (1), stosując kontrolę izotypu IgG jako wzorzec (Rycina 1B).</li>
</ol>
3. Przygotowanie Histoplasma Capsulatum inokulum
<ol>
	<li>Odczekać 48 h Histoplasma capsulatum (szczep Hc kultura fazy drożdżowej (ATCC G217B) hodowana w medium HAM F-12.</li>
	<li>Wirować komórki przy 1100 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i dodać świeży PBS.</li>
	<li>Powtórz procedurę 3.2 trzykrotnie. </li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek drożdży 5 razy przez igłę 26G1/2 za pomocą strzykawki.</li>
	<li>Wirować zawiesinę z prędkością 55 x g przez 1 min, aby odwirować pozostałe skupiska komórek. Przenieść nadsącz zawierający zawiesinę pojedynczych komórek do nowej probówki.</li>
	<li>Policz komórki w zawiesinie jednokomórkowej przy użyciu hematocytometru.</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek, aby uzyskać 1,25 x 107 drożdże (przeżywalność) lub 5,0 x 106 (JCF, cytokiny i histologia) w zawiesinie &lt;50 μL (Rycina 2).</li>
</ol>
4. Podanie domięśniowe przeciwciał monoklonalnych (MAbs)
<ol>
	<li>Chwyć mysz za ogon i kark (Rys. 3A). Unieruchom mysz, chwytając ją za kark jak najbliżej uszu (należy ująć wystarczającą ilość skóry, aby mysz nie mogła obrócić głowy i ugryźć osoby ją trzymającej; Rysunek 3B i 3C).</li>
	<li>Stabilizuj ogon, delikatnie dociskając go małym palcem do wnętrza dłoni (Rysunek 3D).</li>
	<li>Przed wprowadzeniem igły przemyj miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem, a następnie wykonaj aspirację, aby sprawdzić, czy nie pojawi się krew przed podaniem preparatu.</li>
	<li>Używając igły 26G1/2, przebij skórę i mięśnie brzucha, aby wstrzyknąć roztwór mAb zawierający 500μg (PBS, przeciwciało kontrolne izotypowe lub testowane mAb, rozcieńczone w 1 mL PBS) do dolnej lewej lub dolnej prawej ćwiartki brzucha (jama otrzewnowa). Zwierzę powinno znajdować się w pozycji z głową skierowaną w dół; należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić przepony ani innych narządów wewnętrznych (Rysunek 3E).</li>
	<li>Przed wycofaniem igły odczekaj chwilę, aby zmniejszyć ryzyko wycieku preparatu.</li>
	<li>Odczekaj minimum dwie godziny przed przejściem do następnego kroku.</li>
</ol>
5. Znieczulenie myszy i infekcje donosowe
<ol>
	<li>Przygotować znieczulenie z ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 100 mg/Kg i 10 mg/Kg. Wykonać podanie dootrzewnowe PBS, przeciwciała kontrolnego izotypowego lub przeciwciała eksperymentalnego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Odczekać dwie godziny po wstrzyknięciu mAb przed znieczuleniem myszy i przystąpieniem do infekcji donosowej. 
	 
	Przygotować znieczulenie z ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 100 mg/Kg i 10 mg/Kg (7). 
	 </li>
	<li>W trakcie 2-godzinnego okresu oczekiwania przygotować inokulum Histoplasma capsulum zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym.</li>
	<li>Postępować zgodnie z punktami od 5.1 do 5.5. Ścisnąć pęsetą palec u nogi zwierzęcia, aby zweryfikować brak odruchu i potwierdzić działanie znieczulenia. Po znieczuleniu delikatnie zawiesić mysz za przednimi zębami na nylonowej lub bawełnianej sznurówce. Do zawieszenia zwierząt użyć dwóch statywów kolumnowych do przywiązania sznurków.</li>
	<li>Powoli podać około 50 μl inokulum do nozdrza za pomocą mikropipety, ściśle monitorując częstotliwość oddechów myszy. Pozostawić mysz w tej pozycji przez 2-5 min po infekcji donosowej, aby ułatwić osadzanie się drożdżaków w płucach zwierzęcia (Rysunek 3F).</li>
	<li>Po zainfekowaniu myszy utrzymywać ją w monitorowanym, ciepłym środowisku (temperatura od 25 do 37°C), w razie potrzeby ostrożnie stosując lampę grzewczą, aż do momentu wybudzenia z narkozy. Po przebudzeniu myszy przenieść ją do czystej klatki z dostępem ad libitum do pokarmu i wody. Klatki zostają zwrócone do naszego pomieszczenia dla zwierząt i przechowywane w czystym pomieszczeniu dla zwierząt (BLSI). </li>
</ol>
6. Badania przeżywalności
<ol>
	<li>Oceniaj stan kliniczny zwierząt zainfekowanych i pozornie zainfekowanych pod kątem tachypnoe, letargu, otępienia oraz utraty masy ciała. Zwierzęta powinny być sprawdzane dwa razy dziennie przez członków laboratorium i codziennie przez opiekunów zwierząt. </li>
	<li>W przypadku histoplazmozy mysiej, aż do okresu bliskiego śmierci, zazwyczaj nie występują żadne wyraźne objawy infekcji poza łagodnym wzrostem częstości oddychania. W stadium zaawansowanym, które zwykle następuje między 10. a 11. dniem, u myszy pojawia się znaczna tachypnoe oraz obniżona aktywność. Zazwyczaj zwierzęta szybko stają się konające i giną.</li>
	<li>Zwierzęta w stanie cierpienia należy odpowiednio uśpić za pomocą CO2 w dedykowanej komorze. Liczbę martwych zwierząt należy odnotowywać codziennie. </li>
</ol>
7. Badania CFU, histologia i badania cytokin
<ol>
	<li>Przygotować probówki stożkowe 15 ml zawierające 10 mL PBS dla każdego organu przeznaczonego do pobrania.</li>
	<li>Uśmiercić zwierzęta 7 i 14 dni po zakażeniu subletalną dawką inokulum (5.0 x 106), zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, a następnie niezwłocznie pobrać płuca, śledzionę i wątrobę.</li>
	<li>Odciąć fragment organu do oceny i utrwalić go w formalinie przez noc. Przekroje zostaną poddane badaniu mikroskopowemu w celu oceny patomorfologicznej.</li>
	<li>Przygotować probówki stożkowe 50 ml zawierające 5 mL PBS, wyposażone w sitka komórkowe 70 μm, dla każdego organu przeznaczonego do homogenizacji. Pozostałe części organów macerować oddzielnie w probówkach 50 mL, używając sterylnych tłoków strzykawek 5 mL.</li>
	<li>Następnie wykonać rozcieńczenia seryjne homogenatów organów (1:100, 1:1000 i 1:5000) i wysiać 100 μL każdego rozcieńczenia na płytki z agarem BHI-krew (2).</li>
	<li>Do homogenatów dodać tabletki z inhibitorem proteaz zgodnie z instrukcją producenta (Roche, Niemcy).</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37°C do 14 dni i zliczyć CFU.</li>
	<li>Homogenaty organów wirować przy 4000xg przez 10 min i zebrać nadsączniki, które zostaną wykorzystane w analizach cytokin przeprowadzonych standardowymi metodami zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
8. Ochrona przeciwko H. capsulatum za pomocą przeciwciał monoklonalnych zależy od specyficzności i izotypu przeciwciał
<ol>
	<li>Izotyp przeciwciał monoklonalnych (MAb) ma kluczowe znaczenie dla ochrony przed H. capsulatum, ponieważ myszy leczone przeciwciałami monoklonalnymi IgG1 lub IgG2a przeciwko Hsp60 wykazały znacznie dłuższe przeżycie w porównaniu z myszami kontrolnymi, które otrzymały przeciwciało monoklonalne IgG2b przeciwko Hsp60, przeciwciało kontrolne izotypowe lub PBS (Rycina 4).</li>
	<li>Ponadto, u myszy, które otrzymały ochronne przeciwciała monoklonalne, odnotowano znaczną redukcję liczby CFU w płucach i śledzionie w 7. dniu oraz spadek liczby drożdżaków w płucach o 2 i 2,5 jednostki logarytmicznej w 14. dniu (Rycina 5).</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Schemat procesu oczyszczania białka z użyciem wirówki, PBS, chromatografii powinowactwa i oczyszczonego mAb." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Wzrost H. capsulatum i hybridomów. (A) Przygotowanie hodowli płynnej HAM F-12 z pojedynczej kolonii uzyskanej z H. capsulatum hodowanego na płytkach z agarem BHI z krwią. (B) Wzrost hybridomów w kolbach do hodowli komórkowej i oczyszczanie mAb przy użyciu żywicy białka A/G z zastosowaniem chromatografii powinowactwa.
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Schemat wirowania z płukaniem w PBS; użycie strzykawki; proces pozwala na uzyskanie supernatantu do analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: H. capsulatum przygotowanie inokulum do zakażenia donosowego. Zawiesinę komórkową uzyskaną po rozbiciu agregatów H. capsulatum za pomocą strzykawki i wirowaniu zlicza się przy użyciu komory licznikowej. Stężenie komórek dostosowuje się do 1,25 x 107 (do doświadczeń nad przeżywalnością) lub 5 x 106 (do wyznaczania CFU, cytokin i badań histologicznych) w objętości &lt;50 μL.
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig3.jpg" alt="Techniki obchodzenia się ze zwierzętami, unieruchamianie myszy, schemat procedury laboratoryjnej, układ eksperymentalny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3: Obsługa myszy podczas podawania przeciwciał mAb. (A) Myszy podnosi się za ogon i (B i C) unieruchamia, chwytając za kark jak najbliżej uszu. (D) Ogon trzyma się między małym palcem a dłonią. (E) Roztwór mAb wstrzykuje się za pomocą igły 26G1/2. (F) Inokulum H. capsulatum podaje się donosowo, delikatnie wpipetowując zawiesinę komórkową do nozdrza.
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera przedstawiająca procent przeżywalności w ciągu 60 dni dla PBS, IgG1, IgG2a, IgG2b." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4: Przeciwciała monoklonalne (MAbs) przeciwko Hsp60 mogą zmieniać patogenezę histoplazmozy. Iniekcje i.p. z 500 μg IgG1 lub IgG2a mAbs na 2 h przed zakażeniem znacząco przedłużyły przeżywalność (p&lt;0.05 w porównaniu z grupami kontrolnymi), natomiast nie zrobiło tego mAb IgG2b.
<img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Wpływ przeciwciał monoklonalnych na ładunek bakteryjny; wykres słupkowy; porównanie logarytmicznej liczby JCF w tkankach w dniach 7–14." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5: Oznaczenia JCF w płucach w 7. i 14. dniu po subletalnym podaniu donosowym 5x106 drożdżaków Hc u myszy leczonych d.o. wybranymi przeciwciałami mAb przeciwko Hsp60 lub nieistotnym przeciwciałami mAb wykazały redukcję obciążenia grzybiczego u zwierząt leczonych przeciwciałami mAb IgG1 i IgG2a. Czarne słupki reprezentują JCF w 7. dniu, a białe słupki w 14. dniu po infekcji (*p&lt;0.001 w 7. dniu i **p&lt;0.001 w 14. dniu po infekcji).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół wykazuje, że przeciwciała monoklonalne (mAb) przeciwko H. capsulatum mogą modyfikować przebieg eksperymentalnej histoplazmozy u myszy. Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko antygenom powierzchni komórkowej patogenów mogą modyfikować złożoną dynamikę zachodzącą podczas interakcji między gospodarzem a patogenem. Niniejsze badanie potwierdza, że przeciwciała monoklonalne zapewniają ochronę w mysim modelu śmiertelnej histoplazmozy po wstrzyknięciu do otrzewnej, a także wskazuje ...

<table><tbody><tr><td>Kabineta bezpieczeństwa biologicznego (BSL2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 mL</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka HAM F-12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka laboratoryjna (vortex)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 mL</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła 26G1/2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby 250 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System FPLC (&lt;em&gt;Szybka chromatografia cieczowa białek&lt;/em&gt;)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik ELISA</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie (ketamina i ksylazyna)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statywy do kolumn</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sznurek nylonowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa grzewcza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sita komórkowe 70&amp;mu;m</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki z agarem BHI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko h. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Celem zastosowania tej metodologii jest 1) zwiększenie naszych możliwości ochrony osób za pomocą przeciwciał lub szczepionki w celu zapobiegania lub leczenia histoplazmozy wywoływanej przez grzyb Histoplasma capsulatum oraz 2) zbadanie roli czynników wirulencji jako celów terapeutycznych. Aby uzyskać przeciwciała monoklonalne (mAbs), immunizuje się myszy, ocenia odpowiedzi immunologiczne za pomocą systemu ELISA w fazie stałej opracowanego w naszym laboratorium, a następnie wybiera myszy o najlepszej odpowiedzi w celu izolacji splenocytów do fuzji z komórkami hybridoma. Myszy C57BL/6 są szeroko wykorzystywane do badania patogenezy H. capsulatum i stanowią najlepszy model do uzyskania wymaganych danych. W celu oceny roli mAbs w infekcji, myszom podaje się doprzewnowszykowo albo mAb przeciwko H. capsulatum, albo kontrolne mAb o zgodnym izotypie, a następnie zaraża się je drogą dożylną (i.v.), doshywną (i.p.) lub donosową (i.n.). W literaturze naukowej skuteczność mAbs w przypadku infekcji grzybiczych u myszy opiera się na śmiertelności jako punkcie końcowym, w połączeniu z oceną jednostek tworzących kolonie (CFU) w wcześniejszych punktach czasowych. Badania przeżywalności (czas do śmierci) są niezbędne, ponieważ najlepiej odzwierciedlają przebieg choroby u ludzi. Zatem skuteczność naszej interwencji nie zostałaby w sposób odpowiedni ustalona bez krzywych przeżywalności. Dotyczy to również ustalania skuteczności szczepionki lub testowania mutantów pod kątem wirulencji. W przypadku histoplazmozy myszy często przechodzą ze stanu wysokiej aktywności do śmierci w ciągu kilku godzin. Zdolność interwencji, takiej jak podanie mAb, może początkowo chronić zwierzę przed chorobą, ale choroba może nawrócić, co nie zostałoby zauważone w krótkotrwałych eksperymentach CFU. Oprócz testów przeżywalności i obciążenia grzybiczego, badamy odpowiedzi zapalne na infekcję (histologia, rekrutacja komórkowa, odpowiedzi cytokinowe). W eksperymentach dotyczących przeżywalności/czasu do śmierci, myszy są zarażane i monitorowane co najmniej dwa razy dziennie pod kątem objawów zachorowania. W celu oceny obciążenia grzybiczego, histopatologii i odpowiedzi cytokinowych, myszy są uśpione w różnych odstępach czasu po infekcji. Doświadczenia na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytutu Badań nad Zwierzętami Albert Einstein College of Medicine.

Do badania patogenezy Hc wykorzystano myszy C57BL/6, które stanowią najlepszy model. Badamy potencjalne korzyści z odporności humoralnej przeciwko temu grzybowi i wytworzyliśmy kilka przeciwciał monoklonalnych (mAbs) [przeciwko histonie H2B oraz białku szoku termicznego 60kDa], których skuteczność ochronną przetestowano po podaniu domięśniowym.

Pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Celem zastosowania tej metodologii jest 1) zwiększenie naszych możliwości ochrony osób za pomocą przeciwciał lub szczepionek w celu zapobiegania lub leczenia...

Ogólnym celem tej procedury jest zwiększenie możliwości ochrony osobników za pomocą przeciwciał lub szczepionek w celu zapobiegania histoplazmozie lub jej leczenia, a także zbadanie roli czynników wirulencji w patogenezie choroby. Osiąga się to najpierw poprzez izolację i charakterystykę przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko docelowym antygenom. Drugim krokiem procedury jest podanie wybranych przeciwciał monoklonalnych do jam brzusznych na dwie godziny przed infekcją donosowej.Aby umożliwić tym cząsteczkom rozprzestrzenienie się w całym organizmie, trzecim krokiem procedury jest znieczulenie myszy i zainfekowanie ich treścią szczepionkową podaną donosowo. Ostatnim etapem procedury jest monitorowanie stanu zdrowia zwierząt. Zwierzęta są poddawane eutanazji w różnych odstępach czasu w celu określenia miana grzybów i oceny odpowiedzi zapalnej lub są obserwowane pod kątem przeżywalności.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące wydłużenie przeżywalności oraz modyfikację odpowiedzi patologicznych w zajętych narządach u myszy zakażonych dawką letalną, poprzez podanie ochronnych przeciwciał monoklonalnych do jamy otrzewnej przed zakażeniem. Procedurę zaprezentuje ally emer, doktorant z dużym doświadczeniem w zakresie patogenezy grzybiczej i modeli zakażeń zwierzęcych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak leki przeciwgrzybicze, jest fakt, że przeciwciała monoklonalne są cząsteczkami o właściwościach, które działają poprzez angażowanie czynników potencjału gospodarza. Wizualna demonstracja tej metody w odpowiedzi na chorobę jest kluczowa.Ponieważ etapy podawania przeciwciał monoklonalnych i zakażania donosowego są trudne do opanowania i wymagają doświadczenia w obchodzeniu się ze zwierzętami, należy przygotować komorę bezpieczeństwa biologicznego poziomu drugiego do pracy z grzybem w formie drożdżakowej, czyszcząc ją wybielaczem, a następnie poddając naświetlaniu UV. Przygotuj probówkę stożkową o pojemności 15 ml zawierającą 5 ml PBS.Pobrać kolonię H caps AUM z aliquoty zapasu mrożonego w temperaturze -80 °C i dodać ją do PBS, a następnie wymieszać w wstrząsarzu typu vortex. Komórki energicznie wymieszać i wirować z prędkością 1100 ×g przez 10 minut. W temperaturze pokojowej ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu, i dodać co najmniej 10 mL świeżego PBS.Powtórz tę procedurę trzykrotnie po ostatnim płukaniu. Ponownie zawieś komórki w 5 mL PBS. Wszystkie etapy płukania należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Aby rozbić agregaty komórek, przepuść komórki drożdży przez igłę 26G o długości 1/2 cala za pomocą strzykawki 10 mL pięć razy, zbierając komórki drożdży do stożkowatej probówki o pojemności 50 mL.Aby wyizolować małe, jednorodne pod względem rozmiaru drożdże, należy odwirować komórki przy 55 ×g przez jedną minutę, a następnie usunąć górny 1 ml. Zawiesinę komórkową należy przenieść do sterylnej szklanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml pożywki HAM-F12, a następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem przy stężeniu CO2 typowym dla warunków pokojowych. Ta hodowla zostanie wykorzystana do przygotowania inokulum, a skuteczność przeciwciał monoklonalnych wygenerowanych w następnym kroku zostanie poddana ocenie.Hodotować wybrane hybrydomy w pożywce DMEM przez okres od pięciu do siedmiu dni inkubacji. Pozyskać przeciwciała poprzez zebranie całej pożywki z kolby hodowlanej, a następnie odwirować ją przy 1100 ×g przez 10 minut. Podobnie jak w przypadku komórek drożdżowych, przeciwciała można przemyć w temperaturze pokojowej.Zebrać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadów. Następnie oczyścić nadsącz wolny od komórek za pomocą żywicy białkowej AG metodą wychwytu F-P-L-C-A. Do obliczenia stężenia przeciwciał monoklonalnych w celu określenia ilości oczyszczonych przeciwciał do wstrzyknięcia wykorzystuje się Eli SA.Wewnątrzbrzusznie przeprowadź podanie przeciwciała kontrolnego izotypowego PBS lub przeciwciała eksperymentalnego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Odczekaj dwie godziny po wstrzyknięciu przeciwciała monoklonalnego przed znieczuleniem myszy i przystąpieniem do infekcji donosowej; w czasie oczekiwania przygotuj inokulum histoplasma caps, lotum zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym i zmontuj aparat sznurkowy do infekcji myszy, mocno wiążąc nylonowy lub bawełniany sznurek między dwoma statywami kolumnowymi, a następnie rozsunąłem statywy tak, aby sznurek był napięty.Zastosowano znieczulenie ketaminą w dawce 100 mg/kg oraz ksylazyną w dawce 10 mg/kg. Można to przygotować w tym momencie, gdy przeciwciała miały wystarczająco dużo czasu na rozprzestrzenienie się. Znieczul mysz i potwierdź sedację, sprawdzając brak reakcji na ucisk palca.Chwycić pęsetą. Delikatnie zawiesić mysz za przednie zęby na sznurku. Powoli podać za pomocą mikropipety około 50 µL inokulum do jam powietrznych.Należy ściśle monitorować częstotliwość oddechów myszy. Po infekcji donosowej pozwól myszy odpoczywać w tej pozycji od dwóch do pięciu minut, aby ułatwić osadzanie się drożdżaków w płucach zwierzęcia po przeprowadzeniu infekcji. Utrzymuj mysz w monitorowanym, ciepłym środowisku, w razie potrzeby ostrożnie stosując lampę grzewczą, aż do czasu wybudzenia z anestezji.Po przebudzeniu myszy należy przenieść ją do czystej klatki. Zapewniając dostęp do pokarmu i wody ad libido, należy przeprowadzić kliniczną ocenę zwierząt zainfekowanych oraz grupy kontrolnej. Pod kątem tachypnoe, letargu, optymalizacji stanu zdrowia oraz utraty masy ciała, zwierzęta powinny być sprawdzane dwa razy dziennie przez pracowników laboratorium oraz codziennie przez opiekunów zwierząt.W przypadku chronicznej histoplazmozy trwającej niemal do końca życia, zazwyczaj nie występują żadne wyraźne objawy infekcji poza lekkim wzrostem częstotliwości oddychania. W zaawansowanym stadium choroby myszy stają się znacznie chudsze i wykazują obniżoną aktywność. Zazwyczaj gwałtownie pogarsza się ich stan i dochodzi do zgonu.Zwierzęta w stanie krytycznym powinny zostać poddane eutanazji z użyciem dwutlenku węgla w dedykowanej komorze. Potwierdzenie zgonu poprzez brak reakcji odruchowej na uciśnięcie palca u stopy powinno być przeprowadzane codziennie w odniesieniu do zwierząt, które przestały oddychać.Przygotować probówki stożkowate o pojemności 15 ml zawierające 10 ml PBS dla każdego organu przeznaczonego do pobrania. Eutanazować zwierzęta zainfekowane subletalną dawką inokulum 5×10⁶. Komórki drożdżowe, zgodnie z wcześniejszym opisem, i natychmiast usunąć płuca, śledziony oraz wątroby; przygotować probówki stożkowate o pojemności 50 ml zawierające 5 ml PBS.Zamocuj szalkę Petriego z sitkami komórkowymi o rozmiarze oczek 70 µm dla każdego organu przeznaczonego do homogenizacji. Rozdrobnij każdy organ osobno za pomocą tłoków o objętości 5 mL i przenieś do probówek o pojemności 50 mL. Następnie wykonaj rozcieńczenia seryjne homogenatu organu w trzech stopniach: 1:100, 1:1000 i 1:5000, a następnie wysiej 100 µL na podłoże BHI.Płytki z agarem krwi inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z normalnym pokojowym stężeniem dwutlenku węgla przez maksymalnie 14 dni i dokonaj przeliczenia jednostek CFU przeciwciała monoklonalnego. Izotyp jest kluczowy w ochronie przeciwko hcaps Lotum, ponieważ myszy leczone przeciwciałami monoklonalnymi IgG1 lub IgG2 przeciwko HSP 60 wykazały znacznie wydłużony przeżycie w porównaniu z myszami kontrolnymi, które otrzymały przeciwciało monoklonalne IgG2B przeciwko HSP 60, izotypową kontrolę przeciwciała monoklonalnego lub PS. Ponadto u myszy, które otrzymały ochronne przeciwciała monoklonalne, odnotowano istotną redukcję liczby CFU w płucach i śledzionie w siódmej dobie oraz spadek liczby drożdżaków w płucach o 2 i 2,5 jednostki logarytmicznej w czternastej dobie. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak określanie ładunku grzybiczego w formie jednostek tworzących kolonie (CFU), analiza cytokin uczestniczących w infekcji oraz ocena topologii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład w celu zdefiniowania mechanizmu działania modyfikującego przebieg choroby przez przeciwciała podczas realizacji tej procedury.Ważne jest, aby podczas pracy z knockoutem przestrzegać zasad bezpieczeństwa biologicznego oraz stosować się do regulacji dotyczących opieki nad zwierzętami w przypadku zakażeń donosowych.

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pasywne podawanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum i innym grzybom chorobotwórczym

W tym filmie zaprezentowano indukcję oraz ocenę kliniczną modelu zwierzęcego stwardnienia rozsianego: przewlekłego nawracającego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u szczurów linii DA. Choroba, wywołana immunizacją szczurów emulsją zawierającą cały rdzeń kręgowy szczura i pełny adiuwant Freunda, wykazuje objawy kliniczne przypominające przebieg choroby u ludzi.

Indukcja i ocena kliniczna przewlekłej postaci nawrotowej eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Ten film demonstruje skuteczną technikę homogenizacji w celu wygenerowania emulsji antygenowo-adiuwantowej do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) w modelu mysim. Emulsja zawiera autoantygen — glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG) — w fazie wodnej, otoczoną ciągłą fazą olejową zawierającą inaktywowane bakterie chorobotwórcze. Emulsja zapewnia przedłużone uwalnianie antygenów w celu przedłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Przygotowanie emulsji z adiuwantem antygenowym w celu wywołania autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest uznanym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem 35-55 (MOG) glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) (MOG35-55), co powoduje narastający porażenie wiotkie spowodowane przez autoreaktywne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Omówione zostaną protokoły indukcji i monitorowania choroby.

Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Tutaj prezentujemy alternatywny protokół aktywnego wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy C57BL/6, przy użyciu immunogennej epitopowej oligodendrocytów glikoproteiny mielinowej (MOG)35-55 zawieszonej w niekompletnym adiuwancie Freunda zawierającym zabity termicznie Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

Działanie adiuwantowe Mycobacterium paratuberculosis w zwiększaniu immunogenności autoantygenów podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Poznaj metodę biernego podawania przeciwciał monoklonalnych przeciwko Histoplasma capsulatum w myszach C57BL/6. Technika ta umożliwia badanie roli odporności humoralnej w ochronie przed histoplazmozą.

Pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Przeglądaj więcej filmów