Name: Wykorzystanie hybrydyzacji in situ Whole Mount do połączenia biologii molekularnej i organizmów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Poznaj technikę hybrydyzacji in situ na całych preparatach (WISH) do badania ekspresji genów w zarodkach Danio rerio. Metoda łączy biologię molekularną z organizmową w edukacji akademickiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Katedrze Biologii na Uniwersytecie w Syracuse oraz dr Marilyn Kerr za ich wkład w organizację kursu Biologii Porównawczej Kręgowców. Laboratorium Albertsona jest wspierane przez grant R21DE019223 z National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research, a także przez grant R01AG031922 z National Institutes of Health/National Institute on Aging.

1. Transformacja plazmidowa docelowego cDNA
Część I: Transformacja plazmidu
(Wymagany czas: 3 godziny plus inkubacja przez noc)
<ol>
<li>Podgrzej pożywkę SOC w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C (500 μL na reakcję)</li>
<li>Rozmroź kompetentne komórki na lodzie</li>
<li>Dodaj 1 μL plazmidu do 25 μL kompetentnych komórek</li>
<li>Pozostaw na lodzie przez 20 minut</li>
<li>Przeprowadź szok termiczny komórek w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C przez 45 sekund</li>
<li>Natychmiast umieść komórki na lodzie na 2 minuty</li>
<li>Dodaj 500 μL pożywki o temperaturze 42°C do każdej probówki z komórkami</li>
<li>Inkubuj z wytrząsaniem w temperaturze 37°C przez 2 godziny przy prędkości 255 obrotów na minutę (rpm)</li>
<li>Wysiej 75 μL mieszaniny transformacyjnej na płytki z agarem Luria Bertani (LB)</li>
<li>Inkubuj płytki w pozycji odwróconej w temperaturze 37°C przez noc</li>
</ol>
Część II: Hodowla E. coli
(Wymagany czas: 15 minut plus inkubacja przez noc)
<ol>
<li>Do każdej probówki hodowlanej odmierzyć 3 mL bulionu LB oraz 3 μL ampicyliny o stężeniu 50 mg/mL</li>
<li>Z pobrać jedną kolonię bakterii z płytki agarowej i przenieść ją do każdej probówki hodowlanej</li>
<li>Inkubować probówki hodowlane w temperaturze 37°C przy 255 rpm przez noc</li>
</ol>
Część III: Izolacja plazmidów
(Czas wymagany: 1,5 godziny)
<ol>
<li>Wyizolować plazmid z kultur nocnych, korzystając z zestawu 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Catalog #2300000)</li>
<li>Aby sprawdzić obecność przygotowanego plazmidu, należy poddać DNA wyeluowanego z zestawu elektroforezie na żelu 1% Tris-Acetate-EDTA (TAE) barwionym bromkiem etydyny</li>
</ol>
2. Synteza sondy RNA znakowanej DIG do hybrydyzacji in situ
Część I: Linearyzacja plazmidu
(Wymagany czas: 2,5 godziny)
<ol>
<li>W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL połączyć: 
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Przygotowany plazmid</td >
 <td >20 mL</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Enzym restrykcyjny*</td >
 <td >2 mL</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Bufor**</td >
 <td >10 mL</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >10X Bovine Serum Albumin (BSA)</td >
 <td >10 mL</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Woda DEPC (Diethyl Pyrocarbonate)</td >
 <td >58 mL</td >
 </tr >
 <tr >
 <td > </td >
 <td >100 mL</td >
 </tr >
 </tbody >
 </table >
</li >
<li >Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 godziny 
*Zależnie od plazmidu 
**Zależnie od enzymu restrykcyjnego</li >
</ol>
Część II: Transkrypcja
(Wymagany czas: 3 godziny)
<ol>
<li>W probówce do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL połączyć: 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Plazmid liniowy</td>
 <td>4 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor do transkrypcji 10X**</td>
 <td>4 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanina znakująca Digoxigenin</td>
 <td>4 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polimeraza*</td>
 <td>2 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inhibitor RNazy</td>
 <td>2 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda DEPC</td> 
 <td>24 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>40 mL</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę</li>
<li>Dodać 2 μL polimerazy*</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę</li>
<li>Dodać 2 μL DNazy</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 20 minut 
*Zależne od plazmidu 
**Zależne od polimerazy</li>
</ol>
Część III: Wytrącanie
(Wymagany czas: 5 minut oraz od 2 godzin do inkubacji nocnej, 1 godzina na wirowanie i ponowne zawieszenie)
<ol>
<li>Dodać 4 μL 0.2M EDTA</li>
<li>Dodać 5 μL 4M chlorku litu</li>
<li>Dodać 150 μL lodowatego 100% etanolu</li>
<li>Inkubować w temperaturze -80°C od 2 godzin do całej nocy</li>
<li>Wirować przy 14 000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie odlać nadsącz</li>
<li>Suszyć osad przez 7 minut</li>
<li>Resuspendować w 20 μL wody z DEPC</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 5 minut</li>
</ol>
Część IV: Frakcjonowanie – przeprowadzić tylko w przypadku, gdy rozmiar sondy przekracza 0.6 kb
(Wymagany czas: Zależny od rozmiaru sondy, zazwyczaj nie więcej niż 20 minut)
<ol>
<li>W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL połączyć: 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Sonda RNA</td>
 <td>20 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda z DEPC</td>
 <td>12 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wodorowęglan sodu</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Węglan sodu</td>
 <td>4 mL </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>40 mL </td>
 </tr>
</tbody>
</table>
</li>
<li>Inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 60°C. Czas inkubacji wyznaczyć na podstawie równania: 
Czas (min.) = (początkowe kb - pożądane kb) / (.11 x początkowe kb x pożądane kb) 
Średnia pożądana wielkość = 0.6 kb</li>
</ol>
Część V: Wytrącanie końcowe
(Wymagany czas: 5 minut plus od 2 godzin do inkubacji przez noc, 1 godzina na wirowanie i ponowne zawieszenie, 1 godzina na elektroforezę w żelu)
<ol>
<li>Dodać 40 μL wody DEPC</li>
<li>Dodać 8 μL octanu sodu</li>
<li>Dodać 1,04 μL octu lodowatego</li>
<li>Dodać 240 μL lodowatego 100% etanolu</li>
<li>Inkubować w temperaturze -80°C od 2 godzin do całej nocy</li>
<li>Wirować przy 14 000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie odlać nadsącz</li>
<li>Osuszyć osad przez 7 minut</li>
<li>Resuspender w 20 μL wody DEPC</li>
<li>Wymieszać za pomocą vortexa</li>
<li>Aby sprawdzić obecność sondy rybonukleinowej, poddać zresuspenderowany roztwór elektroforezie na żelu 1% TAE barwionym bromkiem etydyny</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja in situ całego preparatu
Część I: Fixacja embrionów i trawienie proteinazą K
(Wymagany czas: fiksacja przez noc, a następnego dnia 4 godziny na przechowywanie, 2,5 godziny od momentu przechowywania do Części II)
<ol>
<li>Zebrać zarodki danio pręgowanego o określonym stadium rozwoju i utrwalić w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc w temperaturze 4°C</li>
<li>Przemyć utrwalone zarodki 3 razy przez 10 minut w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym zawierającym 0,1% Tween-20 (PBSt)</li>
<li>Aby zapewnić ekspozycję zarodków na odczynniki eksperymentalne, w razie potrzeby przeprowadzić ręczne usuwanie otoczek (dechorionację) za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami</li>
<li>Odwodnić zarodki, przemywając je w serii roztworów metanolu w PBSt o stężeniach 25% i 50% przez jedną godzinę dla każdego etapu, a następnie przechowywać w 100% metanolu w temperaturze -20°C</li>
<li>Przed użyciem nawodnić zarodki w PBSt, przemywając je w 50% (2 razy) i 25% (1 raz) metanolu w PBSt przez 10 minut na każdy etap. Na koniec przemyć 2 razy po 10 minut w 100% PBSt. Dokładny czas przemywania PBSt/metanolem nie jest krytyczny</li>
<li>Jeśli jest to konieczne, odbarwić zarodki w 10% roztworze nadtlenku wodoru w PBSt w celu usunięcia ciemnych pigmentów. Zarodki powinny inkubować w roztworze nadtlenku wodoru przez 10-20 minut, zależnie od wieku zarodka; nakrętka probówki do mikrocentryfugi powinna pozostać otwarta, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia powietrza</li>
<li>Przetrawić zarodki za pomocą 50 mg/mL Proteinazy K rozcieńczonej 1:5000 w PBSt przez 3-15 minut, zależnie od wieku zarodka</li>
<li>Ponownie utrwalić zarodki w 4% PFA przez 30 minut, a następnie przemyć 3 razy w PBSt po 5 minut każdy</li>
</ol>
Część II: Hybrydyzacja sond ryboprobowych
(Wymagany czas: 3 godziny oraz noc na hybrydyzację, 1,5 godziny następnego dnia do Części III)
<ol start="9">
<li>Przeprowadzić prehybrydyzację embrionów w roztworze do prehybrydyzacji (PHS) w podgrzanej do 70°C łaźni wodnej przez 2-3 godziny</li>
<li>Usunąć PHS, dodać 0,5 mL roztworu do hybrydyzacji oraz 1,5 μL wcześniej zsyntetyzowanych sond ryboprobowych znakowanych digoksigeniną i inkubować w 70°C przez noc. Temperatura może wahać się o kilka stopni w zależności od celu ryboproby</li>
<li>Następnego dnia przemyć embriony w 70°C w stopniowanych roztworach PHS o stężeniach 75%, 50% i 25% w 2X SSC (saline-sodium citrate) przez 10 minut każdy, a następnie przemyć w 0,2X SSC przez 30 minut w 68°C</li>
<li>Przemyć w buforze kwasu maleinowego (MAB) 2 razy po 10 minut w temperaturze pokojowej</li>
</ol>
Część III: Inkubacja z przeciwciałem przeciwko digoksigeninie (α-DIG)
(Wymagany czas: 3 godziny oraz blokowanie przez noc, 2,5 godziny następnego dnia do Części IV)
<ol start="13">
<li>Przenieś embriony na płytkę 12-dołkową</li>
<li>Przeprowadź wstępne blokowanie embrionów w 1-2 mL roztworu blokującego przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej</li>
<li>Jednocześnie wykonaj wstępne blokowanie przeciwciała, przygotowując drugą porcję roztworu blokującego i rozcieńczając w nim przeciwciało anty-digoksygeninę w stosunku 1:2000</li>
<li>Usuń roztwór do wstępnego blokowania i dodaj 1-2 mL wstępnie zablokowanego roztworu α-DIG, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4°C</li>
<li>Następnego dnia przemyj embriony w MAB. Pozostaw embriony do inkubacji w MAB na 5 minut, a następnie wymieniaj bufor i inkubuj w dwóch 10-minutowych, jednym 30-minutowym i jednym 60-minutowym odstępie czasu. Dokładne zachowanie czasu nie jest konieczne</li>
<li>Przemyj embriony 3 razy przez 5 minut każdy w buforze do fosfatazy alkalicznej (AP)</li>
</ol>
Część IV: Barwienie i końcowe przetwarzanie
(Wymagany czas: od 1 godziny do całej nocy na barwienie, w zależności od użytej sondy ryboprobowej, 4 godziny do rozpoczęcia przemywania glicerolem, 6-10 godzin na każde przemywanie glicerolem, można przechowywać w glicerolu)
<ol start="19">
<li>Do zarodków dodać 1-2 mL roztworu barwiącego, owinąć płytkę folią i sprawdzać stopień zabarwienia w regularnych odstępach czasu (około co 20 minut), aż do uzyskania wystarczającego natężenia barwy</li>
<li>Zarodki przemyć 2 razy w PBSt przez 5 minut każdy, aby zatrzymać reakcję barwienia</li>
<li>Zarodki odwodnić, przemywając je przez 10 minut w 25% (1 raz) i 50% (2 razy) metanolu w PBSt, a następnie w 100% metanolu, aby usunąć zabarwienie tła</li>
<li>Inkubować zarodki w 100% metanolu przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej</li>
<li>Rehydratować w PBSt, przemywając przez 10 minut w 50% (2 razy) i 25% (1 raz) metanolu w PBSt, a następnie przemyć 2 razy w 100% PBSt</li>
<li>Przenieść zabarwione zarodki do 80% roztworu glicerolu w PBSt, stosując szereg przemywań o stopniowanym stężeniu, i przechowywać w 4°C.</li>
</ol>
Przepisy:
<ul>
<li>Szybkie płytki agarowe LB – 10 g agaru LB + 250 mL wody destylowanej, autoklawowanie, po ostygnięciu do temperatury bezpiecznej w dotyku dodać 250 μL ampicyliny, wlać 15-20 mL ciepłego roztworu do każdej szalki Petriego, pozostawić agar do stężenia</li>
<li>Pożywka płynna LB – 12,5 g pożywki LB + 200 mL wody destylowanej, autoklawowanie, pozostawić do ostygnięcia przed użyciem</li>
<li>Żel 1% TAE – 0,4 g agarozy, 40 mL 1X TAE, 2 μL bromku etydyny; nanieść 7 μL plazmidu (Transformacja plazmidowa docelowego cDNA) lub 3 μL ryboprody i 4 μL wody DEPC (Synteza sondy RNA znakowanej DIG In situ) + 1 μL barwnika do ładowania, 5 μL drabinki DNA</li>
<li>Roztwór do prehybrydyzacji – 50% formamid, 5X SSC, 9,2mM kwasu cytrynowego, 1% Tween-20</li>
<li>Roztwór do hybrydyzacji – roztwór do prehybrydyzacji oraz 500 μg/mL tRNA i 50 μg/mL heparyny</li>
<li>MAB – 100mM kwasu maleinowego, 150mM NaCl, 0,2M NaOH, 0,1% Tween-20, pH ustawione na 7,5</li>
<li>Roztwór blokujący – 3 części MAB, 1 część 10% odczynnika blokującego Boehringer w MAB, 1 część inaktywowanego termicznie surowicy jagnięcej</li>
<li>Bufor AP – 60mM Tris-HCl pH ustawione na 9,5, 60mM NaCl, 30mM MgCl2, 0,1% Tween-20</li>
<li>Roztwór barwiący – fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolylu (BCIP) i nitro błękit tetrazoliowy (NBT) w buforze AP</li>
</ul>
4. REPREZENTATYWNE WYNIKI
Przy prawidłowym przebiegu reakcja pomiędzy NBT, BCIP a fosfatazą alkaliczną prowadzi do powstania fioletowego osadu, który powinien pojawić się na embrionie danio pręgowanego w formie fioletowego zabarwienia. Sondy ryboprobowe powinny zostać uprzednio zsyntetyzowane z cDNA odpowiadającego badanemu genowi. Zatem można wywnioskować, że każde zaobserwowane zabarwienie reprezentuje obszary organizmu danio pręgowanego, w których badany gen był transkrybowany na danym etapie rozwoju. Na potrzeby niniejszego kursu sondy ryboprobowe zsyntetyzowano z cDNA genów aldh1a2 (wcześniej raldh2; Begemann et al., 2001; Rycina 1); fgf8a (Reifers et al., 1998; Rycina 2); deltaC (Oates et al., 2005); myod1 (Weinberg et al., 1996); shha (Krauss et al., 1993), pax2a (Brand et al., 1996; Rycina 3) oraz myl7 (wcześniej cmlc2; Yelon et al., 1999). Zabarwienia oczekiwano w linii środkowej oraz w strukturach anatomicznych, takich jak somity, pączek ogonowy, miotom, mózg i serce. W przypadku mutantów Ace/fgf8a spodziewano się wystąpienia wad w wielu z tych struktur. Zabarwienie było łatwo widoczne przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego. Dodatkowe źródła zawierają więcej informacji oraz wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów związanych z technikami WISH podobnymi do opisanych tutaj (Clark, 2003; D'Costa et al., 2009; Schmoldt et al., 2009; Schoenwolf, 2009).
<img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Schemat etapów rozwoju embrionalnego; oznaczone elementy: ródmózg, oko, primordia płetw piersiowych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zarodek danio pręgowanego 24 godziny po zapłodnieniu, poddany hybrydyzacji z ryboprobnami specyficznymi dla aldh1a2. Specyficzne barwienie widoczne jest w oczach, ródmózgu, primordiach pąków płetw piersiowych oraz somytach. Góra obrazu odpowiada stronie przedniej, dół stronie tylnej.
<img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Schemat rozwoju mózgu zarodkowego; etykiety: telencefalon, diencefalon, granica śródmózgowia i rąbku." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zarodek danio pręgowanego na etapie 13 somytów, poddany hybrydyzacji z sondą specyficzną dla fgf8a. Specyficzne barwienie widoczne jest w telencefalonie, grzbietowej części diencefalonu, granicy śródmózgowia i rąbku, somytach oraz pączku ogonowym. Strona brzuszna znajduje się po lewej, grzbietowa po prawej.
<img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Rozwój mózgu embrionalnego, opisany obraz mikroskopowy, granica śródmózgowia i rądmózgowia, pęcherzyk słuchowy." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Embrion zebrafish 22 godziny po zapłodnieniu, który został poddany hybrydyzacji z ryb sondą specyficzną dla pax2a, będącą silnym markerem przydatnym do wizualizacji układu nerwowego. Specyficzne barwienie widoczne jest w szczelinie naczyniówkowej, na granicy śródmózgowia i rądmózgowia, w pęcherzyku słuchowym oraz w neuronach rdzenia kręgowego. Widok grzbietowy, przód po lewej stronie.

<ol><li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li>
<li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7%2C+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+A+Clin+Mol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li>
<li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li>
<li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li>
<li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+M+%22In+situ+Hybridization%3A+Laboratory+Companion%22">In situ Hybridization: Laboratory Companion</a>. , Wiley-VCH. (2003).</li>
<li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+development+and+genetics%3A+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Volume+1%22">Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).</li>
<li>Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+limb+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.</li>
<li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+somite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.</li>
<li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li>
<li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li>
<li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+%28ace%29+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li>
<li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchoenwolf%2C+GC+%22Laboratory+Studies+of+Vertebrate+and+Invertebrate+Embryos%3A+Guide+and+Atlas+of+Descriptive+and+Experimental+Development%22">Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development</a>. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).</li>
<li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somite+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li>
<li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type%2C+no+tail+and+spadetail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda WISH została wykorzystana w laboratorium z biologii porównawczej kręgowców, aby pomóc studentom zrozumieć rolę genetyki w rozwoju anatomicznym poprzez wizualizację znanych wzorów ekspresji genów. W pierwszej części kursu studenci przeprowadzili sekcje organizmów reprezentujących kilka różnych taksonów strunowców, co zapewniło im wystarczającą ilość czasu na badanie, zrozumienie, porównywanie i zestawianie anatomii kręgowców.
W ramach wprowadzenia do drugiej części kursu studenci uczestniczyli w wykładzie formalnym, podczas którego omówiono rozwój i anatomię danio pręgowanego. Przedyskutowano również metody oraz oczekiwane wyniki eksperymentu WISH. Następnie studentom przekazano żywe osobniki danio pręgowanego na etapie somitogenezy i stadium prim-6, a także w 2 i 5 dniach po zapłodnieniu (dpf), w celu ich zbadania pod mikroskopem stereoskopowym. Miało to na celu lepsze zapoznanie studentów z wyglądem embrionów danio pręgowanego oraz rodzajami zmian morfologicznych zachodzących podczas ontogenezy.
Podczas następnego zajęcia laboratoryjnego studenci otrzymali embriony danio pręgowanego, w których wcześniej przeprowadzono hybrydyzację in situ całego embrionu (WISH). Poproszono ich o zbadanie i opisanie wzorów ekspresji każdego z badanych genów (użytej sondy rybowej). Embriony wykorzystane do WISH pochodziły z krzyżówek osobników heterozygotycznej linii ace/fgf8a. Zgodnie z prawami dziedziczenia mendlowskiego oczekiwano, że 25% embrionów z krzyżówek ace/fgf8a będzie mutantami homozygotycznymi i wykaże wady w wielu strukturach anatomicznych omawianych w ramach tego kursu. Na podstawie opublikowanych raportów oraz niepublikowanych obserwacji przeprowadzonych w laboratorium Albertson oczekiwano wystąpienia wad mózgu i nieprawidłowego zawijania serca, a także wad somytów (Brand et al., 1996; Albertson and Yelick, 2005; obserwacje własne).
Studenci zostali poproszeni o zbadanie wszystkich okazów, zarówno typu dzikiego (zwierzęta heterozygotyczne są nieodróżnialne od rodzeństwa typu dzikiego we wczesnych stadiach rozwoju), jak i mutantów homozygotycznych, dla każdego przedstawionego wzorca ekspresji genów. Następnie poproszono ich o sporządzenie raportów laboratoryjnych z opisem uzyskanych wyników oraz wyjaśnieniem, w oparciu o wiedzę z zakresu anatomii i genetyki, w jaki sposób wadliwa ekspresja genów mogła doprowadzić do powstania malformacji anatomicznych.
Studenci przyjęli to ćwiczenie laboratoryjne z entuzjazmem i ciekawością. Większość z nich nigdy wcześniej nie korzystała z metody WISH i była niezwykle zainteresowana tą częścią kursu. Studenci uznali różne wzory ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego za intrygujące; niektórzy opisywali wizualizowane wzory barwienia, kojarząc je ze znanymi kształtami i symbolami, takimi jak uśmiechnięta buźka. Powstałe raporty laboratoryjne wykazały, że studenci posiedli ogólną wiedzę na temat protokołu WISH oraz ekspresji genów w konkretnych strukturach anatomicznych. Od studentów wymagano również zrozumienia specyficznych funkcji genów badanych podczas zajęć za pomocą WISH (Stickney et al., 2000; Huelsken et al., 2002; Geetha-Loganathan et al., 2008a; Geetha-Loganathan et al., 2008b). Było jednak ewidentne, że niektórzy studenci posiadali ograniczoną wiedzę wstępną na temat szlaków sygnalizacyjnych i analizowanych genów. Rozszerzenie wykładu wprowadzającego do metody WISH o więcej informacji na temat tych zagadnień mogłoby być korzystnym uzupełnieniem w przyszłych kursach biologii porównawczej kręgowców.
Ponieważ protokół trwa zazwyczaj cztery kolejne dni, w zależności od harmonogramu kursu studenci mogą być w stanie zrealizować w klasie tylko część eksperymentu, a za pozostałą część odpowiedzialny musi być instruktor. W naszym kursie Biologii Porównawczej Kręgowców studenci przeprowadzali reakcje barwienia w laboratorium, podczas gdy asystent przeprowadzał wszystkie poprzedzające etapy. Jeśli preferowane jest, aby studenci przeprowadzili WISH w klasie, protokół można podzielić na podjednostki, które mogą być realizowane podczas kilku sesji laboratoryjnych, zależnie od ram czasowych zajęć. Jeśli przeprowadzenie całego protokołu przez studentów nie jest możliwe, co miało miejsce w tym przypadku ze względu na spotkania laboratoryjne odbywające się tylko raz w tygodniu, studenci mogą dodać roztwór barwiący na początku zajęć i, w zależności od użytej sondy rybowej, zakończyć barwienie w ciągu godziny. Czas potrzebny na wywołanie barwienia znacznie różni się w zależności od sondy rybowej oraz różnorodnych warunków eksperymentalnych i powinien zostać określony przed zajęciami. Warto zauważyć, że jeśli studenci będą jedynie wywoływać barwienie w laboratorium, instruktorzy będą odpowiedzialni za wszystkie poprzednie kroki, co będzie wymagało znacznego nakładu czasu i wysiłku poza salą lekcyjną. Jeśli jest to pożądane, krótszą alternatywą dla WISH mogłaby być immunohistochemia, wykorzystująca znaczniki przeciwciał do wizualizacji lokalizacji białek, jednak obecnie przeciwciała specyficzne dla zebrafish dla genów rozwojowych nie są łatwo dostępne. Inną opcją byłoby przeprowadzenie WISH na różnych gatunkach kręgowców i polecenie studentom porównania wzorców ekspresji tych samych genów w różnych organizmach (Pizard et al., 2004; Aramaki et al., 2007; Emerging Model Organisms, 2008; Emerging Model Organisms, 2010).
Nadrzędnym celem zastosowania metody WISH w kursie biologii porównawczej kręgowców było zaprezentowanie studentom, w jaki sposób techniki biologii molekularnej są wykorzystywane do badania rozwoju anatomicznego. Stanowiło to również okazję dla studentów do rozważań nad tym, jak zmieniona ekspresja genów może prowadzić nie tylko do wad rozwojowych, ale także do zmian ewolucyjnych. Sformalizowana jako ewolucyjna biologia rozwoju (często określana jako „evo-devo”), ta szybko rozwijająca się dziedzina badań dąży do powiązania genotypu z fenotypem poprzez proces rozwoju oraz do wyjaśnienia potencjalnych mechanistycznych podstaw zmian ewolucyjnych. Wraz z rozwojem tej dyscypliny coraz więcej ekologów, biologów organizmów i fizjologów stosuje techniki molekularne w swoich badaniach. Twierdzimy, że wykorzystanie WISH w kursie biologii porównawczej kręgowców pomoże utrzymać program nauczania na poziomie zgodnym z aktualnymi postępami technologicznymi i koncepcyjnymi w badaniach oraz ułatwi lepsze poziome dopasowanie zaawansowanych kursów biologii poprzez łączenie biologicznych poddziedzin. Co więcej, to zintegrowane podejście zapewni studentom możliwość opanowania szeregu technik badawczych z zakresu biologii w ramach jednego kursu, co prowadzi do bardziej zróżnicowanego wykształcenia i promowania przyszłych interdyscyplinarnych badań naukowych.

<table><tbody><tr><td>5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)</td><td>Fisher Scientific</td><td>2300000</td><td></td></tr><tr><td>Chemicznie kompetentne komórki E. coli One Shot TOP10 z pożywką SOC </td><td>Invitrogen</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Sód ampicyliny </td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Acros Organics</td><td>42383-0010</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petri 100 x 20 mm nieobrobiona</td><td>Sprzedaż produktów laboratoryjnych</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>probówka do hodowli 14 ml, z zamknięciem typu snap-top</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495911B</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne &amp;buforowanie &amp;amp; 10xBSA</td><td>New England Biolabs</td><td>zmienny</td><td></td></tr><tr><td>pirokarbonian dwuetylowy (DEPC) 25 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny USP/FCC 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>S608500</td><td></td></tr><tr><td>Gal alkoholu etylowego 200 proof </td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Tris-octan-EDTA (TAE) 50x 1L</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp13321</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Low EEO 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>bromek etydyny 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-E1510</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do nakładania na żel sacharozowy, 40% sacharozy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP655-1</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA 1 kb Full Scale</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2582200</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina do znakowania RNA DIG</td><td>Grupa Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T3</td><td>Grupa Roche</td><td>1031163</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Grupa Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA SP6</td><td>Grupa Roche</td><td>810274</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy Protector</td><td>Grupa Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I, wolna od RNaz 10 000 jednostek </td><td>Grupa Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do biologii molekularnej EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>e5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek litu 100 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>L121100</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty ACS 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>a38500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd R 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>Przeprowadzenie testu ELISA do oznaczania cytokin w surowicy krwi

Streszczenie
W niniejszym protokole przedstawiono metodę wykonywania testu ELISA (enzymatycznego testu immunosorpcyjnego) w celu ilościowego oznaczenia poziomów cytokin w surowicy krwi. Test ELISA jest niezwykle czułą i specyficzną techniką analityczną, która wykorzystuje przeciwciała do wykrywania i pomiaru białek w próbkach biologicznych. W tym zestawieniu opisano metodę typu „sandwich” (kanapkową), w której przeciwciało wychwytujące unieruchomione na płytce mikrodołkowej wiąże docelową cytokinę, a następnie przeciwciało detekcyjne sprzężone z enzymem wiąże się z kompleksem, co po dodaniu substratu prowadzi do powstania sygnału kolorystycznego proporcjonalnego do stężenia analitu.

Słowa kluczowe
cytokiny, ELISA, surowica krwi, analiza ilościowa, przeciwciała, białka zapalne

Materiały i odczynniki
1. Zestaw do testu ELISA na konkretną cytokinę (zawierający płytki z przeciwciałami wychwytującymi, standardy, przeciwciała detekcyjne sprzężone z HRP, substrat TMB, roztwór stopujący i bufor do mycia)
2. Surowica krwi (próbki badawcze)
3. Pipety wielokanałowe i jednokanałowe z odpowiednimi końcówkami z filtrem
4. Czytnik płytek mikrodołkowych (spektrofotometr ELISA)
5. Inkubator lub inkubator z wstrząsaniem
6. Woda destylowana lub dejonizowana
7. Probówki mikrocentryfugowe

Procedura

Przygotowanie próbek i standardów
1. Rozmrozić surowicę krwi w temperaturze 4°C i wymieszać delikatnie poprzez odwracanie probówki.
2. Przygotować szereg rozcieńczeń standardu zgodnie z instrukcją producenta zestawu, aby stworzyć krzywą kalibracyjną.
3. Rozcieńczyć próbki surowicy w odpowiednim buforze do rozcieńczania, aby stężenie cytokin mieściło się w zakresie dynamicznym standardów.

Przeprowadzenie testu
1. Do każdego dołka płytki mikrodołkowej nanieść odpowiednią objętość standardów oraz rozcieńczonych próbek (zazwyczaj w powtórzeniach n=2).
2. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze wskazanej przez producenta (np. 37°C przez 2 godziny) w celu związania cytokin z przeciwciałami wychwytującymi.
3. Odessać zawartość dołków i przemyć płytkę buforem do mycia (np. trzy razy), dbając o całkowite usunięcie cieczy po każdym cyklu.
4. Nanieść do każdego dołka przeciwciało detekcyjne sprzężone z enzymem (np. HRP).
5. Inkubować płytkę ponownie w odpowiedniej temperaturze i czasie, unikając bezpośredniego nasłonecznienia.
6. Powtórzyć cykl mycia, aby usunąć niezwiązane przeciwciała detekcyjne.
7. Dodać substrat TMB do każdego dołka i inkubować przez określony czas do momentu pojawienia się niebieskiego zabarwienia.
8. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie roztworu stopującego, co spowoduje zmianę koloru z niebieskiego na żółty.

Pomiar i analiza danych
1. Zmierzyć absorbancję (gęstość optyczną) płytek za pomocą czytnika płytek przy długości fali określonej w instrukcji (zazwyczaj 450 nm).
2. Wykreślić krzywą standardową, nanosząc wartości absorbancji standardów w funkcji ich stężenia.
3. Obliczyć stężenie cytokin w próbkach surowicy na podstawie krzywej standardowej, uwzględniając zastosowane rozcieńczenia.</td><td></td></tr><tr><td>PBS roztwór buforu fosforanowo-solnego 10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp3991</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp337500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol 5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K 50 mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp170050</td><td></td></tr><tr><td>Formamid 1 l</td><td>Fisher Scientific</td><td>F841</td><td></td></tr><tr><td>1 L 20x SSC</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp13251</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy bezwodny ACS 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>a940500</td><td></td></tr><tr><td>Transferowy kwas rybonukleinowy V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r7876-2.5KU</td><td></td></tr><tr><td>Sód heparyny 50 mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp252450</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy R 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3417500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>s271500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>s318500</td><td></td></tr><tr><td>Odczyn blokujący</td><td>Grupa Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Surowica jagnięca 500 ml</td><td>Invitrogen</td><td>16070096</td><td></td></tr><tr><td>Fragmenty przeciwciał anty-DIG AP</td><td>Grupa Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Tris 2M 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp1759500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>Podsumowanie

W niniejszym protokole opisano procedurę izolacji i oczyszczania białka GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) z bakterii Escherichia coli przy użyciu chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na specyficznym wiązaniu białka GFP z odpowiednią macierzą, co pozwala na jego skuteczne oddzielenie od pozostałych białek komórkowych. W protokole szczegółowo omówiono etapy przygotowania hodowli bakteryjnej, lizy komórek, wiązania białka do kolumny oraz jego elucji i analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Procedura ta służy jako model do nauki podstawowych technik oczyszczania białek i analizy ich czystości oraz wydajności procesu.</td><td></td></tr><tr><td>BCIP 3 ml</td><td>Grupa Roche</td><td>11383221001</td><td></td></tr><tr><td>NBT 3 ml</td><td>Grupa Roche</td><td>11383213001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 99% 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC158920025</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa PS ST z pokrywką</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml z zakrętką, 50 szt./stelaż 500 szt./opakowanie</td><td>Sprzedaż produktów laboratoryjnych</td><td>L262861</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 50 ml z nakrętką 25 szt./stelaż 500 szt./opakowanie</td><td>Sprzedaż produktów laboratoryjnych</td><td>L262890</td><td></td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówki o pojemności 1,6 ml </td><td>Sprzedaż produktów laboratoryjnych</td><td>L234401</td><td></td></tr><tr><td>2 Parafilm M&quot; x 250 stóp</td><td>Fisher Scientific</td><td>s37441</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa 7 ml </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1020-2520</td><td></td></tr><tr><td>.1-10 &amp;mu;Napiwek do pipety, opakowanie zbiorcze </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-3000</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;Napiwnik do pipety, opakowanie zbiorcze </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-0006</td><td></td></tr><tr><td>101-1000 &amp;mu;Końcówki do pipet, opakowania zbiorcze </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Sklep spożywczy</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Autoklaw&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikrowirówka&lt;/li&gt;&lt;li&gt;37&amp;#x00B0;Inkubator CO2 (z wytrząsarką)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4&amp;#x00B0;mikrowirówka C&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Kąpiel wodna&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mieszanie w wirówce (vortexowanie)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Aparatura do elektroforezy żelowej&lt;/li&gt;&lt;li&gt;-20&amp;#x00B0;zamrażarka do -80°C&lt;/li&gt;&lt;li&gt;-80&amp;#x00B0;zamrażarka do głębokiego mrożenia&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Kołyska/mieszadło orbitalne&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4&amp;#x00B0;lodówka C&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikroskop stereoskopowy (najlepiej z ekranem dydaktycznym lub kamerą)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

zastosowanie preparatów całych (whole mount) in situ hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych (WISH) jest powszechną techniką w laboratoriach biologii molekularnej, stosowaną do badania ekspresji genów poprzez lokalizację specyficznych transkryptów mRNA w całych preparatach. Technika ta (zaadaptowana z Albertson i Yelick, 2005) została wykorzystana w ramach zajęć laboratoryjnych z biologii porównawczej kręgowców dla studentów wyższych lat studiów licencjackich na Uniwersytecie w Syracuse. Pierwsze dwie trzecie kursu laboratoryjnego z biologii porównawczej kręgowców dawały studentom możliwość zapoznania się z embriologią i anatomią makroskopową kilku organizmów reprezentujących różne taksony strunowców, głównie poprzez tradycyjne sekcje i wykorzystanie modeli. Końcowa część kursu obejmowała innowacyjne podejście do nauczania anatomii poprzez obserwację rozwoju kręgowców z wykorzystaniem technik molekularnych, w ramach których przeprowadzono WISH na embrionach danio pręgowanego. Wykorzystano heterozygotyczną linię mutantów czynnika wzrostu fibroblastów 8 a (fgf8a), ace. Zgodnie z dziedziczeniem mendlowskim, krzyżówki w obrębie linii ace dawały osobniki typu dzikiego, heterozygoty oraz mutanty homozygotyczne ace/fgf8a w stosunku 1:2:1. Zastosowano sondy RNA o znanych wzorach ekspresji w linii środkowej oraz w rozwijających się strukturach anatomicznych, takich jak serce, somity, pączek ogonowy, miotom i mózg. WISH przeprowadzono na danio pręgowanym w stadiach 13 somitów oraz prim-6, przy czym studenci przeprowadzali reakcję barwienia podczas zajęć. Badanie embrionów danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju umożliwiło studentom obserwację zmian zachodzących w tych strukturach anatomicznych w trakcie ontogenezy. Ponadto u niektórych mutantów ace/fgf8a zaobserwowano nieprawidłowe zapętlenie serca oraz wady rozwoju somitów i mózgu. Studenci w tym laboratorium obserwowali prawidłowy rozwój różnych układów narządowych, opierając się zarówno na anatomii zewnętrznej, jak i na wzorach ekspresji genów. Identyfikowali i opisywali również embriony wykazujące nieprawidłowy rozwój anatomiczny i ekspresję genów (tj. domniemane mutanty).
W przypadku instruktorów w placówkach, które nie posiadają niezbędnego sprzętu lub gdzie fundusze na innowacje laboratoryjne i programowe są ograniczone, koszty finansowe odczynników i aparatury mogą być czynnikiem wartym rozważenia, podobnie jak czas i wysiłek wymagany ze strony instruktora, niezależnie od warunków. Niemniej jednak uważamy, że zastosowanie metody WISH w tego typu zajęciach laboratoryjnych może stanowić istotny pomost między genetyką rozwoju a anatomią. Wraz z postępem technologicznym oraz tym, że badanie rozwoju organizmów na poziomie molekularnym staje się łatwiejsze, tańsze i coraz bardziej popularne, wielu biologów ewolucyjnych, ekologów i fizjologów zwraca się ku strategiom badawczym z zakresu biologii molekularnej. Wykorzystanie WISH w ramach zajęć laboratoryjnych z porównawczej biologii kręgowców jest przykładem tego, jak cząsteczki i anatomia mogą zbiegać się w ramach jednego kursu. Daje to studentom wyższych lat studiów możliwość praktykowania nowoczesnych technik badawczych w biologii, co prowadzi do bardziej zdywersyfikowanej edukacji i promowania przyszłych interdyscyplinarnych badań naukowych.

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie (WISH) jest powszechną techniką stosowaną w laboratoriach biologii molekularnej do badania ekspresji genów poprzez lokalizację...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja wzorców ekspresji genów w embrionach danio pręgowanego na określonych etapach rozwoju. Jest to realizowane poprzez hybrydyzację znakowanej digoksgenem antysensownej sondy ryboprobe z docelowym mRNA, a następnie detekcję tej sondy.Użyto przeciwciała przeciwko doxygenowi, które jest sprzężone z enzymem fosfatazą zasadową. Trzecim krokiem procedury jest barwienie poprzez dodanie NBT i BCIP, które reagują z fosfatazą zasadową, tworząc nierozpuszczalny fioletowy osad. Ostatnim etapem procedury jest inkubacja odpowiednio zabarwionych embrionów w metanolu w celu zredukowania barwienia nieswoistego.Ostatecznie, wyniki ukazujące wzorce ekspresji genów w całych embrionach danio pręgowanego na określonych etapach rozwoju można uzyskać za pomocą hybrydyzacji in situ w całym zarodku. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak tradycyjne demonstracje histologiczne czy sekcje w ramach zajęć, jest to, że daje ona studentom możliwość budowania mostów koncepcyjnych między biologią molekularną a trendami w rozwoju i ewolucji organizmów, zapewniając tym samym prawdziwie integracyjne doświadczenie. Chociaż metody te były tradycyjnie wykorzystywane do badania rozwoju kilku organizmów modelowych, można je z łatwością zastosować do innych organizmów niemodelowych, aby zrozumieć konserwatywność szlaków rozwojowych w różnych taksonach kręgowców, a także wskazać miejsca, w których szlaki te odbiegają, prowadząc do nowości ewolucyjnych.Metoda ta może być nieznana studentom studiów licencjackich, więc niektórzy z nich mogą mieć początkowo trudności, jednak opanowanie tej techniki będzie im bardzo przydatne podczas projektów badawczych oraz na kursach wyższych poziomów nauczania. Aby rozpocząć procedurę, należy za pomocą pipety transferowej przenieść około 50 embrionów zebrafish do mikroprobówki na odpady. Usunąć nadmiar cieczy, a następnie pipetować do probówki 1,5 milliliters 4%para formaldehydu.Probówkę z embrionami umieścić na mieszadle w temperaturze pokojowej na całą noc. Następnego ranka usunąć utrwalacz i go wylać. Do embrionów dodać 1,5 ml roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym zawierającego 0,1% tween 20 w celu ich przemycia.W razie potrzeby należy użyć pęsety z cienkimi końcówkami, aby ręcznie pokryć zarodki, a następnie za pomocą pipety transferowej przenieść pokryte zarodki do czystej probówki typu microfused. Następnie do probówki należy nanieść pipetą 1,5 milliliters 25% methanol i PBST. Po jednej godzinie inkubacji należy odessać jak najwięcej tego roztworu, uważając, aby nie poruszyć zarodków.Następnie zastąpić 1,5 ml 50% metanolu w PBST i inkubować przez co najmniej jedną godzinę. Na koniec zastąpić 1,5 ml 100% metanolu i umieścić w temperaturze -20 °C. Zarodki można przechowywać w metanolu w temperaturze -20 °C.Po przygotowaniu do użycia, pipetą pobierz metanol z probówki i wyrzuć końcówkę pipety. Do probówki wlej 50% metanol w PBST i inkubuj przez 10 minut. Powtórz tę czynność, wykonując drugie płukanie, następnie odessij roztwór i powtórz inkubację z użyciem 25% metanolu w PBST.Na koniec dwa razy przemyj przez 10 minut każdy raz w 100% PBST, a następnie przygotuj 10% roztwór nadtlenku wodoru w PBST. Zanurz zarodki zebrafish w tym roztworze w temperaturze pokojowej z otwartą zakrętką probówki typu microfuge na 10 do 20 minut, w zależności od wieku zarodka. Aby usunąć ciemną pigmentację, odessaj i wylej roztwór nadtlenku wodoru za pomocą pipety transferowej.Wielokrotnie przemyj embriony w 1,5 mililitrach PBST, aby zatrzymać reakcję. Rozcieńcz roztwór zapasowy proteinazy K o stężeniu 50 miligramów na mililitr w stosunku 1:5 000 w PBST. Zazwyczaj stosuje się 1 mikrolitr proteinazy K w 4,999 mililitrach PBST.Usunąć PBST z embrionów. Za pomocą pipety transferowej odessać ciecz i dodać 1,5 milliliters roztworu proteinazy K do probówki. Zanurzyć embriony w roztworze proteinazy K w temperaturze pokojowej na od 3 do 15 minut, w zależności od wieku embrionów.Przemyj kilka razy roztworem PBST, aby zatrzymać reakcję. Następnie usuń PBST i zanurz zarodki w 4% formaldehydzie na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu ponownej fiksacji, a następnie usuń paraformaldehyd za pomocą pipety transferowej i go wylej. Dodaj 1,5 milliliters PBST do zarodków i przemywaj przez pięć minut.Ostrożnie odpipetuj PBST z probówki i go wylej. Powtórz płukanie, używając kolejnych dwóch objętości PBST. Następnie przejdź do hybrydyzacji sond rip, wstępnie podgrzej kąpiel wodną do 70 °C i przygotuj roztwór do wstępnej hybrydyzacji.Następnie za pomocą pipety transferowej usunąć i odrzucić PBST. Zanurzyć zarodki w 0,5 milliliters roztworu przedhybrydyzacyjnego i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 70 degree Celsius przez dwie do trzech godzin, dbając o to, aby nie poruszać zarodków.Odpipetuj roztwór przedhybrydyzacyjny z probówki z odpadami i go usuń. Ostrożnie pipetuj 0,5 milliliters roztworu hybrydyzacyjnego do probówki. Następnie szybko dodaj wcześniej zsyntetyzowany doxygen z oznakowanej probówki ribo.Do probówki wprowadza się sondy ribo w stężeniach wynoszących około 1 µg/mL. Inkubować w temperaturze 70 °C przez noc. Następnego dnia przygotować roztwory PHS o stężeniach 75%, 50% i 25% w dwukrotnym roztworze cytrynianu sodu (2× SSC), a także roztwory 2× SSC i 0,2× SSC.Podgrzej pozostałe roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C. Po osiągnięciu przez roztwory temperatury 70 °C wyjmij je z łaźni wodnej. Następnie odessać roztwór hybrydyzacyjny z probówki i go zutylizować.Dodaj 0,5 ml każdego ciepłego roztworu P-H-S-S-S-C, inkubując embriony w każdym z roztworów przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Na koniec inkubuj embriony w 0,2-krotnym roztworze SSC w temperaturze 68 °C przez 30 minut. Odessać 0,2-krotny roztwór SSC z probówki i go usunąć.Inkubować embriony w 1,5 milliliters buforu kwasu jabłkowego o pH 7,5 w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórzyć tę czynność, płukząc po raz drugi. Przygotować roztwór blokujący zgodnie z protokołem pisemnym.Przenieść embriony w MAB do poszczególnych studzienek płytki 12-dołkowej. Usunąć nadmiar MAB i pipetować od 1 do 2 ml roztworu blokującego do każdej studzienki.Inkubować w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez co najmniej trzy godziny. Rozcieńczyć antygen w przeciwciele w stosunku 1:2000 w pozostałym roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny przy łagodnym mieszaniu.Uważając, aby nie zakłócić embrionów, odpipetować roztwór blokujący z dołków płytki i go usunąć. Delikatnie nanieść pipetą wcześniej przygotowane przeciwciało anty-doxygen oraz roztwór blokujący do dołków, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.Następnego dnia przemyć embriony pięciokrotnie w 1,5 ml buforu z kwasem jabłkowym. Pozostaw embriony do inkubacji w buforze z kwasem jabłkowym przez pięć minut. Następnie przeprowadź wymiany buforu i inkubuj przez dwa okresy po 10 minut.Jeden przedział czasowy 30 minut oraz jeden 60 minut. Odessać końcowe przemycie buforem z kwasem meikowym z dołków i wyrzucić pipetę. Wlać od 1,5 do dwóch mililitrów buforu do fosfatazy alkalicznej do dołków i inkubować przez pięć minut.Powtórz ten proces dwukrotnie. Usuń bufor fosfatazy alkalicznej i dodaj do dołków od 1,5 do 2 ml roztworu barwiącego. Owiń całą płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem, i delikatnie mieszaj w odstępach 20 minutowych.Zatrzymaj mieszanie i obejrzyj embriony pod mikroskopem stereoskopowym, aby sprawdzić, czy uzyskano wystarczające zabarwienie. Po uzyskaniu odpowiedniego stopnia zabarwienia, odessaj roztwór barwiący z dołków i go zutylizuj. Zastąp go buforem PBST, aby zatrzymać reakcję barwienia.Powtórzyć proces płukania kolejną objętością PBST, odpipetować PBST z dołków i usunąć w celu odwodnienia embrionów. Do dołków pipetować od 1,5 do 2 ml 25% methanolu w PBST i inkubować przez 10 minut. Powtórzyć ten proces dwukrotnie, używając 50% methanolu w PBST, inkubując przez kolejne 10 minut przy każdym płukaniu. Następnie przenieść embriony do 100% methanolu i inkubować przez co najmniej dwie godziny w celu ograniczenia nieswoistego barwienia.Po inkubacji odpipetować metanol z dołków i usunąć go, aby rehydratować embriony. Przemyć dwa razy 50% metanolem w PBST, a następnie 25% metanolem w PBST przez 10 minut w każdym etapie. Następnie przemyć 100% PBST dwa razy po 10 minut za każdym razem.Na koniec, za pomocą serii płukań w roztworach o stopniowo zwiększonym stężeniu, przenieść zabarwione zarodki do 80% roztworu glicerolu w PBST i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do czasu obserwacji, jeśli procedura została wykonana prawidłowo. Ekspresja badanego genu jest sygnalizowana pojawieniem się fioletowego zabarwienia w zarodku danio pręgowanego. Na tym obrazie przedstawiono zarodek danio pręgowanego 24 godziny po zapłodnieniu, który został poddany hybrydyzacji z sondami RIBA specyficznymi dla AAL DH one A two; specyficzne zabarwienie jest widoczne w oczach, rąbku mózgu, pąkach płetw piersiowych, ria oraz somytach.Na tym obrazie przedstawiono embrion zebry danio na etapie 13 somytów, który został poddany hybrydyzacji z sondą specyficzną dla FGF eight A. W tym przypadku specyficzne barwienie widoczne jest w linii pośrodkowej, grzbietowej części neuronów, śródmózgowiu, granicy między śródmózgowiem a rądmózgowiem, somytach oraz pączku ogonowym. Ten obraz przedstawia embrion zebry danio 22 godziny po zapłodnieniu, który został poddany hybrydyzacji z sondą specyficzną dla PAX two A. Jest to silny marker użyteczny do wizualizacji układu nerwowego.Po opanowaniu metody można zaobserwować specyficzne barwienie w szczelinie naczyniówkowej, śródmózgowiu, granicy między śródmózgowiem a rąbmózgowiem, pęcherzyku słuchowym oraz neuronach rdzenia kręgowego. Technikę tę można zmodyfikować tak, aby przeprowadzić ją w ciągu kilku sesji laboratoryjnych, w zależności od harmonogramu kursu. Prowadzący może wymagać poświęcenia czasu i wysiłku poza zajęciami w klasie.Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu poczują Państwo większą swobodę wprowadzając hybrydyzację w preparatach całych (whole mount) oraz C2 do laboratoriów na poziomie studiów licencjackich. W miarę rozwijania tych umiejętności przez studentów, znajomość tej techniki może ułatwić im przejście do badań na wyższych etapach studiów lub w ramach studiów magisterskich i doktoranckich.

using-whole-mount-situ-hybridization-to-link-molecular-organismal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie hybrydyzacji in situ na całym organizmie w celu powiązania biologii molekularnej i organizmowej

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Poznaj technikę hybrydyzacji in situ na całych preparatach (WISH) do badania ekspresji genów w zarodkach Danio rerio. Metoda łączy biologię molekularną z organizmową w edukacji akademickiej.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Przeglądaj więcej filmów