Rozwarstwienie i barwienie jajników larw Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja izolowanych jajników z larw późnego stadium rozwoju choroby Drosophila za pomocą mikroskopu konfokalnego. Osiąga się to poprzez najpierw selekcję larw samic z zsynchronizowanej populacji. Drugim etapem zabiegu jest wypreparowanie nienaruszonego ciała tłuszczowego, oddzielenie go od jelita i naskórka oraz umieszczenie na lodzie.

Trzecim krokiem zabiegu jest utrwalenie plamy i umycie tłustego ciała z osadzonymi jajnikami. Ostatnim etapem zabiegu jest oddzielenie jajników od ciała tłuszczowego podczas montażu. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują barwienie specyficzne dla komórek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ drobne sekcje i montaż wymagają dużej praktyki. Pięć dni przed sekcją dodaj drożdże do świeżej 25-milimetrowej fiolki z pokarmem dla much. Umieść w fiolce od siedmiu do 16 pokrytych samic muszek owocowych.

Pozwól samicom złożyć jaja przez dwie do czterech godzin lub do momentu, gdy w jednej fiolce będzie około 30 jaj. Inkubować fiolki zawierające jajo w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności co najmniej 70%. Po pięciu dniach larwy osiągają późne trzecie stadium rozwojowe.

Napełnij dziewięciodołkowe szklane naczynie preparacyjne pożywką dzwonka. Następnie przygotuj specjalnie wykonane foremki wyposażone w nylonową siatkę na szalce Petriego zawierającej dzwonek. Średni. Umieść naczynie na lodzie za pomocą drobnych kleszczy.

Wybierz od 10 do 15 larw ze ścianek fiolki i umieść je w naczyniu preparacyjnym. Umieść naczynie preparacyjne pod mikroskopem w celu selekcji i sekcji samic. Larwy samic można odróżnić od samców po ościeniu.

Męskie jądra są łatwe do zidentyfikowania jako duże, przezroczyste owale osadzone w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Żeńskie jajniki znajdujące się w tej samej części ciała tłuszczowego można zidentyfikować jako znacznie mniejsze, przezroczyste okrągłe kule. Jeśli jajniki nie są widoczne, larwy samic identyfikuje się po braku jąder.

Przenieś larwy samicy do czystej studni Aby rozpocząć sekcję, użyj kleszczy, aby przytrzymać larwy tuż za mózgiem. Usuń głowę za pomocą drugiej pary kleszczy. Pozostałą tylną część larw umieść po stronie grzbietowej tchawicy skierowaną w dół.

Trzymaj larwy za tylne kuliste kule za pomocą jednej pary kleszczy. Następnie powoli wepchnij kleszcze do środka, jednocześnie używając drugiej pary kleszczy, aby przesunąć naskórek do tyłu, aż około połowa ciała tłuszczowego larwy mocno się wyłoni. Przytrzymaj tylny koniec naskórka jedną parą kleszczy i luźno przytrzymaj resztę naskórka drugą parą delikatnie i powoli odciągnij tylny koniec, aby naskórek i przyczepione jelita przesunęły się przez szczelinę.

Pod koniec tego procesu odłącz jelito i naskórek od przedniej części ciała tłuszczowego. Dokładnie zwilż pipetę pastwiskową pożywką z dzwonka ze studni zawierającej wypreparowane larwy. Za pomocą pipety pastwiskowej przenieś ciało tłuszczowe do lodowatego podłoża z pierścieniami w sitku do komórek.

Kolejnym krokiem jest utrwalenie i zabarwienie preparatu przy 5% formaldehydzie w pożywce Ringera i inkubacja ciała tłuszczowego przez 20 minut z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej. O ile nie określono inaczej, wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej. Umyj tłuste ciało trzykrotnie 1%PBT za pierwszym razem przez pięć minut, drugi raz przez 10 minut, a trzeci raz przez 45 minut.

Blokować 0,3% PBTB przez godzinę z delikatnym mieszaniem. Po agitacji. Przenieś ciało tłuszczowe do rurki o pojemności 0,2 mililitra.

Usuń nadmiar płynu i dodaj żądane pierwsze przeciwciało rozcieńczone w 0,3% PBTB i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając na wałku. Następnego dnia przenieś tłuste ciało z powrotem do formy. Następnie umyj tłuste ciało trzy razy przez 30 minut za pomocą 0,3% PBTB z delikatnym mieszaniem.

Następnie zablokuj 0,3% PBTB uzupełnionym 5% normalną surowicą osła przez jedną godzinę. Przy delikatnym mieszaniu przenieś ciało tłuszczowe do probówki o pojemności 0,2 mililitra i dodaj odpowiednie wtórne przeciwciało fluorescencyjne rozcieńczone w roztworze blokującym. Umieść probówkę w stojaku i umieść stojak na walcu, inkubuj przez dwie godziny z delikatnym mieszaniem.

Jeśli przeciwciało jest fluorescencyjne, od tego momentu inkubuj w ciemności. Po dwóch godzinach przenieś tłuste ciało z powrotem do formy i umyj trzy razy przez 30 minut 0,3% PBT z delikatnym mieszaniem, aby wyciąć i zamontować jajniki. Przenieś ciało tłuszczowe do czystej rurki einor bardzo ostrożnie.

Usuń wszystkie płyny za pomocą pipety pastwiskowej i natychmiast przykryj nośnikiem montażowym vector shield. Odetnij końcówkę końcówki pipety i ostrożnie odessaj tłusty korpus za pomocą minimalnej ilości materiału montażowego. Przenieś ciało tłuszczowe na szkiełko mikroskopowe.

Następnym krokiem jest użycie dwóch niklowanych uchwytów na szpilki z szpilkami o średnicy 0,1 milimetra, aby rozłożyć ciało tłuszczowe pod mikroskopem stereoskopowym, zlokalizować jajniki, patrząc w tylną trzecią część ciała tłuszczowego. Ciało tłuszczowe ma kształt kwiatu, w miejscu, w którym otacza jajniki. Odetnij kwiaty od reszty tłustego ciała i odrzuć drabinę.

Usuń tłuste ciało otaczające gonadę, ostrożnie krzyżując dwie szpilki wokół niego i odciągając je od jajnika. Umieścić wyizolowaną gonadę na szkiełku z dala od pozostałości ciała tłuszczowego i wyrzucić pozostałości ciała tłuszczowego. Zakryj szkiełko pokrywą.

Poślizgnij i uszczelnij lakierem do paznokci. Uwidocznij jajnik bezpośrednio za pomocą mikroskopu konfokalnego. Liczby te pochodzą z dwóch i trzech jajników barwionych różnymi kombinacjami przeciwciał.

Na pierwszym obrazie jedno przeciwciało zarysowuje komórki somatyczne i plamy. Fuso fuso wskazane strzałkami to organelle wewnątrzkomórkowe. W pierwotnych komórkach rozrodczych, pokazanych na zielono, znajdują się końcowe komórki włókna i czapeczki, które razem tworzą komórki somatyczne niszy, grot strzałki wskazuje komórki czapeczki.

Ten rysunek przedstawia zmieszane komórki w kolorze magenta, które bezpośrednio stykają się z komórkami rozrodczymi przedstawionymi na niebiesko. Komórki somatyczne jajnika są zaznaczone na zielono Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania tworzenia nisz i zakładania komórek macierzystych w jajniku Tezo.