Name: Rozwarstwienie i barwienie jajników larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj technikę rozwarstwiania i barwienia jajników larw Drosophila w celu wizualizacji komórek macierzystych linii płciowej. Ta metoda pozwala szczegółowo badać biologię rozwojową i formowanie nisz somatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

IM jest wspierany przez grant reintegracyjny Marii Skłodowskiej-Curie. Praca ta została sfinansowana z grantu nr 1146/08 Israel Science Fund, przez Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research w Weizmann Institute of Science oraz Leir Charitable Foundation.

1. Składanie jaj
<ol>
	<li>Pięć dni przed sekcją: należy pozwolić zapłodnionym samicom na składanie jaj przez 2-4 godziny na świeżej pożywce wzbogaconej drożdżami. Aby uzyskać zsynchronizowane i dobrze rozwinięte larwy, ważne jest, aby nie dopuścić do przeludnienia hodowli (około 30 jaj na fiolkę 25 mm). Zazwyczaj do jednej fiolki używa się od 7 do 16 samic, w zależności od ich wydajności w składaniu jaj.</li>
</ol>
2. Wybór larw
<ol>
 <li>Przygotować szklaną szalkę sekcyjną z 9 dołkami wypełnioną roztworem Ringera (128mM NaCl, 2mM Kcl, 1.8mM CaCl2, 4mM MgCl2, 35.5mM sacharozy, 5mM Hepes pH 6.9).</li>
	<li>Przygotować sitka do komórek w płytce sześciodołkowej zawierającej roztwór Ringera i umieścić ją w lodzie. Alternatywnie można zastosować specjalnie wykonane formy z nylonową siatką.</li>
	<li>Pobrać larwy o określonym wieku ze ścianek fiolek za pomocą precyzyjnych pęset biologicznych i umieścić je w szalce sekcyjnej z roztworem Ringera.</li>
	<li>Przenieść larwę żeńską do czystego dołka. Samice odróżniamy od samców po gonadach. Jajnika samców są łatwo rozpoznawalne jako duże, przeźroczyste owale osadzone w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Jajniki samic, znajdujące się w tej samej części ciała tłuszczowego, można zidentyfikować jako znacznie mniejsze, przeźroczyste, okrągłe sfery.</li>
</ol>
3. Disekcja larwy
 <ol>
 <li>Przytrzymaj larwę pęsetą tuż za mózgiem i usuń głowę za pomocą drugiej pęsety.</li>
	<li>Umieść pozostałą tylną część na stronie grzbietowej, tak aby tchawica była skierowana w dół.</li>
	<li>Przytrzymaj larwę za przetchawnikami tylnymi jedną pęsetą i powoli pchaj ją do wewnątrz, podczas gdy drugą pęsetą przesuwaj kutykulę ku tyłowi, aż wyłoni się około połowy ciała tłuszczowego larwy.</li>
	<li>Mocno przytrzymaj koniec tylny i użyj drugiej pęsety, aby luźno chwycić kutykulę. Delikatnie i powoli odciągnij koniec tylny tak, aby kutykula wraz z przymocowanym jelitem wysunęły się przez szczelinę. Po zakończeniu tego procesu ciało tłuszczowe powinno zostać całkowicie oddzielone od jelita i kutykuli. Oddziel jelito od przedniej części ciała tłuszczowego. Aby ułatwić barwienie i montowanie preparatu, ważne jest, aby ciało tłuszczowe pozostało nienaruszone.</li>
	<li>Dokładnie zwilż pipetę Pasteura roztworem Ringera, najlepiej z naczynia zawierającego zdyssekowane larwy. Pomaga to pokryć pipetę i zapobiega przywieraniu ciała tłuszczowego. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść ciało tłuszczowe do lodowatego roztworu Ringera w sitku komórkowym.</li>
</ol>
4. Fixacja i barwienie
Wszystkie etapy są przeprowadzane w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem inkubacji z pierwszym przeciwciałem, która odbywa się w 4 °C.
<ol>
 <li>Inkubować ciało tłuste w 5% formaldehydzie w roztworze Ringera przez 20 minut przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Przemywać przez 5 minut 1% roztworem PBT (1% Triton x-100 w PBS). Powtórzyć ten krok przez 10 minut, a następnie po raz trzeci przez 45 minut.
1% Triton X-100 jest niezbędny do perforacji jajnika larwy w celu umożliwienia penetracji przeciwciał.</li>
	<li>Inkubować w bloku z 0,3% PBTB (0,3% Triton x-100 i 1% BSA w PBS) przez 1 godzinę przy delikatnym mieszaniu</li>
	<li>Inkubować z pożądanym 1st przeciwciało rozcieńczone w 0,3% PBTB przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym mieszaniu. Krok ten wykonuje się zazwyczaj w probówkach 0,2 ml na mieszalniku obrotowym.</li>
	<li>Przenieść ciałka tłuszczowe z powrotem do sitek komórkowych.</li>
	<li>Przemyć 3 razy, po 30 minut każde pranie, w 0,3% PBTB przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Blokować w 0,3% PBTB z dodatkiem 5% normalnego surowicy osła przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Inkubować z odpowiednim przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym (zgodnie ze specyfikacją producenta) w roztworze blokującym (0,3% PBTB z dodatkiem 5% normalnego surowicy osła w 0,3% PBT) przez 2 godziny przy delikatnym mieszaniu. Jeśli przeciwciało jest fluorescencyjne, od tego momentu inkubację należy prowadzić w ciemności. Krok ten wykonuje się zazwyczaj w probówkach o pojemności 0,2 ml na rotatorze.</li>
	<li>Przemyć 3 razy przez 30 minut każdy z użyciem 0,3% PBT przy łagodnym mieszaniu.</li>
</ol>
5. Montowanie preparatu
<ol>
 <li>Przenieś ciało tłuszczowe do czystej probówki typu Eppendorf. Bardzo ostrożnie usuń wszystkie ciecze i natychmiast przykryj próbkę medium montażowym Vectashield. Stosujemy Vectashield rutynowo, ponieważ nie twardnieje on podczas oddzielania jajników od ciała tłuszczowego.
 Próbki można przechowywać w medium montażowym w temperaturze 4°C do tygodnia.
</li>
	<li>Odetnij koniec końcówki pipety i użyj jej do ostrożnego przeniesienia ciała tłuszczowego wraz z minimalną objętością medium montażowego (około 30 μl dla szkiełka nakrywkowego o średnicy 30 mm) na szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Użyj dwóch niklowanych uchwytów do szpilek z igłami o średnicy 0,1 mm, aby rozłożyć ciało tłuszczowe. Jajniki znajdują się w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Ciało tłuszczowe je otaczające ma zazwyczaj kształt „kwiatu”, co ułatwia zlokalizowanie jajników. Wypreparuj „kwiaty” z pozostałej części ciała tłuszczowego, a tę drugą odrzuć.</li>
	<li>Usuń ciało tłuszczowe otaczające gonadę, ostrożnie krzyżując nad nią dwie szpilki. Umieść wyizolowaną gonadę na szkiełku w pewnej odległości od pozostałości ciała tłuszczowego.</li>
	<li>Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i zabezpiecz lakierem do paznokci.</li>
	<li>Wykonaj wizualizację bezpośrednio przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Próbki można przechowywać w temperaturze 4°C do trzech tygodni.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Powyższy protokół został przez nas wykorzystany do śledzenia powstawania kilku linii komórkowych w obrębie somatycznej tkanki jajnika, w tym GSCs oraz ich nisz somatycznych. W tym celu stosujemy specyficzne przeciwciała i markery, aby odróżnić poszczególne typy komórek w rozwijającym się gonadzie. Poniżej przedstawiamy przykład dwóch jajników LL3 barwionych różnymi kombinacjami przeciwciał. Rycina 1A uwypukla komórki filamentu terminalnego oraz komórki czepka (zielone), które wspólnie tworzą somatyczne komórki niszy. Rycina 1B przedstawia komórki przeplatające (ICs, magenta), które bezpośrednio kontaktują się z komórkami linii zarodkowej (niebieskie).
<img src="/files/ftp_upload/2537/2537fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej, analiza struktury komórkowej, lokalizacja białek w przekroju tkanki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. jajniki LL3. (A) przeciwciało monoklonalne 1B1 (magenta) obrysowuje komórki somatyczne i barwi fusom, wewnątrzkomórkowy organellum w PGC (strzałki). Pułapka wzmacniacza hh-lacZ (anty-β-galaktozydaza, zielony) jest wyrażana w filamentach terminalnych. U podstawy filamentu można zaobserwować somatyczne komórki czepne (groty strzałek). (B) przeciwciało 1B1 (zielony) obrysowuje wszystkie komórki somatyczne w jajniku. Anti-Vasa (niebieski) znakuje wszystkie PGC. PGC pozostają w bezpośrednim kontakcie z komórkami Intermingled (ICs, anti-traffic jam, magenta). Pasek skali (dla A i B) wynosi 20 μm.

<ol><li>Fuller, M. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+Drosophila+germline+stem+cells%3A+two+versions+of+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality.</a> Science. 316, 402-404 (2007).</li>
<li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Chen, D., McKearin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+circuitry+controlling+a+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene circuitry controlling a stem cell niche.</a> Curr Biol. 15, 179-184 (2005).</li>
<li>Kai, T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+empty+Drosophila+stem+cell+niche+reactivates+the+proliferation+of+ectopic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).</li>
<li>Kai, T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+germ+cells+can+revert+into+functional+stem+cells+in+Drosophila+melanogaster+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries.</a> Nature. 428, 564-569 (2004).</li>
<li>Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak%2FStat+signalling+in+niche+support+cells+regulates+dpp+transcription+to+control+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary.</a> Development. 135, 533-540 (2008).</li>
<li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li>
<li>Tazuke, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+germline-specific+gap+junction+protein+required+for+survival+of+differentiating+early+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells.</a> Development. 129, 2529-2539 (2002).</li>
<li>Xie, T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((decapentaplegic+is+essential+for+the+maintenance+and+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Cell. 94, 251-260 (1998).</li>
<li>Xie, T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+niche+maintaining+germ+line+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary.</a> Science. , 290-328 (2000).</li>
<li>Guo, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glypican+Dally+is+required+in+the+niche+for+the+maintenance+of+germline+stem+cells+and+short-range+BMP+signaling+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary.</a> Development. 136, 3627-3635 (2009).</li>
<li>Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagens+regulate+BMP+signalling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila.</a> Nature. 455, 72-77 (2008).</li>
<li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li>
<li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovary+morphogenesis%3A+analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental biology. 170, 127-135 (1995).</li>
<li>Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+germline+stem+cell+niche+formation+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary.</a> 134, 1071-1080 (2007).</li>
<li>Zhu, C. H., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansion+of+ovarian+germline+stem+cells+during+niche+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila.</a> Development. 130, 2579-2588 (2003).</li>
<li>Ward, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+signal+to+the+niche+through+the+Notch+pathway+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary.</a> Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).</li>
<li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+primordial+germ+cell+differentiation+parallels+germ+line+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance.</a> Curr Biol. 14, 981-986 (2004).</li>
<li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+coordinate+homeostasis+and+growth+in+the+Drosophila+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad.</a> Nature. 443, 97-100 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół izolacji i barwienia jajników larw w późnym trzecim stadium rozwojowym. Aby rutynowo i rzetelnie przeprowadzać ten protokół, należy zwrócić uwagę na następujące kwestie:
<ol>
	<li>W przypadku larw zsynchronizowanych i dobrze rozwiniętych należy unikać przepełnienia naczyń.</li>
	<li>Aby zapobiec utracie małych, przezroczystych jajników, należy upewnić się, że ciało tłuszczowe zostało wypreparowane w całości. Ułatwi to również lokalizację jajników na etapie montowania, szcz...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>JT Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina wołowa frakcja V</td><td>MP Biomedicals</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta biologiczna Dumont 5 dumstar polerowana</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt do szpilek</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki s.s minutien średnica 0,1 mm, długość 10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 9-dołkowe 85X100 mm, śr. zew. 22 mm x głębokość 7 mm</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop MZ 16.5 ze standardową podstawą do oświetlenia przechodzącego TL ST</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki</td><td>Menzel-Glaser</td><td>798</td><td></td></tr><tr><td>Osłonki szkieł poglądowych</td><td>Corning</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Vectashield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek</td><td>Falcon BD</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 1B1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Traffic Jam</td><td>Laboratory of Dr. Dorothea Godt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vasa</td><td>Laboratory of Dr. Ruth Lehmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti &amp;#946;-Galaktozydaza</td><td>Cappel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disekcja i barwienie jajników larw drosophila

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Wiele narządów zależy od komórek macierzystych w procesie rozwoju podczas embriogenezy oraz w procesach utrzymania lub naprawy w życiu dorosłym. Zrozumienie sposobu formowania się komórek macierzystych oraz ich interakcji z otoczeniem jest zatem kluczowe dla zrozumienia rozwoju, homeostazy i chorób. Jajnik muszki owocówki Drosophila melanogaster służy jako wpływowy model interakcji komórek macierzystych linii zarodkowej (GSCs) z ich somatycznymi komórkami wspierającymi (niszą) 1, 2. Znana lokalizacja niszy i GSCs, w połączeniu z możliwością ich manipulacji genetycznej, pozwoliła badaczom wyjaśnić szereg interakcji między komórkami macierzystymi a ich niszami 3-12.
Mimo bogactwa informacji na temat mechanizmów kontrolujących utrzymanie i różnicowanie GSC, stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak GSC i ich nisze somatyczne formują się podczas rozwoju. Około 18 nisz somatycznych, których skład komórkowy obejmuje włókno końcowe oraz komórki czepne (Rysunek 1), powstaje podczas trzeciego stadium larwalnego 13-17. GSC pochodzą z pierwotnych komórek płciowych (PGCs). PGCs proliferują we wczesnych stadiach larwalnych, jednak po sformowaniu niszy podgrupa PGCs przekształca się w GSCs 7, 16, 18, 19. Razem komórki niszy somatycznej i GSCs tworzą jednostkę funkcjonalną, która produkuje jaja przez cały okres życia organizmu.
Wiele pytań dotyczących formowania się jednostki GSC pozostaje bez odpowiedzi. Procesy takie jak koordynacja między komórkami prekursorowymi nisz a prekursorami komórek macierzystych lub generowanie asymetrii w PGC w momencie przekształcania się w GSC, można najlepiej badać w larwie. Jednak systematyczne badanie rozwoju jajników larwalnych jest trudne pod względem technicznym. Po pierwsze, jajniki larwalne są małe. Nawet w późnych stadiach larwalnych ich średnica wynosi zaledwie 100μm. Dodatkowo jajniki są przezroczyste i zatopione w białym ciele tłuszczowym. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół izolacji jajników z larw Drosophila w późnym trzecim stadium (LL3), a następnie ich barwienia przeciwciałami fluorescencyjnymi. Proponujemy rozwiązania techniczne dla takich problemów jak lokalizacja jajników, barwienie i przemywanie tkanek, które nie opadają na dno, oraz zapewnienie penetracji przeciwciał do wnętrza tkanki. Protokół ten można zastosować również do wcześniejszych stadiów larwalnych oraz do jąder larwalnych.

Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).

Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Wiele organów zależy od komórek macierzystych w procesie swojego rozwoju podczas embriogenezy oraz w celu utrzymania funkcji lub regeneracji w życiu dorosłym. Zrozumienie, w jaki sposób komórki macierzyste ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wyizolowanych jajników z późnego trzeciego stadium larwalnego muszek Drosophila za pomocą mikroskopu konfokalnego. Jest to realizowane poprzez wstępną selekcję larw żeńskich z zsynchronizowanej populacji. Drugim krokiem procedury jest wypreparowanie nienaruszonego ciała tłuszczowego, oddzielenie go od jelita i kutykuli oraz umieszczenie go na lodzie.Trzecim krokiem procedury jest utrwalenie, barwienie i przemycie ciał tłuszczowych z zatopionymi w nich jajnikami. Ostatnim krokiem procedury jest oddzielenie jajników od ciał tłuszczowych podczas montowania preparatu. W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące specyficzne barwienie komórkowe w mikroskopii immunofluorescencyjnej.Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ precyzyjne preparowanie i montowanie wymagają dużej wprawy. Na pięć dni przed sekcją należy dodać drożdże do świeżej fiolki o pojemności 25 mm z pożywką dla muszek. Do fiolki należy umieścić od siedmiu do 16 zapłodnionych samic muszki owocówki.Pozostaw samice do składania jaj przez dwie do czterech godzin lub do momentu, aż w każdej fiolce znajdzie się około 30 jaj. Inkubuj fiolki z j

dissection-and-staining-of-drosophila-larval-ovaries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Ten film opisuje ogólną anatomię jajnika Drosophila i przedstawia metodę preparowania jajników do obrazowania na żywo lub stałego.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Rozwarstwienie jajników: technika przygotowania tkanek ex vivo

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Przedstawione tutaj są szczegółowe metody preparowania i barwienia kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila przy użyciu BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów.

Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila.

Wizualizacja wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na komory jajowe Drosophila za pomocą obrazowania na żywo

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Poznaj technikę rozwarstwiania i barwienia jajników larw Drosophila w celu wizualizacji komórek macierzystych linii płciowej. Ta metoda pozwala szczegółowo badać biologię rozwojową i formowanie nisz somatycznych.

Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów