Name: Zastosowanie systemu wiszącego ciężaru do izolowanej niedrożności tętnicy nerkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę izolowanej niedrożności tętnicy nerkowej u myszy przy użyciu systemu wiszącego ciężaru. Ta technika umożliwia badanie ostrego uszkodzenia nerek poprzez pomiar filtracji kłębuszkowej za pomocą inuliny FITC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badania były finansowane z grantów Narodowych Instytutów Zdrowia USA (National Institutes of Health) nr R01-HL092188, R01-DK083385 oraz R01HL098294, grantów Foundation for Anesthesia Education and Research (FAER) przyznanych HKE, grantu FAER przyznanego JYD oraz stypendium badawczego DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) (GR2121/1-1) przyznanego AG.

Uwagi ogólne. Wszystkie czynności powinny być wykonywane pod stereomikroskopem (Leica) przy użyciu koagulatora chirurgicznego. Myszy w grupach doświadczalnych powinny być dobrane pod względem wieku i masy ciała, aby zapewnić porównywalność wyników. Temperatura, ciśnienie krwi, znieczulenie oraz podawanie płynów powinny być stabilne i monitorowane podczas eksperymentu.
1. Znieczulenie i operacja
<ol>
	<li>Eksperymenty nad niedokrwieniem nerek można przeprowadzić albo poprzez jednoczesne zastosowanie niedokrwienia i reperfuzji w obu nerkach, albo po nefrektomii jednostronnej w połączeniu z leczeniem niedokrwiennym pozostałej nerki. Ponieważ obustronne niedokrwienie obu nerek wiąże się z większymi trudnościami technicznymi, bardziej złożonym ustawieniem eksperymentalnym i dłuższą operacją, przeprowadzimy nefrektomię prawą, a następnie zastosujemy leczenie niedokrwienne pozostałej lewej nerki, wykorzystując system obciążników wiszących. System ten wykorzystano również do zamknięcia tętnicy wieńcowej w sercu. Procedura ta jest jednak inna, ponieważ tętnicę nerkową można wyizolować z otaczających tkanek, podczas gdy tętnica wieńcowa znajduje się wewnątrz mięśnia sercowego.</li>
 <li>Myszy (w wieku 8-14 tygodni, obu płci) zostaną poddane znieczuleniu pentobarbitalem w dawce 70 mg/kg. Znieczulenie będziemy podtrzymywać dawką ok. 10 mg/kg/h pentobarbitalu sodowego. Przedawkowanie może znacznie obniżyć ciśnienie krwi, a tym samym zmienić wyniki. W naszych wstępnych badaniach stosowaliśmy również ketaminę i ksylazynę. Związki te wywołały jednak silną bradykardię (150 /min). Poza zaobserwowaną bradykardią istnieją dowody na to, że oba związki biorą udział w mechanizmach ochronnych podczas niedokrwienia. Środki znieczulające lotne również nie mogą być stosowane ze względu na ich zdolność do wywoływania ochrony nerek oraz niskie ciśnienie krwi. Dlatego naszym ostatecznym wyborem środka znieczulającego był pentobarbital. Dodatkowo ketamina i ksylazyna są wydalane głównie przez nerki. Nefrektomia i niedokrwienie mogą przedłużyć działanie znieczulenia ketaminą.</li>
 <li>Po ustąpieniu odruchów bólowych (sprawdzanych poprzez ściskanie palców u stóp pęsetą) myszy zostaną umieszczone na stole grzewczym z kontrolą temperatury (RT, Effenberg, Monachium, Niemcy, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37,0°C) w pozycji bocznej lewej.</li>
 <li>Przymocować kończyny dolne i górne do stołu za pomocą taśmy.</li>
 <li>W przypadku operacji bez przeżycia, takich jak pokazane na demonstracji wideo, należy pokryć obszar nacięcia olejem mineralnym, aby zapobiec wdychaniu sierści myszy podczas nacinania skóry, a tym samym uniknąć ryzyka wystąpienia alergii na sierść mysią. W przypadku eksperymentów z przeżyciem wymagane jest stosowanie odpowiednich technik aseptycznych, w tym strzyżenia sierści, dezynfekcji skóry jodoforami (np. Betadine), sterylnego obchodzenia się z autoklawowanymi instrumentami oraz stosowania masek i sterylnych rękawiczek przez chirurga. Oleju mineralnego nie stosuje się w operacjach z przeżyciem. W operacjach z przeżyciem stosuje się sterylny NaCl</li>
 <li>Nacięcie prawego boku zostanie wykonane nożyczkami i elektrodą koagulacyjną (Erbe, ICC50, Niemcy), aby zapobiec krwawieniu z naczyń mięśniowych i skórnych. W przeciwieństwie do dostępu do nerek poprzez laparotomię pośrodkową, technika ta nie wymaga dostępu do jamy otrzewnej.</li>
 <li>Pień nerkowy, obejmujący tętnicę nerkową i żyłę nerkową, zostaje podwiązany jedwabną nicią 4/0, a prawą nerkę wycina się nożyczkami, nie naruszając naczyń nadnerczowych.</li>
 <li>Ranę operacyjną zamyka się szwem ciągłym (dwa ściegi) ściany mięśniowej i skóry nicią 4/0.</li>
 <li>Zwierzęta zostają następnie ułożone w pozycji bocznej prawej i wykonuje się nacięcie lewego boku.</li>
 <li>Lewą nerkę ostrożnie oddziela się od tkanek łącznych, unikając uszkodzenia nadnerczy i naczyń.</li>
 <li>Następnie nerkę obraca się stroną brzuszną dołu do kubka z lucytu. Kubek z lucytu powinien być wysterylizowany w przypadku operacji z przeżyciem. Biegun nerki jest ostrożnie wpychany do kubka z lucytu poprzez przytrzymanie otaczającej tkanki pęsetą. Następnie biegun jest ostrożnie wpychany do kubka z lucytu pęsetą. Nerkę należy utrzymywać w wilgoci i cieple za pomocą mokrego tamponu nasączonego wodą o temperaturze 37,0°C.</li>
 <li>Po odsłonięciu lewej nerki i umieszczeniu jej w kubku z lucytu, uchwyt nerki jest unieruchomiony od strony brzusznej, aby uzyskać napięcie naczyń nerkowych. Odpowiednie unieruchomienie jest ważne dla pomyślnego umieszczenia nici pod tętnicą nerkową. Następnie uchwyt nerki zostaje zamocowany i można łatwo zidentyfikować tętnicę nerkową, ponieważ przebiega ona nad żyłą nerkową.</li>
 <li>Tętnicę nerkową oddziela się od sąsiednich tkanek za pomocą cienkiej pęsety w pobliżu jej odejścia od aorty brzusznej. Tętnicę oddziela się od leżącej pod nią żyły za pomocą zakrzywionej pęsety w najwyższym punkcie.</li>
 <li>Jedwabną nić 8/0 (Ethicon, Norderstedt, Niemcy) umieszcza się pod tętnicą nerkową, używając jednej pęsety jako prowadnicy. Technika ta pozwala na przerwanie tylko przepływu krwi tętniczej do nerki bez uciskania żyły nerkowej, w przeciwieństwie do zaciskania pnia nerkowego.</li>
 <li>Nić zostaje nałożona na mały trzpień (może to być przygotowana szpilka angielska), a do każdego z końców przyczepia się obciążenie o masie ok. 1g (probówka eppendorfowska). Obciążenie można dostosować do wielkości nerki, wyjmując lub dodając wodę do probówek eppendorfowskich. Tętnica powinna być lekko odciągnięta do góry, tak aby krew nie przepływała przez tętnicę, ale bez nadmiernego rozciągania naczynia. Silne naprężenie tętnicy może spowodować uszkodzenie ściany naczyniowej z pogrubieniem ściany tętnicy i zmniejszoną reperfuzją.</li>
 <li>Gdy obciążniki wiszą swobodnie, tętnica nerkowa zostaje natychmiast zamknięta. Przeciwnie, gdy obciążniki są podparte, przepływ krwi do narządu zostaje natychmiast przywrócony. Skuteczność zamknięcia potwierdza zmiana koloru z czerwonego na biały.</li>
 <li>Można zastosować różne czasy niedokrwienia, zgodnie z wymogami eksperymentu. Pełna reperfuzja nastąpi w zależności od czasu trwania niedokrwienia. Czasy niedokrwienia do 45 minut pozwalają na odwracalne uszkodzenie nerek. W naszych ustawieniach eksperymentalnych stosowaliśmy niedokrwienie od 20 do 30 minut, co powoduje umiarkowane uszkodzenie nerek, pozwalając nam zaobserwować zarówno poprawę, jak i pogorszenie uszkodzenia nerek w zależności od szczepu myszy i zastosowanego leczenia.</li>
 <li>Po pełnej reperfuzji nerkę można wyjąć z kubka z lucytu. W tym celu uchwyt nerki zostaje zwolniony i napięcie nerki zostaje zniesione. Biegun szyjny zostaje delikatnie usunięty z kubka tępą pęsetą, a następnie natychmiast następuje biegun ogonowy.</li>
 <li>Mocowania (taśmy) myszy można zdjąć, a mysz można ułożyć w pozycji na plecach, np. w celu oznaczenia klirensu inuliną FITC.</li>
 <li>W wybranych zestawach eksperymentów ciśnienie krwi i tętno mogą być rejestrowane przez cały czas trwania procedury chirurgicznej. Pomiary ciśnienia krwi są uzyskiwane w sposób ciągły za pomocą cewnika w tętnicy szyjnej. W skrócie, tętnica szyjna zostaje odsłonięta poprzez tępą dyssekcję mięśni przytętniczych. Po dalszym odsłonięciu i uważnym unikaniu urazów tkanek (szczególnie nerwu błędnego), cewnik zostaje wprowadzony do naczynia przy użyciu dwóch szwów i małego zacisku. Ciśnienie krwi jest mierzone za pomocą elementu Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Szwajcaria).</li>
 <li>W celu oznaczenia klirensu inuliny znakowanej FITC, do lewej żyły szyjnej należy wprowadzić cewnik do infuzji chlorku sodu i inuliny znakowanej FITC. Ponadto należy wprowadzić cewnik pęcherzowy do czasowo zależnego zbierania moczu, co wyjaśniono szczegółowo poniżej.</li>
</ol>
2. Pomiar uszkodzenia nerek
<ol>
	<li>Ogólnie: W celu określenia stopnia uszkodzenia nerek po niedokrwieniu nerek zaleca się następujące parametry wynikowe: Należy przeprowadzić pomiar klirensu inuliny znakowanej FITC w celu oceny współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR). Alternatywnie można oznaczyć klirens kreatyniny oraz stężenie kreatyniny w surowicy podczas badania w klatkach metabolicznych 24 godziny po uszkodzeniu nerek. Należy wykonać barwienie nerek H&amp;E oraz test ELISA dla mieloperoksydazy (MPO) w celu oceny uszkodzeń nerek i stanu zapalnego 24 godziny po niedokrwieniu nerek. </li>
 <li>Badania w klatkach metabolicznych: 
 	<ol>
 <li>Po niedokrwieniu lewa nerka jest przywracana do pozycji zaotrzewnowej, a ranę zamyka się zgodnie z powyższym opisem.</li>
 <li>Na koniec zabiegu myszy otrzymują 0,3 ml soli fizjologicznej drogą IP i regenerują się przez 2 godziny pod lampą grzewczą. </li>
 <li>Następnie myszy umieszcza się w klatkach metabolicznych (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Niemcy) w celu oznaczenia parametrów czynności nerek w dwóch 24-godzinnych odstępach czasu. </li>
 <li>Pobór wody przez każdą mysz należy określić poprzez zważenie pustej i pełnej butelki z wodą przed podaniem myszy, a następnie po 24 godzinach ponownie ważąc pełną butelkę. Należy również określić masę ciała myszy.</li>
 <li>Po 24 godzinach pobiera się około 75μl krwi z splotu żylnego za gałką oczną za pomocą rurki kapilarnej pod krótkotrwałym znieczuleniem izofluranem.</li>
 <li>Funkcję nerek ocenia się poprzez pomiar stężenia kreatyniny w osoczu i moczu 24 godziny po niedokrwieniu nerek, stosując dostępną komercyjnie metodę kolorymetryczną zgodnie z protokołem producenta (LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Niemcy). Stężenia Na+ i K+ w osoczu i moczu oznacza się fotometrem emisyjnym z płomieniem (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy). Wartości wydalnicze i hemodynamiczne nerek oblicza się według standardowych wzorów15-17. </li>
 
 </ol>
 </li>
 <li>Klirens inuliny: Doświadczenia z klirensem FITC-inuliny przeprowadza się po niedokrwieniu nerek.
 	<ol>
 	<li>W lewej żyle szyjnej umieszcza się kaniulę do ciągłej infuzji. Po odseparowaniu żyły od sąsiadujących tkanek nożyczkami preparacyjnymi (Dumont, WPI) zawiązuje się dwa szwy (4/0) wokół żyły. Przed szwem proksymalnym na żyłę nakłada się zacisk, aby zatrzymać przepływ krwi. Następnie zawiązuje się węzeł dystalny i do jednego z końców szwu dystalnego przyczepia się obciążnik, aby napiąć żyłę. Jest to bardzo ważne dla prawidłowego wprowadzenia cewnika do żyły. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się niewielki otwór w żyle. Otwór przytrzymuje się cienką pęsetą (Dumont, WPI) i wprowadza cewnik do żyły. Aby przesunąć cewnik, należy zdjąć zacisk. Należy upewnić się, że cewnik nie jest napięty, tak aby można go było ułożyć bez podtrzymywania. Następnie zamyka się drugi szew proksymalny nad żyłą i cewnikiem.</li>
 <li>W pęcherzu moczowym umieszcza się cewnik do czasowego zbierania moczu. W tym celu wykonuje się krótkie nacięcie skóry nad pęcherzem. Ostrożnie wypreparowuje się pęcherz przez otwór w skórze. Pęcherz stabilizuje się wilgotną chusteczką. Nad pęcherzem umieszcza się przygotowany szew (4/0). </li>
 <li>Odcina się krótki fragment cewnika (1,5cm) i podgrzewa jeden koniec, aby utworzyć pierścień wokół cewnika, co ułatwia jego mocowanie w pęcherzu. </li>
 <li>Wykonuje się otwór w górnej części pęcherza. Nacięcie należy wykonać pomiędzy naczyniami, aby zapobiec krwawieniu. Szeroki koniec cewnika wprowadza się do pęcherza, a następnie zaciska szew nad cewnikiem i pęcherzem.</li>
 <li>Wszystkie myszy otrzymują bolus 0,85% roztworu chlorku sodu w ilości odpowiadającej 20% masy ciała. Ciągłą infuzję prowadzi się w tempie 80ul/h/25g masy ciała, a do infuzji dodaje się FITC-inulinę w celu oceny współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) całej nerki. Po 20-minutowej stabilizacji zwierząt wykonuje się 20-minutowe okresy zbierania moczu (cztery razy) w celu oznaczenia tempa przepływu moczu i poziomu FITC-inuliny. Krew pobiera się w połowie każdego okresu w celu pomiaru FITC-inuliny.</li>
 <li>Podczas rozpoczynania 20-minutowych okresów zbierania należy używać czasomierza. Mocz zbiera się, umieszczając koniec cewnika pęcherzowego w małej probówce Eppendorf. Waży się probówkę przed i po zbieraniu moczu, aby określić jego ilość. Próbki krwi pobiera się drogą retroorbitalną z splotu żylnego za pomocą rurek kapilarnych w połowie każdego okresu zbierania.</li>

 </ol>
 
 
 </li>
 <li>Krew i nerki można pobrać po każdej procedurze do dalszych analiz, np. testu ELISA dla MPO, testu ELISA dla cytokin, badania histologicznego.</li>
 
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:


<img src="/files/ftp_upload/2549/2549fig1.jpg" alt="Schemat przepływu krwi w nerce; oznaczone tętnica i żyła nerkowa; przedstawia drogę krążenia krwi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Model systemu z obciążeniem zwisającym do wywoływania niedokrwienia nerek: Opracowano system z obciążeniem zwisającym w celu wywołania niedokrwienia lewej nerki. W tym celu pod tętnicę nerkową wprowadzono szew nylonowy 8.0, a do końca każdego szwu przymocowano niewielkie obciążenie (1 g). Taki projekt eksperymentalny umożliwia odwracalne zamknięcie tętnicy nerkowej poprzez nakładanie i zdejmowanie obciążenia.

<ol><li>Abuelo, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normotensive+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Normotensive ischemic acute renal failure.</a> N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).</li>
<li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure.</a> N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).</li>
<li>Lameire, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of acute renal failure.</a> Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).</li>
<li>Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+aortic+cross-clamping+and+unclamping%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping.</a> Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).</li>
<li>Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+and+chronic+kidney+disease+following+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Hemodial+Int%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation.</a> Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).</li>
<li>Schrier, R. W., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure and sepsis.</a> N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).</li>
<li>Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reno-Vascular+A2B+Adenosine+Receptor+Protects+the+Kidney+from+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia.</a> PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).</li>
<li>Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+E-NTPDase1+%28CD39%29+to+renal+protection+from+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury.</a> FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).</li>
<li>Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+ecto-5%27-nucleotidase+%28CD73%29+in+renal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia.</a> J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).</li>
<li>Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+inflammation+in+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Mediators of inflammation in acute kidney injury.</a> Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).</li>
<li>Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+CD4+T-cell+depletion+is+not+sufficient+to+prevent+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure.</a> Transplantation. 80, 643-649 (2005).</li>
<li>Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+from+proximal+tubules+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).</li>
<li>Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+delayed+renal+protection+against+renal+ischemia+and+reperfusion+injury+with+A1+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).</li>
<li>Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+hanging-weight+system+for+isolated+renal+artery+occlusion+during+ischemic+preconditioning+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).</li>
<li>Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).</li>
<li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podsumowując, niniejsze badanie opisuje nową technikę wywoływania niedokrwienia nerek w modelu mysim z wykorzystaniem systemu obciążenia wiszącego do zamknięcia tętnicy nerkowej. Badanie to wykazuje wysoką powtarzalność urazu, co pozwala zminimalizować zmienność związaną z zaciskaniem pieńka nerkowego.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td>V.P.L. 9372</td><td>4mg/mL w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, jedwab 4.0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, Prolene 8.0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>M8739</td><td>wielorazowe</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>n/a</td><td>uwzględnić dużą odległość roboczą</td></tr><tr><td>Stół grzejny</td><td>Rt, Effenberger, Germany</td><td>n/a</td><td>wyłączny i jedyny dostawca</td></tr><tr><td>Instrumenty chirurgiczne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>precyzyjne nożyczki do mikrotnaciń</td></tr></tbody></table>

zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

U pacjentów hospitalizowanych ponad 50% przypadków ostrego uszkodzenia nerek (AKI) jest spowodowanych niedokrwieniem nerek 1-3. Niedawne badanie pacjentów hospitalizowanych wykazało, że nawet niewielki wzrost poziomu kreatyniny w surowicy (z 0,3 do 0,4 mg/dl) wiąże się z 70-procentowo wyższym ryzykiem zgonu w porównaniu z osobami bez żadnego wzrostu 1. W związku z tym zabiegi chirurgiczne wymagające zacisków na aorcie i naczyniach nerkowych wiążą się z częstością występowania niewydolności nerek sięgającą 30% 4. Podobnie AKI po operacjach kardiochirurgicznych występuje u ponad 10% pacjentów w normalnych warunkach i wiąże się z gwałtownym wzrostem śmiertelności. AKI są również częstymi powikłaniami po transplantacji wątroby. Co najmniej 8-17% pacjentów wymaga w efekcie terapii nerkozastępczej 5. Ponadto opóźnione funkcjonowanie przeszczepu z powodu uszkodzenia komórek kanalikowych podczas transplantacji nerki jest często powiązane z AKI indukowanym niedokrwieniem 6. Co więcej, AKI występuje u około 20% pacjentów cierpiących na sepsę 6. Występowanie AKI wiąże się z drastycznym wzrostem zachorowalności i śmiertelności 1. Podejścia terapeutyczne są bardzo ograniczone, a większość badań interwencyjnych w AKI u ludzi zakończyła się niepowodzeniem. Dlatego pilnie potrzebne są dodatkowe metody terapeutyczne w celu zapobiegania uszkodzeniu nerek w wyniku niedokrwienia 3, 7-9.
W celu wyjaśnienia mechanizmów uszkodzenia nerek spowodowanego niedokrwieniem oraz możliwych strategii terapeutycznych, intensywnie potrzebne są modele mysie 7-13. Modele mysie umożliwiają wykorzystanie różnych modeli genetycznych, w tym myszy z ukierunkowaną modyfikacją genów oraz myszy z tkankowo specyficzną modyfikacją genów (system cre-flox). Jednakże indukowanie niedokrwienia nerek u myszy jest trudne technicznie, a szczegóły eksperymentalne znacząco wpływają na wyniki. Przeprowadziliśmy systematyczną ocenę nowego modelu izolowanego zamknięcia tętnicy nerkowej u myszy, który specjalnie pozwala uniknąć stosowania zacisków lub szycia pieńków nerkowych 14. Model ten wymaga nefrektomii prawej nerki, ponieważ ze względu na ustawienie eksperymentalne niedokrwienie może być wywołane tylko w jednej nerce. W rzeczywistości, dzięki zastosowaniu systemu z obciążeniem zwisającym, tętnica nerkowa jest poddawana manipulacji instrumentalnej tylko raz podczas całej procedury chirurgicznej. Ponadto, przy zastosowaniu tej techniki nie dochodzi do niedrożności żylnej ani cewki moczowej. Wykazaliśmy zależne od czasu i dawki oraz wysoce powtarzalne uszkodzenie nerek w wyniku niedokrwienia, mierząc poziom kreatyniny w surowicy. Co więcej, w porównaniu tego nowego modelu z konwencjonalnym zaciskaniem całego pieńka, ochrona nerek poprzez prekondycjonowanie niedokrwienne jest bardziej wyraźna i wiarygodna. W związku z tym ta nowa technika może być użyteczna dla innych badaczy pracujących w dziedzinie ostrego uszkodzenia nerek.

Precyzyjny mysi model ostrego uszkodzenia nerek (AKI) wywołanego niedokrwieniem jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia nerek i potencjalnego poszukiwania środków terapeutycznych do leczenia uszkodzeń nerek. System obciążników wiszących zapewnia narzędzie do natychmiastowej i niezawodnej okluzji oraz reperfuzji tętnicy nerkowej bez powodowania zastoju nerkowego.

Zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

U pacjentów hospitalizowanych ponad 50% przypadków ostrego uszkodzenia nerek (AKI) jest spowodowanych niedokrwieniem nerek 1-3. Niedawne badanie pacjentów hospitalizowanych ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie niedokrwienia u myszy w celu zbadania ostrego uszkodzenia nerek. Osiąga się to poprzez uprzednie wycięcie, a następnie usunięcie prawej nerki. Drugim krokiem jest przygotowanie i umieszczenie nerki w uchwycie z pleksiglasu.Następnie, w celu wywołania niedokrwienia, do wyizolowanej tętnicy nerkowej zastosowano system obciążenia zwisającego. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące łagodny lub ciężki uszczerbek nerek po niedokrwieniu, mierząc funkcję nerek poprzez klirens inuliny FITC. Ten system obciążenia zwisającego do wywoływania niedokrwienia nerek może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ostrego i przewlekłego uszkodzenia nerek spowodowanego niedokrwieniem.Procedurę zaprezentuje Alexander Barla, student medycyny z University of Pennsylvania, który w tym roku prowadzi w naszym laboratorium badania nad uszkodzeniem nerek, oraz Douglas Ard, asystent naukowy pracujący również w naszej grupie. Chociaż niedokrwienie nerek można przeprowadzić jednocześnie w obu nerkach, w niniejszym materiale zaprezentowano prostszą metodę polegającą na usunięciu prawej nerki, a następnie zastosowaniu leczenia niedokrwiennego w pozostałej lewej nerce.Na początek umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanym stole w lewej pozycji bocznej. Przymocuj kończyny dolne i górne do stołu za pomocą taśmy. Oczyść skórę i pokryj obszar nacięcia olejem mineralnym, aby zapobiec wdychaniu sierści myszy i zmniejszyć ekspozycję na alergeny.Wykonaj nacięcie skóry w obrębie prawego boku i przetnij ścianę mięśniową za pomocą elektrody koagulacyjnej, aby zapobiec krwawieniu. Podwiąż pień nerkowy, w tym tętnicę nerkową i żyłę nerkową, używając szwu jedwabnego. Wycięcie prawej nerki wykonaj za pomocą nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić naczyń nadnerczy.Użyj szwów, aby zamknąć ścianę mięśniową, a następnie skórę. Po zamknięciu pierwszej rany ułóż zwierzę w pozycji bocznej prawej. Wykonaj nacięcie nad lewym bokiem i uwidocznij lewą nerkę.Ostrożnie oddziel lewą nerkę od tkanek łącznych, unikając uszkodzenia nadnerczy i naczyń krwionośnych. Kolejnym krokiem jest obrócenie nerki stroną brzuszną do kubka z Lucydy. Aby to osiągnąć, należy przytrzymać otaczającą tkankę pęsetą, jednocześnie ostrożnie wpychając dolny biegun nerki do kubka.Następnie za pomocą pęsety wsuń górny biegun nerki do kubka. Aby nerka pozostała wilgotna i ciepła przez cały czas trwania procedury, używaj patyczków bawełnianych nasączonych solą fizjologiczną o temperaturze 37 °C. Po umieszczeniu nerki w kubku, uchwyt do nerki zostaje unieruchomiony od strony brzusznej.Aby zachować napięcie naczyń nerkowych, przymocuj uchwyt do nerki w taki sposób, aby tętnica nerkowa była łatwo widoczna nad żyłą nerkową. Odizoluj tętnicę nerkową od sąsiednich tkanek i naczyń za pomocą cienkich pęset. Ostrożnie oddziel tętnicę od znajdującej się pod nią żyły.Następnie, używając pęsety, umieść szew jedwabny o rozmiarze 7-0 pod tętnicą nerkową. W celu stabilizacji przymocuj obciążnik o masie około 1 g do każdego końca nici i przeprowadź końce szwów przez mały pręcik. Przy swobodnie zwisających obciążnikach tętnica nerkowa powinna zostać zamknięta.Pomyślną okluzję potwierdza zmiana koloru z czerwonego na blady. Czas trwania niedokrwienia zależy od badania. W tym przypadku okres niedokrwienia trwa 30 minut, po czym ciężarki zostają zdjęte i dopuszcza się czas reperfuzji od 30 do 60 minut.Po reperfuzji zwolnij naciąg uchwytu do nerki i ostrożnie przesuń nerkę z kubeczka z powrotem do organizmu zwierzęcia. Aby określić zakres uszkodzenia nerki, jedną godzinę po niedokrwieniu nerek można zmierzyć klirens inuliny FITC w celu oceny wskaźnika filtracji kłębuszkowej. Pierwszym krokiem jest kaniulacja lewej żyły szyjnej w celu ciągłej infuzji chlorku sodu i inuliny znakowanej FITC. Po przygotowaniu zwierzęcia zgodnie z wcześniejszym opisem, wykonaj nacięcie wzdłuż szyi.Odizoluj ciemnoniebieską żyłę od otaczających tkanek. Zwiąż żyłę dwiema szwami 4 0 w odstępach około jednego centymetra. Załóż zacisk na żyłę przed szwem proksymalnym, aby zatrzymać przepływ krwi.Następnie zaciśnij węzeł dystalny i umieść obciążnik na dystalnym końcu szwu, aby utrzymać naciąg żyły, a za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielki otwór w żyle. Przytrzymaj otwór precyzyjną pęsetą podczas wprowadzania cewnika, następnie zdejmij zacisk, aby przesunąć cewnik dalej. Po umieszczeniu cewnika na miejscu, zawiąż drugi szew proksymalny nad żyłą i cewnikiem, aby umieścić cewnik pęcherzowy do czasowego zbierania moczu.Najpierw należy naciąć skórę nad pęcherzem. Następnie ostrożnie wyciągnąć pęcherz przez ten otwór. Po wyizolowaniu pęcherz należy zabezpieczyć wilgotną chusteczką i nałożyć na niego odcinek nici chirurgicznej.Odciąć krótki, 1,5 centymetrowy fragment cewnika i podgrzać jeden z jego końców, aby wygładzić krawędź i ułatwić wprowadzenie. Umieścić szew wokół pęcherza, a następnie wyciąć otwór pomiędzy naczyniami w górnej części pęcherza, aby zapobiec krwawieniu. Wprowadzić wygładzony koniec cewnika i zacisnąć szew, obejmując zarówno cewnik, jak i pęcherz.Po wprowadzeniu cewników należy utrzymać stałą prędkość infuzji na poziomie 800 µL na godzinę na 25 g masy ciała. Do infuzji dodaje się inulinę FITC w celu oceny całkowitego glomerularnego współczynnika filtracji nerek. Należy odczekać 20 minut do ustabilizowania stanu zwierzęcia przed pobraniem próbek. W czterech 20-minutowych odstępach czasu należy zebrać mocz, umieszczając końcówkę cewnika pęcherzowego w małej probówce typu Eppendorf.Zapisz masę probówki przed i po pobraniu. Aby określić ilość moczu, pobierz próbkę krwi z splotu żylnego zaocznego w połowie każdego przedziału czasowego w celu pomiaru FITC inuliny; jako alternatywę dla pomiaru klirensu inuliny poprzez bezpośrednią kanulację, klirens kreatyniny oraz poziom kreatyniny w surowicy można zmierzyć z wykorzystaniem klatek metabolicznych. Po powrocie do sprawności po uszkodzeniu nerek, myszy umieszczono w klatkach metabolicznych w celu oceny funkcji nerek.Parametry dla 24 godzin: zważ każdą butelkę z wodą przed umieszczeniem jej w klatce. Waga ta zostanie wykorzystana później do określenia ilości zużytej wody podczas badania. Zważ butelki z wodą i odejmij tę wagę od wagi początkowej, aby określić ilość zużycia. Funkcję nerek można ocenić, mierząc poziomy kreatyniny, sodu i potasu w osoczu oraz moczu w różnych punktach czasowych po niedokrwieniu.Po zastosowaniu tej procedury można zmierzyć poziomy cytokin, aby określić stopień stanu zapalnego po ostrym niedokrwieniu nerek.

use-of-a-hanging-weight-system-for-isolated-renal-artery-occlusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie systemu z ważącym zawieszeniem w izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

Mysi model niedokrwienia mięśnia sercowego i prekondycjonowania niedokrwiennego jest ważnym narzędziem do badania mechanizmów kardioprotekcyjnych in vivo. W niniejszej pracy przedstawiamy łatwy w zastosowaniu model in situ dla IP serca, wykorzystujący system obciążników wiszących do okluzji tętnicy wieńcowej.

Zastosowanie systemu obciążników wiszących do okluzji tętnicy wieńcowej u myszy

Opracowaliśmy nowy mysi model systemu obciążnika wiszącego do zamykania zatoki wrotnej. Technika ta może być użyteczna w przyszłych badaniach nad niedokrwieniem w mysich modelach wątroby.

Zastosowanie systemu z obciążnikiem wiszącym do indukowania niedokrwienia wątroby u myszy

Ten film przedstawia procedurę odnerwienia współczulnego tętnicy nerkowej w mysim modelu nadciśnieniowym indukowanym angiotensyną II, wykorzystującą fenol do zakłócenia funkcji nerwu współczulnego i obniżenia ciśnienia krwi.

Współczulne unerwienie tętnic nerkowych w mysim modelu nadciśnienia indukowanego angiotensyną II

Opisano dwuetapową metodę leczenia przewlekłej choroby nerek (PChN) u szczura Lewisa poprzez chirurgiczne usunięcie 5/6 masy nerkowej. Połączenie zabiegu chirurgicznego, hamowania NOS i diety bogatej w sól prowadzi do powstania modelu przypominającego ludzką PChN, co pozwala na badanie mechanizmów przyczynowych i opracowywanie nowych interwencji terapeutycznych.

5/6 nefrektomia w połączeniu z dietą bogatą w sól i hamowaniem syntazy tlenku azotu w celu wywołania przewlekłej choroby nerek u szczura Lewisa

Enzymatyczne biosensory mikroelektrodowe umożliwiają pomiary w czasie rzeczywistym zewnątrzkomórkowej sygnalizacji komórkowej w biologicznie istotnych stężeniach.  Poniższe protokoły rozszerzają zastosowania bioczujników na wykrywanie ex vivo i in vivo ATP iH2O2w nerkach.

Zastosowanie biosensorów enzymatycznych do ilościowego oznaczania endogennego ATP lubH2O2w nerkach

Mysia izolowana perfundowana nerka (MIPK) to technika utrzymywania nerki myszy w warunkach ex vivo w stanie perfundowanym i funkcjonalnym przez 1 godzinę. i technika chirurgiczna są szczegółowo opisane.

Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy

Zmodyfikowany model myszy Goldblatt z 2 nerkami i klipsem (2K1C) został opracowany przy użyciu rurki poliuretanowej do zainicjowania zwężenia tętnicy nerkowej, wywołując wzrost ekspresji reniny i uszkodzenie nerek. W tym miejscu opisujemy szczegółową procedurę przygotowania i umieszczenia mankietu na tętnicy nerkowej w celu wygenerowania powtarzalnego i spójnego modelu myszy 2K1C.

Zmodyfikowany mysi model regulacji reniny w zwężeniu tętnicy nerkowej z jedną nerką i jednym klipsem

To badanie przedstawia wysoce powtarzalny duży model zwierzęcy uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek u świń przy użyciu tymczasowego przezskórnego obustronnego niedrożności tętnic nerkowych za pomocą cewnika balonowego na 60 minut i reperfuzji przez 24 godziny.

Duży model zwierzęcy ostrego uszkodzenia nerek przez tymczasowe obustronne zamknięcie tętnicy nerkowej

To badanie ustaliło protokół skupiający się na technicznym udoskonaleniu mysiego modelu obustronnego niedokrwienia nerek i reperfuzji do badań nad ostrym uszkodzeniem nerek.

Techniczne udoskonalenie obustronnego mysiego modelu niedokrwienia i reperfuzji nerek do badań nad ostrym uszkodzeniem nerek

Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje, które umożliwią badaczom wykonanie odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu u myszy przy użyciu ustandaryzowanego modelu, który umożliwia analizę długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużonej niedrożności moczowodu.

Mysi model do oceny długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużającej się jednostronnej niedrożności moczowodu

W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji i oceny funkcjonalnej ludzkich gałęzi tętnic nerkowych, ułatwiający badania przedkliniczne w celu opracowania farmaceutycznego.

Wielopoziomowa mikrodysekcja i profilowanie funkcjonalno-strukturalne gałęzi tętniczych ludzkiego nerki

Poznaj metodę izolowanej niedrożności tętnicy nerkowej u myszy przy użyciu systemu wiszącego ciężaru. Ta technika umożliwia badanie ostrego uszkodzenia nerek poprzez pomiar filtracji kłębuszkowej za pomocą inuliny FITC.

Zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

Przeglądaj więcej filmów