Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: Zoptymalizowany multipleksowy qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Ogólnym celem tej procedury jest profilowanie ekspresji mikro RNA w sposób wydajny, niedrogi i przy minimalnym materiale wyjściowym poprzez połączenie multipleksowego ilościowego R-T-P-C-R z platformą mikroprzepływową. Rozpoczyna się to od koncentracji wyekstrahowanego RNA, a następnie odwrotnej transkrypcji multipleksowej i wstępnej amplifikacji multipleksowej. Kolejnym krokiem jest oczyszczenie z nadmiaru starterów.

Wreszcie, ekspresja mikro RNA singleplex jest profilowana za pomocą platformy mikroprzepływowej. Rezultatem są dokładne i wysoce powtarzalne poziomy ekspresji mikroRNA w próbkach będących przedmiotem zainteresowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że dodatkowy etap oczyszczania po amplifikacji pre-EMP poprawia dokładność i odtwarzalność metody multipleksowej Q-R-T-P-C-R.

Zacznij od RNA, które zostało wyekstrahowane z surowicy. Używając zestawu do oczyszczania RNA lub metody RNA na bazie chloroformu fenolowego z homogenizowanej tkanki, takiej jak triol, po wszystkich ekstrakcjach należy przeprowadzić etap mycia, a całe przechowywanie odbywa się w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zagęścić roztwór RNA.

Jeśli zaczynasz od ograniczonej ilości próbki, na przykład najpierw z surowicy, włóż zbiornik na próbkę MicroCon do fiolki, a następnie pipetuj roztwór RNA do zbiornika, bardzo uważając, aby nie dotknąć membrany końcówką pipety. Teraz umieść fiolkę i filtr w wirówce z pasmem pęknięć w kierunku wirnika i uruchom wirowanie na około trzy godziny. Po trzech godzinach RNA zostanie w pełni skoncentrowany na błonie w celu elucji RNA.

Dodaj żądaną ilość wolnej od RNA wody do membrany, odwróć zbiornik i umieść w nowej fiolce. Następnie wiruj przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza z maksymalną prędkością 3000 razy G.Store skoncentrowane RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebne Po przeprowadzeniu reakcji RT na RNA przy użyciu starterów pętli odwrotnej łodygi xpl, a następnie 12 do 18 rund cykli PCR. MikroRNA są reprezentowane przez nici CD NA.

Nazywa się to produktem pre PCR. Odnosząc się do nadchodzącego QPCR. Produkt pre PCR musi zostać oczyszczony na 10% żelu poliakryloamidowym wraz z 10 sparami zasad obciążenia drabinkowego DNA na każdym pasie z 5,5 mikrolitrami sześciu x pomarańczowy G w połączeniu z 27,5 mikrolitrami produktu pre PCR.

Uruchom żel pod napięciem 150 woltów przez 55 do 60 minut. Błękit fenolowy Romo działa na tym żelu w regionie 20 par zasad. Po spuszczeniu żelu zaplamij go cyberzłotem przez 25 minut, nie wystawiając go na działanie światła i na shakerze z poplamionego żelu.

Wytnij pasmo produktu przed PCR od 60 do 80 par zasad i przenieś blok żelu do oznakowanych probówek. Jeśli stężenie produktu jest niskie, może nie być widoczne, ale nadal będzie w żelu. Teraz zmiażdżyć żelową opaskę za pomocą wirowania z probówki w probówce i dodać 300 mikrolitrów buforu TEN.

Inkubować mieszaninę żelu buforowego przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem. Po czterech godzinach przenieś płyn do nowej probówki i dodaj 300 kolejnych mikrolitrów buforu TEN. Inkubuj tę mieszankę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem.

Następnego dnia ponownie przenieś zawartość probówki i przystąp do wytrącania etanolem produktu pre PCR. Po wyjęciu wióra z opakowania należy go zagruntować w ciągu 24 godzin, a następnie załadować w ciągu 60 minut od zalewania. Rozpocznij zalewanie matrycy, wstrzykując 150 mikrolitrów płynu z przewodu sterującego do każdego z akumulatorów na chipie.

Uważaj, aby nie rozlać płynu na chip lub wloty, w przeciwnym razie chip stanie się bezużyteczny. Następnie umieść chip w zintegrowanym obwodzie fluidycznym lub kontrolerze IFC i uruchom skrypt primingowy sterownika. Jak tylko program się rozpocznie, zacznij przygotowywać próbki.

Rozpocznij od przygotowania próbki wstępnej Wymieszaj kombinację tack man, uniwersalnej mieszanki głównej i odczynników ładujących. Następnie, używając formatu ładowania 96 dołków, połącz 2,25 mikrolitra każdej próbki z 2,75 mikrolitrami mieszanki próbek wstępnych, aby zebrać załadowany płyn. Krótko zmieszaj i szybko odwiruj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Płytka z próbką jest teraz przygotowana. Teraz użyj nowej 96-dołkowej płytki, aby przygotować 13 x stężenia mieszaniny testowej. Odbywa się to poprzez zmieszanie jednego uniwersalnego startera, startera do przodu i specyficznej dla genu sondy tac man na studzienkę.

Stężenia jeden X to jeden mikromol dla startera uniwersalnego i przedniego oraz 0,2 mikromola dla sondy tac man. Następnie dodaj wystarczającą ilość kwetek, aby uzyskać końcowe stężenie 0,25% tween w końcowej objętości studzienki wynoszącej pięć mikrolitrów. Dobrze wymieszaj, unikając bąbelków i krótko obróć płytkę, aby zebrać płyn.

To jest płytka testowa. Rozpocznij 96.96 Q-R-T-P-C-R od załadowania chipa. Najpierw załaduj próbki, a następnie testy z końcową objętością pięciu mikrolitrów na wlot do IFC.

Po drugie, uruchom skrypt Load Mix, aby załadować próbki i testy do chipa. Po zakończeniu skryptu odklej folię ochronną od załadowanego chipa i usuń wszelkie cząsteczki kurzu lub zanieczyszczenia z powierzchni chipa za pomocą taśmy klejącej. Teraz skonfiguruj program wzmacniający biosystem.

Załaduj chip do systemu i uruchom program. Wyniki można analizować za pomocą oprogramowania do pomiaru cieczy w celu uzyskania krzywych wzmocnienia, map cieplnych całego układu scalonego i wartości CT dla każdej z nich. Dobrze przy użyciu produktów pre PCR, oczyszczonych przez separację wielkości na natywnych żelach poliakrylamidowych, dzikim typie DG CR eight i ER null mutant.

RNA przygotowano w porównaniu z poprzednimi protokołami. Dzięki etapowi oczyszczania więcej mikroRNA i utrata sygnałów fałszywie dodatnich występują zarówno w tłach zerowych DGCR eight, jak i zerowych ER. Ponadto, zmodyfikowane podejście QR TPCR R pozwala na właściwą kategoryzację rzadkich D gcr ośmiu niezależnych małych RNA zależnych od kostki.

W tym przypadku 48 cera od pacjentów i osób z grupy kontrolnej poddano badaniom przesiewowym pod kątem zmiany ekspresji 384 różnych mikroRNA. Dane zostały znormalizowane dla każdej próbki poprzez odjęcie odpowiedniej mediany i bez użycia skoku w kontrolach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób multipleks Q-R-T-P-C-R na platformie linii grypy może być używany do jednoczesnego profilowania setek mikronaz w wielu próbkach, nawet jeśli zaczynasz od bardzo ograniczonego wkładu RNA.