Name: Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: Zoptymalizowany multipleksowy qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę multipleksowego qRT-PCR w skali nanolitrowej na platformie mikrofluidycznej Fluidigm do profilowania ekspresji mikroRNA z minimalną ilością materiału wyjściowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium Blellocha za uwagi do tekstu. Praca ta była finansowana ze środków przyznanych RB przez NIH (K08 NS48118 i R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) oraz Pew Charitable Trust, a F.M. przez Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol><li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li>
<li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGertsenstein%2C+M+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).</li>
<li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li>
<li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs%2C+siRNAs%2C+and+other+Microprocessor-independent%2C+Dicer-dependent+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li>
<li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs%3A+their+biogenesis%2C+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22StemBook%22%5BJournal%5D)">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li>
<li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li>
<li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li>
</ol>

Alan Mir jest pracownikiem Fluidigm Corporation. Poza tym nie mamy żadnych interesów finansowych do ujawnienia.

miRNA to krótkie (18-24 nukleotydy), niekodujące cząsteczki RNA, które regulują ekspresję genów potranskrypcyjnie, zarówno poprzez destabilizację matrycowych RNA (mRNA), jak i hamowanie ich translacji.6 Fakt, że co najmniej jedna trzecia ludzkich genów zawiera konserwatywne miejsca wiązania miRNA w obszarze 3'UTR oraz ewidentne interakcje miRNA z genami odpowiedzialnymi za pluripotencję, proliferację i apoptozę, sugerują krytyczny udział w decyzjach o losie komórek, homeostazie tkankowej i chorobach, takich jak nowotwory.6,7 W związku z tym dokładne profile ekspresji mikroRNA budzą szerokie zainteresowanie.
Aby przetestować opublikowany protokół profilowania ekspresji miRNA metodą multipleksowego qRT-PCR2 wykorzystaliśmy mESC z niedoborem małych RNA jako kontrole negatywne. Komórki DGCR8-/- wykazują niedobór wszystkich kanonicznych mikroRNA, natomiast komórki Dicer-/- są pozbawione zarówno kanonicznych, jak i niekanonicznych mikroRNA.8,9
Porównując poziomy w komórkach mES typu dzikiego i komórkach DGCR8-/-, odkryliśmy brak dokładności, ponieważ kilka wyrażonych10 mikroRNA nie zostało wykrytych w komórkach typu dzikiego11. Niektóre wykazywały nawet niższe poziomy ekspresji w stosunku do komórek z nokautem (Rycina 3a). Postawiliśmy hipotezę, że brak dokładności może być spowodowany masywnym przeniesieniem starterów z dwóch następujących po sobie etapów multipleksowych (RT i Pre-PCR) przed ilościową analizą RT-quantification w układzie singleplex. Jednak multipleksowa preamplifikacja jest niezbędna do zwiększenia siły sygnału, zwłaszcza gdy początkowe stężenie RNA jest ograniczone. Poprzez oddzielenie produktów pre-PCR od starterów za pomocą selekcji według wielkości na natywnych żelach poliakrylamidowych (Rycina 2), mogliśmy wykazać znaczną poprawę dokładności poprzez wykrycie większej liczby mikroRNA oraz zanik sygnałów fałszywie dodatnich w obu liniach Dgcr8-/- oraz Dicer-/- (Ryciny 3a i 3b). Dodatkowo zmodyfikowane podejście qRT-PCR pozwoliło na prawidłową kategoryzację rzadkich małych RNA niezależnych od Dgcr8 / zależnych od Dicer (Rycina 3b)11. Zatem dodatkowy etap oczyszczania produktu pre-PCR z nadmiaru starterów jest wyraźnie korzystny, szczególnie przy użyciu dużych zestawów starterów multipleksowych na próbkę.
Optymalna liczba cykli preamplifikacji jest określana przez stężenia wejściowe RNA. Równowaga pozwalająca uniknąć niedostatecznej lub nadmiernej amplifikacji powinna być dostosowana do specyfiki konkretnego eksperymentu.
Przy ponad tysiącu znanych mikroRNA, stosowanie standardowych płytek 384-dołkowych może nie być optymalne dla szerokiego profilowania mikroRNA, szczególnie przy porównywaniu wielu próbek. Fluidigm Dynamic Array IFC umożliwia, przy znacznym zmniejszeniu liczby etapów pipetowania i zapotrzebowania na odczynniki, badanie do 96 oddzielnych próbek w zestawieniu z 96 różnymi mikroRNA w jednym eksperymencie (9216 reakcji) w skali nanolitrowej (6,7 nL). Dla każdego przebiegu oprogramowanie analityczne dostarcza krzywe amplifikacji, kolorowe mapy ciepła oraz wartości progowe cyklu (Ct). Jednoczesne profilowanie na szeroką skalę zmniejsza zmienność eksperymentalną i pozwala na normalizację średniej wartości ekspresji, co daje lepsze wyniki niż inne strategie normalizacji wykorzystujące małe RNA kontrolne.12 
W porównaniu do dostępnych komercyjnie platform 384-dołkowych z przypisanymi sondami TaqMan, połączenie platformy do profilowania wysokoprzepustowego z zestawami starannie dobranych starterów zapewnia dużą elastyczność eksperymentalną.
Zoptymalizowana metoda multipleksowej qRT-PCR w połączeniu z platformą Dynamic Array pozwoliła nam na jednoczesne przesiewowe badanie surowic 48 pacjentów z rakiem prostaty pod kątem zmian poziomów 384 miRNA (ryc. 4) oraz na normalizację danych bez użycia wewnętrznych standardów kontrolnych (tj. syntetycznych mikroRNA).11 
Pomimo zwiększenia liczby etapów od przygotowania próbek do uzyskania wyników profilowania, opisane podejście jest wydajną czasowo i kosztowo metodą wysokoprzepustową, pozwalającą na profilowanie dużych zestawów próbek pod kątem poziomów ekspresji miRNA, nawet przy ograniczonej ilości materiału wyjściowego.

wysokoprzepustowe profilowanie mikrorna: zoptymalizowana wielokanałowa qrt-pcr w skali nanolitrowej na ifc fluidigm dynamic arraytm

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Szeroki udział cząsteczek miRNA w kluczowych procesach leżących u podstaw rozwoju, homeostazy tkankowej i chorób wywołał ogromne zainteresowanie w środowisku badawczym i farmaceutycznym. Aby badać miRNA, niezbędne jest dokładne i wiarygodne ilościowe oznaczenie ich poziomów. Porównując embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC) typu dzikiego z komórkami deficientnymi w zakresie małych RNA, wykazaliśmy brak dokładności i wiarygodności w wcześniej opublikowanych technikach multipleksowej qRT-PCR. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowaną metodę, obejmującą oczyszczanie z nadmiaru starterów po poprzednich etapach multipleksowych przed detekcją w czasie rzeczywistym w trybie singleks, co znacząco zwiększa dokładność i wiarygodność tej techniki. Ponadto wyjaśniamy, w jaki sposób przeprowadzenie tej techniki na chipie mikroprzepływowym przy objętościach nanolitrowych znacząco redukuje koszty odczynników i umożliwia efektywne czasowo, wysokoprzepustowe profilowanie ekspresji miRNA.

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Szeroki udział miRNA w kluczowych procesach leżących u podstaw rozwoju, homeostazy tkanek i chorób doprowadził do gwałtownego wzrostu zainteresowania wśród...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajne i niedrogie profilowanie ekspresji mikroRNA przy minimalnej ilości materiału wyjściowego poprzez połączenie multipleksowej ilościowej R-T-P-C-R z platformą mikroprzepływową. Proces ten rozpoczyna się od zagęszczenia wyekstrahowanego RNA, po czym następuje multipleksowa odwrotna transkrypcja oraz multipleksowa preamplifikacja. Kolejnym krokiem jest oczyszczenie preparatu w celu usunięcia nadmiaru starterów.Na koniec, profil ekspresji pojedynczego mikro-RNA jest analizowany przy użyciu platformy mikroprzepływowej. Wynikiem są dokładne i wysoce powtarzalne poziomy ekspresji mikro-RNA w badanych próbkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że dodatkowy etap oczyszczania po amplifikacji pre-EMP poprawia dokładność i powtarzalność metody multipleksowej Q-R-T-P-C-R.Zacznij od RNA wyekstrahowanego z surowicy. Korzystając z zestawu do oczyszczania RNA lub metody ekstrakcji RNA opartej na fenolo-chloroformie z homogenizowanych tkanek, takich jak TRIzol, po każdej ekstrakcji należy przeprowadzić etap płukania, a wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C. Skoncentruj roztwór RNA.W przypadku rozpoczęcia pracy z ograniczoną ilością próbki, na przykład z surowicy, włożyć zbiornik na próbkę MicroCon do probówki, a następnie pipetą przenieść roztwór RNA do zbiornika, uważając, aby nie dotknąć membrany końcówką pipety. Następnie umieścić probówkę z filtrem w wirówce, kierując pasek z pęknięciem w stronę rotora, i prowadzić wirowanie przez około trzy godziny. Po trzech godzinach RNA zostanie w pełni skoncentrowane na membranie w celu jego późniejszej elucji.Do membrany należy dodać odpowiednią ilość wody wolnej od RNA, odwrócić zbiornik i umieścić go w nowej probówce. Następnie wirować przez trzy minuty w temperaturze 4 °C przy maksymalnej sile 3000 ×g. Skoncentrowane RNA przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Po przeprowadzeniu reakcji RT na RNA z wykorzystaniem specyficznych starterów odwróconej pętli (stem-loop), a następnie 12 do 18 cykli PCR, mikroRNA są reprezentowane przez nici cDNA.Jest to tzw. produkt przed qPCR (pre-PCR). Odnosząc się do nadchodzącej reakcji qPCR, produkt ten należy oczyścić na 10% żelu poliakrylamidowym wraz z markerem DNA 10 bp, aplikując do każdej studzienki 5,5 µL buforu ładującego Orange G 6x połączonego z 27,5 µL produktu przed qPCR.Przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu 150 V przez 55 do 60 minut. Romo phenol blue w tym żelu wędruje w obszarze 20 par zasad. Po zakończeniu elektroforezy zabarw żel barwnikiem cyber gold przez 25 minut, bez dostępu światła, na wytrząsarce.Wytnij prążek produktu przed PCR o długości od 60 do 80 par zasad i przenieś fragment żelu do oznakowanych probówek. Jeśli stężenie produktu jest niskie, może on nie być widoczny, ale nadal będzie znajdować się w żelu. Następnie rozdrobnij prążek żelu, stosując wirowanie probówka w probówce, i dodaj 300 µL buforu TEN.Inkubować mieszaninę buforu i żelu przez cztery godziny w temperaturze 37 °C przy mieszaniu. Po czterech godzinach przenieść ciecz do nowej probówki i dodać kolejne 300 µL buforu TEN. Inkubować tę mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C przy mieszaniu.Następnego dnia ponownie przenieść zawartość probówki i przeprowadzić precypitację etanolem produktu pre-PCR. Po wyjęciu chipa z opakowania musi on zostać przygotowany (priming) w ciągu 24 godzin, a następnie załadowany w ciągu 60 minut od przygotowania. Rozpocząć przygotowanie macierzy, wstrzykując 150 µl płynu linii kontrolnej do każdego z akumulatorów na chipie.Należy uważać, aby nie rozlać cieczy na chip lub wloty, gdyż w przeciwnym razie chip stanie się niezdatny do użytku. Następnie należy umieścić chip w kontrolerze zintegrowanego obwodu płynowego (IFC) i uruchomić skrypt przygotowawczy (priming) kontrolera. W momencie rozpoczęcia programu należy przystąpić do przygotowywania próbek.Zacznij od przygotowania mieszaniny do próbek pres. Wymieszaj TakMan, uniwersalną mieszankę master mix oraz odczynniki do ładowania. Następnie, korzystając z formatu ładowania dla płytek 96-dołkowych, połącz 2,25 µL każdej próbki z 2,75 µL mieszaniny do próbek pres, aby uzyskać ciecz do ładowania. Krótko wymieszaj na wortexie, a następnie szybko odwiruj płytkę w temperaturze 4 °C.Płyta z próbkami jest już przygotowana. Teraz należy użyć nowej płytki 96-dołkowej, aby przygotować 13 x stężenia mieszaniny do analizy. Odbywa się to poprzez dodanie do każdego dołka jednego uniwersalnego primera, primera bezpośredniego oraz specyficznej dla genu sondy TaqMan.Stężenia 1X wynoszą 1 µM dla primera uniwersalnego i przedniego oraz 0,2 µM dla sondy TaqMan. Następnie należy dodać odpowiednią ilość Tween, aby uzyskać stężenie końcowe 0,25% Tween w końcowej objętości 5 µL w studzience. Dobrze wymieszać, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie krótko wir的に odwirować płytkę w celu zebrania cieczy.Jest to płytka do analizy. Rozpocznij procedurę 96.96 Q-R-T-P-C-R od załadowania chipa. Najpierw załaduj próbki, a następnie odczynniki do IFC, tak aby końcowa objętość w każdym wlocie wynosiła 5 µL.Po drugie, uruchom skrypt load mix, aby załadować próbki i testy do chipa. Po zakończeniu działania skryptu odklej folię ochronną z załadowanego chipa i usuń wszelkie cząstki kurzu lub zanieczyszczenia z powierzchni chipa za pomocą taśmy klejącej. Następnie skonfiguruj program amplifikacji systemu bio.Włóż chip do systemu i uruchom program. Wyniki można przeanalizować za pomocą oprogramowania fluid dime, aby uzyskać krzywe amplifikacji, mapy ciepła całego chipa oraz wartości CT dla każdego z nich. W badaniu wykorzystano produkty pre-PCR, oczyszczone poprzez rozdział wielkościowy na natywnych żelach poliakrylamidowych, typ dziki DG CR eight oraz mutant ER null.RNA przygotowano zgodnie ze zmodyfikowanymi poprzednimi protokołami. Dzięki etapowi oczyszczania uzyskano więcej cząsteczek microRNA oraz wyeliminowano sygnały fałszywie dodatnie zarówno w liniach DGCR8 null, jak i ER null. Ponadto zmodyfikowane podejście qRT-PCR pozwala na właściwą kategoryzację rzadkich, niezależnych od DGCR8, a zależnych od Dicer małych RNA.W niniejszym badaniu 48 próbek cera od pacjentów i osób z grupy kontrolnej poddano analizie pod kątem zmian ekspresji 384 różnych mikroRNA. Dane dla każdej próbki znormalizowano poprzez odjęcie odpowiedniej mediany, nie stosując wewnętrznego standardu (spike-in) w grupach kontrolnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak multipleksowa Q-R-T-P-C-R na platformie flu line może być wykorzystywana do jednoczesnego profilowania setek mikroRNA w wielu próbkach, nawet przy bardzo ograniczonej ilości materiału wyjściowego RNA.

high-throughput-microrna-profiling-optimized-multiplex-qrt-pcr-at

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Profilowanie MikroRNA o Wysokiej Przepustowości: Zoptymalizowane Wielokrotne qRT-PCR w Skali Nanolitra na IFCs Fluidigm Dynamic ArrayTM

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przyjęty w badaniu przesiewowym BioMILD w celu przeprowadzenia testu klasyfikatora sygnatury krążącego mikroRNA do wczesnego wykrywania raka płuc.

Płynna biopsja na bazie mikroRNA: doświadczenia z klasyfikatorem sygnatury miRNA w osoczu (MSC) do badań przesiewowych w kierunku raka płuc

Tutaj przedstawiono ilościowy protokół oparty na reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do określania natywnej zawartości mikro-RNA (bezwzględnej/względnej) w cząsteczkach lipoprotein. Ponadto przedstawiono metodę zwiększania poziomu mikro-RNA, a także metodę określania szybkości wychwytu komórkowego cząstek lipoprotein.

Wzbogacenie natywnych cząstek lipoprotein w mikroRNA, a następnie określenie ich bezwzględnej/względnej zawartości mikroRNA i szybkości transferu komórkowego

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Poznaj zoptymalizowaną metodę multipleksowego qRT-PCR w skali nanolitrowej na platformie mikrofluidycznej Fluidigm do profilowania ekspresji mikroRNA z minimalną ilością materiału wyjściowego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: Zoptymalizowany multipleksowy qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Przeglądaj więcej filmów