Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wydajne i niedrogie profilowanie ekspresji mikroRNA przy minimalnej ilości materiału wyjściowego poprzez połączenie multipleksowej ilościowej R-T-P-C-R z platformą mikroprzepływową. Proces ten rozpoczyna się od zagęszczenia wyekstrahowanego RNA, po czym następuje multipleksowa odwrotna transkrypcja oraz multipleksowa preamplifikacja. Kolejnym krokiem jest oczyszczenie preparatu w celu usunięcia nadmiaru starterów.

Na koniec, profil ekspresji pojedynczego mikro-RNA jest analizowany przy użyciu platformy mikroprzepływowej. Wynikiem są dokładne i wysoce powtarzalne poziomy ekspresji mikro-RNA w badanych próbkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że dodatkowy etap oczyszczania po amplifikacji pre-EMP poprawia dokładność i powtarzalność metody multipleksowej Q-R-T-P-C-R.

Zacznij od RNA wyekstrahowanego z surowicy. Korzystając z zestawu do oczyszczania RNA lub metody ekstrakcji RNA opartej na fenolo-chloroformie z homogenizowanych tkanek, takich jak TRIzol, po każdej ekstrakcji należy przeprowadzić etap płukania, a wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C. Skoncentruj roztwór RNA.

W przypadku rozpoczęcia pracy z ograniczoną ilością próbki, na przykład z surowicy, włożyć zbiornik na próbkę MicroCon do probówki, a następnie pipetą przenieść roztwór RNA do zbiornika, uważając, aby nie dotknąć membrany końcówką pipety. Następnie umieścić probówkę z filtrem w wirówce, kierując pasek z pęknięciem w stronę rotora, i prowadzić wirowanie przez około trzy godziny. Po trzech godzinach RNA zostanie w pełni skoncentrowane na membranie w celu jego późniejszej elucji.

Do membrany należy dodać odpowiednią ilość wody wolnej od RNA, odwrócić zbiornik i umieścić go w nowej probówce. Następnie wirować przez trzy minuty w temperaturze 4 °C przy maksymalnej sile 3000 ×g. Skoncentrowane RNA przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Po przeprowadzeniu reakcji RT na RNA z wykorzystaniem specyficznych starterów odwróconej pętli (stem-loop), a następnie 12 do 18 cykli PCR, mikroRNA są reprezentowane przez nici cDNA.

Jest to tzw. produkt przed qPCR (pre-PCR). Odnosząc się do nadchodzącej reakcji qPCR, produkt ten należy oczyścić na 10% żelu poliakrylamidowym wraz z markerem DNA 10 bp, aplikując do każdej studzienki 5,5 µL buforu ładującego Orange G 6x połączonego z 27,5 µL produktu przed qPCR.

Przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu 150 V przez 55 do 60 minut. Romo phenol blue w tym żelu wędruje w obszarze 20 par zasad. Po zakończeniu elektroforezy zabarw żel barwnikiem cyber gold przez 25 minut, bez dostępu światła, na wytrząsarce.

Wytnij prążek produktu przed PCR o długości od 60 do 80 par zasad i przenieś fragment żelu do oznakowanych probówek. Jeśli stężenie produktu jest niskie, może on nie być widoczny, ale nadal będzie znajdować się w żelu. Następnie rozdrobnij prążek żelu, stosując wirowanie probówka w probówce, i dodaj 300 µL buforu TEN.

Inkubować mieszaninę buforu i żelu przez cztery godziny w temperaturze 37 °C przy mieszaniu. Po czterech godzinach przenieść ciecz do nowej probówki i dodać kolejne 300 µL buforu TEN. Inkubować tę mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C przy mieszaniu.

Następnego dnia ponownie przenieść zawartość probówki i przeprowadzić precypitację etanolem produktu pre-PCR. Po wyjęciu chipa z opakowania musi on zostać przygotowany (priming) w ciągu 24 godzin, a następnie załadowany w ciągu 60 minut od przygotowania. Rozpocząć przygotowanie macierzy, wstrzykując 150 µl płynu linii kontrolnej do każdego z akumulatorów na chipie.

Należy uważać, aby nie rozlać cieczy na chip lub wloty, gdyż w przeciwnym razie chip stanie się niezdatny do użytku. Następnie należy umieścić chip w kontrolerze zintegrowanego obwodu płynowego (IFC) i uruchomić skrypt przygotowawczy (priming) kontrolera. W momencie rozpoczęcia programu należy przystąpić do przygotowywania próbek.

Zacznij od przygotowania mieszaniny do próbek pres. Wymieszaj TakMan, uniwersalną mieszankę master mix oraz odczynniki do ładowania. Następnie, korzystając z formatu ładowania dla płytek 96-dołkowych, połącz 2,25 µL każdej próbki z 2,75 µL mieszaniny do próbek pres, aby uzyskać ciecz do ładowania. Krótko wymieszaj na wortexie, a następnie szybko odwiruj płytkę w temperaturze 4 °C.

Płyta z próbkami jest już przygotowana. Teraz należy użyć nowej płytki 96-dołkowej, aby przygotować 13 x stężenia mieszaniny do analizy. Odbywa się to poprzez dodanie do każdego dołka jednego uniwersalnego primera, primera bezpośredniego oraz specyficznej dla genu sondy TaqMan.

Stężenia 1X wynoszą 1 µM dla primera uniwersalnego i przedniego oraz 0,2 µM dla sondy TaqMan. Następnie należy dodać odpowiednią ilość Tween, aby uzyskać stężenie końcowe 0,25% Tween w końcowej objętości 5 µL w studzience. Dobrze wymieszać, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie krótko wir的に odwirować płytkę w celu zebrania cieczy.

Jest to płytka do analizy. Rozpocznij procedurę 96.96 Q-R-T-P-C-R od załadowania chipa. Najpierw załaduj próbki, a następnie odczynniki do IFC, tak aby końcowa objętość w każdym wlocie wynosiła 5 µL.

Po drugie, uruchom skrypt load mix, aby załadować próbki i testy do chipa. Po zakończeniu działania skryptu odklej folię ochronną z załadowanego chipa i usuń wszelkie cząstki kurzu lub zanieczyszczenia z powierzchni chipa za pomocą taśmy klejącej. Następnie skonfiguruj program amplifikacji systemu bio.

Włóż chip do systemu i uruchom program. Wyniki można przeanalizować za pomocą oprogramowania fluid dime, aby uzyskać krzywe amplifikacji, mapy ciepła całego chipa oraz wartości CT dla każdego z nich. W badaniu wykorzystano produkty pre-PCR, oczyszczone poprzez rozdział wielkościowy na natywnych żelach poliakrylamidowych, typ dziki DG CR eight oraz mutant ER null.

RNA przygotowano zgodnie ze zmodyfikowanymi poprzednimi protokołami. Dzięki etapowi oczyszczania uzyskano więcej cząsteczek microRNA oraz wyeliminowano sygnały fałszywie dodatnie zarówno w liniach DGCR8 null, jak i ER null. Ponadto zmodyfikowane podejście qRT-PCR pozwala na właściwą kategoryzację rzadkich, niezależnych od DGCR8, a zależnych od Dicer małych RNA.

W niniejszym badaniu 48 próbek cera od pacjentów i osób z grupy kontrolnej poddano analizie pod kątem zmian ekspresji 384 różnych mikroRNA. Dane dla każdej próbki znormalizowano poprzez odjęcie odpowiedniej mediany, nie stosując wewnętrznego standardu (spike-in) w grupach kontrolnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak multipleksowa Q-R-T-P-C-R na platformie flu line może być wykorzystywana do jednoczesnego profilowania setek mikroRNA w wielu próbkach, nawet przy bardzo ograniczonej ilości materiału wyjściowego RNA.