Name: Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatożołądkowym kraba za pomocą barwników wrażliwych na napięcie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj technikę obrazowania neuronów w zwoju stomatożołądkowym kraba za pomocą barwników wrażliwych na napięcie. Metoda umożliwia optyczny zapis zmian potencjału błonowego i interakcji synaptycznych bez ograniczeń elektrodowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyrażamy wdzięczność za wsparcie udzielone przez School of Computing Science oraz Faculty of Science, Agriculture and Engineering Uniwersytetu w Newcastle, Uniwersytet w Ulm oraz firmę SciMedia Ltd (Tokio, Japonia).

1. Przygotowanie układu nerwowego stomatogastrycznego kraba
Dorosłe osobniki *pagurus L.* zostały pozyskane z lokalnych źródeł (Newcastle University, Dove Marine Laboratories) i utrzymywane w filtrowanej, napowietrzonej wodzie morskiej (10 - 12°C). Przed sekcją zwierzęta znieczulono, umieszczając je w lodzie na 20 - 40 min. Wykorzystano wyizolowane stomatogastryczne układy nerwowe (STNS)1. STNS przymocowano szpilkami w szalce Petri wyłożonej elastomerem silikonowym (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Monachium, Niemcy) i poddano ciągłej perfuzji (7 - 12 mL/min) schłodzoną solą fizjologiczną (10-13°C). Sól fizjologiczna składała się z (mMol*l-1): NaCl, 440; MgCl2, 26; CaCl2, 13; KCl, 11; trismas base, 10; kwasu maleinowego, 5. Roztwór utrzymywano w stałej temperaturze 11 - 13°C i przy pH 7.4 - 7.6.
Szczegółowe etapy preparacji i sekcji STNS, w tym usuwanie osłonki zwoju żołądkowo-ustnego (STG), zostały przedstawione w artykule JoVE autorstwa Guttierez i Grashow1. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24listopada 1986 r. (86/609/EWG). Rysunek 1A przedstawia schemat STNS, a rysunek 1B pokazuje typowy STG po usunięciu osłonki, w którym neurony są rozmieszczone w formie płaskiego półkola w tylnej części zwoju.
Szalkę Petriego z STNS mocuje się do platformy roboczej mikroskopu obrazującego (BW51 WI; Olympus, Tokyo, Japonia) za pomocą plasteliny modelarskiej. Zarówno stolik mikroskopu, jak i sam mikroskop są zamontowane na stole wibroizolowanym (Scientifica, Uckfield, UK), aby zapobiec artefaktom ruchowym podczas rejestracji optycznej. Wzorce aktywności motorycznej generowane w zwoju żołądkowo-odbytniczym (STG) są monitorowane za pomocą rejestracji pozakomórkowej2-4. Odbywa się to w następujących krokach:
<ol>
<li>Wokół fragmentu głównego nerwu ruchowego (lvn) tworzy się cylindryczną komorę z wazeliny, aby odizolować nerw elektrycznie od kąpieli (czynność tę wykonuje się na stole sekcyjnym przed umieszczeniem szalki Petriego na platformie roboczej mikroskopu obrazującego).</li>
<li>Jeden z dwóch stalowych drutów elektrodowych umieszcza się w tej komorze, a drugi w kąpieli jako elektrodę odniesienia.</li>
<li>Sygnał różnicowy jest rejestrowany, filtrowany i wzmacniany za pomocą różnicowego wzmacniacza prądu przemiennego (Univ. Kaiserslautern, Niemcy).</li>
<li>Aktywność ruchową zwoju monitoruje się za pomocą oscyloskopu (DL708E; Yokogawa, Tokio, Japonia) i dodatkowo rejestruje za pomocą karty akwizycji danych (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) oraz oprogramowania Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Pliki są analizowane przy użyciu Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu barwnika
Użyliśmy fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na napięcie Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience)5, który posiada podwójny ładunek dodatni ułatwiający wprowadzanie barwnika poprzez mikroelektrody przy użyciu dodatnich impulsów prądowych. Roztwór barwnika należy w miarę możliwości chronić przed światłem. Roztwór barwnika przygotowuje się w następujący sposób:
<ol>
<li>5 mg barwnika miesza się z 1 mL roztworem kwasu Pluronic F-127 w DMSO (Invitrogen).</li>
<li>Plastikową probówkę z rozpuszczonym barwnikiem wiruje się przez 20 minut przy 12 000 rotation/minute w mikrocentry fudze Sigma Microcentrifuge 1-14 (Sigma, Osterode, Niemcy), aby oddzielić większe cząsteczki barwnika, które mogłyby zapchać mikroelektrodę.</li>
<li>Nadosad (górne 200 μL) roztworu barwnika pobiera się za pomocą pipety i przelewa do oddzielnej plastikowej probówki. Obie probówki owija się folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło.</li>
<li>Roztwór barwnika zamraża się w temperaturze -20 °C.</li>
<li>Przed użyciem roztwór barwnika rozmraża się, umieszczając zamkniętą i owiniętą probówkę w ciepłej (25 °C) wodzie na 10-15 minut.</li>
</ol>
3. Wprowadzanie barwnika poprzez wstrzykiwanie wewnątrzkomórkowe za pomocą ostrych mikroelektrod
Do wprowadzenia barwnika do neuronów wykorzystaliśmy ostre mikroelektrody. W celu weryfikacji załadowania barwnika zastosowano system obrazowania MiCAM02 (SciMedia, Tokio, Japonia)6. System obrazowania posiada dwie kamery CCD: kamera HR posiada większy chip sensora (6.4 mm x 4.8 mm), co zapewnia lepszą rozdzielczość przestrzenną przy najlepszej rozdzielczości czasowej wynoszącej 1.4 ms, natomiast kamera HS posiada mniejszy (2.9 mm x 2.1 mm), lecz szybszy chip sensora, co umożliwia szybsze obrazowanie z najlepszą rozdzielczością czasową 0.7 ms. Etapy wprowadzania barwnika są następujące:
<ol>
<li>Mikroelektrody są wyciągane za pomocą wyciągarki do elektrod P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA), wykorzystując szklane rurki z włóknem o długości 10 cm i średnicy zewnętrznej 1 mm (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Niemcy). Elektrody są wyciągane do uzyskania rezystancji w zakresie 25–40 MOhm w 3M KCl (w celu dobrania odpowiednich parametrów wyciągania należy skorzystać z instrukcji do pipet dostarczonej przez producenta wyciągarki).</li>
<li>Zamrożony roztwór barwnika zostaje roztopiony, a następnie bardzo niewielką jego ilość zasysa się do igły MicroFil (MicroFil - 34G, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) – zassany barwnik wypełnia około 2/3 igły.Badań i rozwoju igły Microfil.</li>
<li>Roztwór barwnika znajdujący się w igle Microfil jest wstrzykiwany do końcówki mikroelektrody. Mikroelektrodę umieszcza się w ciemnej komorze na 15 minut.</li>
<li>Mikroelektrodę wypełnia się roztworem 3M KCl. Następnie elektrodę umieszcza się z powrotem w ciemnym pojemniku do przechowywania elektrod na kolejne 10–20 minut, aby roztwór barwnika dotarł do cienkiej końcówki elektrody pod wpływem sił kapilarnych działających w mikroelektrodzie.</li>
<li>Gotową mikroelektrodę umieszcza się w uchwycie do elektrod i mocuje do głowicy wzmacniacza wewnątrzkomórkowego (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA).</li>
<li>Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy jest podłączony do karty akwizycji danych, która generuje sygnał impulsowy w celu wprowadzenia impulsów prądowych do mikroelektrody.</li>
<li>Mikroelektrodę umieszcza się delikatnie w błonie neuronu STG, korzystając z manipulatora mikroelektrod (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, UK). Ze względu na bardzo małą odległość roboczą obiektywu 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm; Olympus Corporation, Tokio, Japonia) mikroskopu obrazującego, mikroelektrodę należy ustawić pod kątem (około 30°) a przemieszczenie mikroelektrody w odpowiednią pozycję wymaga kilkukrotnego ponownego ustawienia ostrości obiektywu mikroskopu oraz przesuwania mikroelektrody. Na początku mikroelektrodę przesuwa się w taką pozycję, aby jej końcówka znajdowała się nad STG. Obiektyw mikroskopu opuszcza się do momentu, aż końcówka elektrody stanie się widoczna i ostra. Następnie obiektyw opuszcza się nieco bardziej, jednak nie na tyle, aby dotknąć mikroelektrody. Mikroelektrodę opuszcza się do momentu, aż ponownie pojawi się ona w płaszczyźnie ostrości obiektywu. Kroki te powtarza się do czasu, aż neurony staną się wyraźnie widoczne w płaszczyźnie ostrości obiektywu. Następnie mikroelektrodę opuszcza się, aż dotknie ona i delikatnie przebije błonę wybranego neuronu STG. Proces ten monitoruje się za pomocą oscyloskopu.</li>
<li>Elektrodę wewnątrzkomórkową wykorzystuje się do rejestracji aktywności wybranego neuronu STG w celu jego identyfikacji na podstawie profilu aktywności oraz zależności między jego aktywnością a aktywnością STG rejestrowaną za pomocą elektrody zewnątrzkomórkowej2,3,7.</li>
<li>Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy przełącza się w tryb wstrzykiwania prądu i wykorzystuje przez 30 minut do podawania do mikroelektrody dodatnich skoków prądu o wartości 10 nA; każdy skok trwa 1 sekundę i jest oddzielony 1-sekundową przerwą, podczas której do mikroelektrody nie podaje się prądu. Wstrzykiwany prąd wprowadza dodatnio naładowane cząsteczki barwnika do rejestrowanego neuronu. Jeśli dostępny jest odpowiedni sprzęt, można wstrzykiwać barwnik do wielu neuronów jednocześnie.</li>
<li>Rozprzestrzenienie barwnika w neuronie sprawdza się w dziesiątej minucie okresu iniekcji oraz po jej zakończeniu. W tym celu wykorzystuje się system obrazowania MiCAM02 (SciMedia Ltd, Tokio, Japonia) z obiektywem 10x i oświetleniem z halogenowego źródła światła o ultra-niskim tętnieniu (HL-151; Moritex, Tokio, Japonia) poprzez kostkę filtracyjną MSWG2 (z filtrem wzbudzenia 480-550 nm; Olympus Corporation, Tokio, Japonia). System obrazowania jest ustawiony na korzystanie z kamery HR o rozdzielczości 192 x 128 pikseli, czasie obrazowania 40 ms, trybie „hbin” oraz 10 klatkach na sesję obrazowania. Jeśli wypełnienie barwnikiem przebiegło pomyślnie, obraz powinien wykazać zabarwiony obszar w neuronie wokół miejsca wprowadzenia mikroelektrody; obszar ten powinien powiększyć się pomiędzy obrazami wykonanymi po 10 a po 30 minutach. Jeśli po 30 minutach rozprzestrzenienie barwnika jest niewystarczające, wydłuża się czas iniekcji. Alternatywnie można zastosować nową elektrodę z barwnikiem.</li>
<li>Elektrodę wyjmuje się z neuronu, a następnie pozostawia go do regeneracji przez co najmniej 20–30 minut. W tym czasie do kolejnego neuronu można wprowadzić barwnik.</li>
</ol>
4. Obrazowanie barwionych neuronów
Aktywność pojedynczych neuronów można obrazować po przeprowadzeniu procedury wypełniania barwnikiem. Alternatywnie można wypełnić dwa lub więcej neuronów, aby obrazować jednoczesną aktywność kilku neuronów STG. W zasadzie wiele, a być może wszystkie neurony STG, może zostać wypełnione barwnikiem. Obrazowanie neuronów jest wykonywane za pomocą systemu obrazowania MiCAM 02 przy użyciu kamery HR. Procedura obrazowania przebiega w następujący sposób:
<ol>
<li>Zmieniono obiektyw mikroskopu i do gromadzenia danych obrazowych wykorzystano obiektyw 20x o wysokiej wydajności transmisji światła (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Obiektyw ten zbiera znacznie więcej światła niż obiektyw 10x i zapewnia również większe powiększenie, co pozwala uzyskać bardziej szczegółowy obraz neuronów. Wyższa wydajność świetlna oznacza, że nawet niewielka ilość wprowadzonego barwnika jest już widoczna przy użyciu tego obiektywu, a także że do obrazowania można zastosować niższą intensywność światła, co redukuje potencjalne uszkodzenia fotochemiczne neuronów wywoływane przez barwnik.</li>
<li>Stół roboczy mikroskopu jest ustawiony w taki sposób, aby neurony przeznaczone do obrazowania znajdowały się w polu widzenia obiektywu, a następnie obiektyw zostaje na nich skupiony.</li>
<li>Dane z rejestracji zewnątrzkomórkowej są również wprowadzane do systemu obrazowania MiCAM 02 poprzez jego analogowy kanał wejściowy. Umożliwia to stosunkowo łatwe powiązanie sygnałów optycznych z odpowiadającymi im wzorcami ruchowymi lub zarejestrowanymi zewnątrzkomórkowo impulsami (spikes) w fazie analizy.</li>
<li>System MiCAM 02 jest ustawiony na rozdzielczość 96 x 64 piksele z czasem obrazowania 2.2 ms lub rozdzielczość 48 x 32 piksele z czasem obrazowania 1.5 ms. W obu przypadkach można zastosować ustawienie „hbin”, jeśli zabarwienie neuronów nie jest bardzo intensywne.</li>
<li>Poziom światła jest ustawiony na jak najniższy (tj. barwnik w neuronach powinien nadal generować fluorescencję wystarczającą do obrazowania), aby uniknąć fotomodulacji i uszkodzeń fotochemicznych rejestrowanych neuronów.</li>
<li>Oświetlenie pomieszczenia oraz wszystkie pozostałe źródła światła zostają wyłączone. Dodatkowo wokół aparatury rejestracyjnej można zasłonić czarną zasłonę, aby zapobiec ekspozycji na światło z zewnętrznych źródeł.</li>
<li>Czas trwania sesji obrazowania jest ustawiony w przedziale od 4 do 16 sekund.</li>
<li>Spontaniczna aktywność zabarwionych neuronów jest rejestrowana podczas kilku sesji obrazowania.</li>
</ol>
5. Analiza danych obrazowania optycznego
Do analizy danych obrazowych wykorzystaliśmy oprogramowanie BVAna (wersja 10.08; SciMedia Ltd, Tokio, Japonia) powiązane z systemem obrazowania MiCAM 02. Oprogramowanie to umożliwia wizualizację danych obrazowych i zapewnia również szereg narzędzi analitycznych. Kroki analizy i interpretacji danych są następujące:
<ol>
<li>Dla każdego rejestrowanego neuronu wybierany jest odpowiedni okrągły obszar zainteresowania (ROI). Zazwyczaj stosujemy obszary zainteresowania o promieniu 2 - 3 pikseli do badania neuronów przy rozdzielczości 48 x 32 pikseli oraz obszary o promieniu 6 - 8 pikseli dla neuronów przy rozdzielczości 96 x 64 pikseli.</li>
<li>Możliwe jest zastosowanie wygładzania czasowego danych, zwłaszcza jeśli barwnik generuje stosunkowo niską fluorescencję (wskazuje na to niska wartość tła w danych; może to wynikać z zastosowania niskiego poziomu światła lub niskiego stopnia załadowania barwnika, np. w neurycie rejestrowanego neuronu). W takich przypadkach zazwyczaj stosowano wygładzanie czasowe z 3 - 5 jednostkami czasu.</li>
<li>Oprócz rejestracji optycznej wyświetlamy również zapis zewnątrzkomórkowy, wybierając opcję wyświetlania wejścia analogowego systemu obrazowania.</li>
<li>Parametry wizualizacji danych optycznych oraz wejścia analogowego należy ustawić w odpowiedni sposób, aby wszystkie zapisy były widoczne na ekranie komputera.</li>
<li>Biorąc pod uwagę optyczne zapisy neuronów, zapis zewnątrzkomórkowy z lvn oraz klasyfikację neuronu na podstawie wcześniejszego zapisu wewnątrzkomórkowego, możliwe jest określenie tożsamości neuronu i powiązanie jego aktywności z aktywnością neuronalną rejestrowaną z nerwu.</li>
<li>Oczekuje się, że zapisy optyczne wyraźnie i bez konieczności uśredniania wielu podobnych zdarzeń pokażą aktywność neuronalną odpowiadającą zarejestrowanym zewnątrzkomórkowo kolcom (spike'om), a także zdarzenia podprogowe, takie jak hamujące potencjały postsynaptyczne wywołane aktywnością innych neuronów.</li>
<li>Funkcje eksportu danych oprogramowania BVAna mogą zostać wykorzystane do eksportu zapisów optycznych obliczonych dla wybranych obszarów zainteresowania, a także wejścia analogowego zawierającego zapis z lvn. Wyeksportowane dane mogą być następnie przetwarzane i analizowane za pomocą innego oprogramowania do analizy danych (np. w najprostszym przypadku do dodatkowej wizualizacji i przetwarzania danych można użyć programu Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, US)).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia jednoczesną rejestrację dwóch neuronów (LP, boczny neuron pyloryczny; PD, neuron rozszerzający pylorus) w generatorze centralnym pylorycznym STG kraba wraz z rejestracją z lvn. Optyczne rejestracje neuronów LP i PD, zidentyfikowanych na podstawie pomiarów wewnątrzkomórkowych, wykazują, że w rzeczywistości dobrze odpowiadają one rejestracjom zewnątrzkomórkowym przypisanym do neuronów LP i PD. Między optycznymi a lvn rejestracjami szczytów potencjałów czynnościowych występuje stałe opóźnienie wynoszące 12 ms (patrz wstawka na Rysunku 2), co wynika z opóźnienia przewodzenia aksonalnego między zwojem a miejscem rejestracji zewnątrzkomórkowej. Przedstawione dane pokazują również, że aktywność neuronalna w somie, odpowiadająca potencjałom czynnościowym rejestrowanych neuronów, jest wyraźnie wykrywalna.
<img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg" alt="Anatomia zwoju stomatogastrycznego skorupiaków; schemat neuronowy i obraz mikroskopowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A) Schematyczny rysunek stomatogastrycznego układu nerwowego (STNS). CoG, zwój komisuralny; OG, zwój przełykowy; STG, zwój stomatogastryczny; stn, nerw stomatogastryczny; lvn, boczny nerw komorowy. B) Zwój stomatogastryczny (STG) kraba – obraz przedstawia półkolisty, tylny układ neuronów STG.
<img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Analiza aktywności neuronalnej; wykres elektrofizjologiczny, wzorzec wyładowań neuronu; układ eksperymentalny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Symultaniczne rejestrowanie pojedynczego przebiegu neuronu PD i LP wraz z rejestracją lvn. Dane wykazują, że rejestracje optyczne i nerwowe bardzo dobrze się pokrywają i że możemy zidentyfikować aktywności neuronalne odpowiadające kolcom zarejestrowanym z nerwu. Wstawka przedstawia nałożenie kilku przebiegów potencjałów czynnościowych LP – zarejestrowanych zarówno optycznie, jak i elektrycznie – oraz ich średnią, co demonstruje zgodność między aktywnościami zarejestrowanymi optycznie i elektrycznie. Ze względu na to, że nasza metoda rejestracji optycznej nie odfiltrowuje niskoczęstotliwościowych komponentów danych, jesteśmy również w stanie zarejestrować wolne zmiany potencjału błonowego charakterystyczne dla neuronów PD i LP14.

<ol><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li>
<li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+pattern+selection+via+inhibition+of+parallel+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways.</a> J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).</li>
<li>Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li>
<li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+dyes%3A+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+%26+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure & Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li>
<li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab%2C+Cancer+pagurus%3A+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li>
<li>Zecevic, D., Wu, J. -Y., Cohen, L. B., London, J. A., Höpp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li>
<li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Grillner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+pattern+generation%3A+the+cellular+and+computational+logic+of+networks+in+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion.</a> Neuron. 52, 751-766 (2006).</li>
<li>Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortex+as+a+central+pattern+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li>
<li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+stomatogastric+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie neuronów STG z wykorzystaniem barwników wrażliwych na napięcie8,9 w połączeniu z tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi (rejestracjami wewnątrz- i zewnątrzkomórkowymi) pozwala na lepsze zrozumienie funkcjonowania tego małego, dobrze znanego, a wciąż złożonego układu neuronalnego. STG stanowi prototyp sieci neuronalnych generatorów centralnych wzorców (CPG) (obejmuje sieci rytmiczne pyloryczne i żołądkowe)10,,11, zatem lepsze zrozumienie wyłaniających się właściwości funkcjonalnych STG pomoże również zrozumieć, w jaki sposób sieci CPG w ogóle generują swoją funkcjonalność na poziomie sieciowym. Sieci CPG odgrywają krytyczną rolę w kontroli motorycznej12, a także w wyższych funkcjach poznawczych13, w konsekwencji lepsze zrozumienie ich właściwości emergentnych może mieć istotny wpływ na wiele dziedzin neuronauki.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>SciMedia</td><td></td><td>System obrazowania</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych dla systemu obrazowania MiCAM 02</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, Tokio, Japonia</td><td></td><td>Halogenowe źródło światła o bardzo niskim tętnieniu</td></tr><tr><td>BX51 WI</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Mikroskop pionowy do obrazowania epifluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Obiektyw obrazujący 20x</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2.0mm</td></tr><tr><td>Obiektyw obrazujący 10x</td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0.30, WD 3.3mm</td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna z filtrem wzbudzenia 480-550 nm i filtrem emisyjnym 590nm</td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator elektrod PatchStar</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>Manipulator mikroelektrod</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Płyta akwizycji danych</td></tr><tr><td>Oscyloskop DL708E</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>AC wzmacniacz różnicowy</td><td>University of Kaiserslautern, Niemcy</td><td></td><td>Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Wytwornica elektrod P-97 Flaming &amp;#8211; Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Wytwornica elektrod</td></tr><tr><td>Mikrowirówka Sigma Microcentrifuge 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Wirówka</td></tr><tr><td>Pipety Genex Pipettors Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>Szklana mikropipeta z włóknem</td><td>Science Products</td><td>GB100TF 8P</td><td>Szkło do mikr&amp;#8211;lektrod</td></tr><tr><td>MicroFil &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Igła Microfil</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Oprogramowanie do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>Fluorescencyjny barwnik wrażliwy na napięcie</td></tr><tr><td>Kwas Pluronic F-127, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Składnik soli kraba</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Składnik soli kraba</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Składnik soli kraba, roztwór elektrolitu</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>Składnik soli kraba</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Składnik soli kraba</td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Składnik soli kraba</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, Monachium, Niemcy</td><td></td><td>Wykładzina szalek Petriego</td></tr></tbody></table>

obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Obrazowanie neuronów z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych jest kluczową metodologią służącą zrozumieniu organizacji sieci neuronalnych oraz tego, w jaki sposób jednoczesna aktywność uczestniczących w nich neuronów prowadzi do wyłonienia się zintegrowanej funkcjonalności sieci. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię zastosowania tej techniki w odniesieniu do zidentyfikowanych neuronów generujących wzorce w zwoju stomatogastrycznym kraba. Demonstrujemy wprowadzanie do tych neuronów fluorescencyjnego barwnika napięciowo-czułego Di-8-ANEPPQ oraz pokazujemy, jak obrazować aktywność neuronów obciążonych barwnikiem przy użyciu systemu obrazowania z szybką kamerą CCD o wysokiej rozdzielczości MiCAM02. Prezentujemy analizę zarejestrowanych danych obrazowych przy użyciu oprogramowania BVAna powiązanego z systemem obrazowania MiCAM02. Jednoczesne obrazowanie szczegółowej aktywności wielu neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z użyciem barwników napięciowo-czułych, stosowane razem z tradycyjnymi technikami elektrofizjologicznymi (rejestracjami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi), otwiera zupełnie nowe możliwości zrozumienia zasad działania sieci neuronalnych centralnych generatorów wzorców.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię szybkiego obrazowania fluorescencyjnego z wysoką rozdzielczością przy użyciu barwników wrażliwych na napięcie w celu analizy szczegółowej aktywności neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba.

Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Obrazowanie neuronów z użyciem barwników wrażliwych na napięcie jest kluczową metodologią pozwalającą zrozumieć, w jaki sposób zorganizowane są sieci neuronalne oraz w jaki sposób jednoczesna...

Celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie barwników wrażliwych na napięcie do optycznego rejestrowania zmian potencjału błonowego oraz oddziaływań synaptycznych między neuronami w generatorach centralnych wzorców zwoju somatycznego skorupiaka St Somatic asterisk. Jest to realizowane poprzez załadowanie zidentyfikowanych neuronów barwnikiem DD eight i at PQ za pomocą iniekcji jonophoretycznej z wykorzystaniem ostrych mikroelektrod oraz jednoczesną rejestrację zewnątrzkomórkową aktywności nerwów ruchowych; w drugim kroku fluorescencja barwnika wrażliwego na napięcie jest wzbudzana światłem zielonym, co umożliwia obrazowanie zmian fluorescencji odpowiadających zmianom potencjału błony komórkowej. Następnie dane obrazowe są analizowane poprzez wybór obszaru zainteresowania w błonie neuronu i porównanie sygnału optycznego z zarejestrowaną zewnątrzkomórkową aktywnością bike w celu zidentyfikowania potencjałów czynnościowych i potencjałów synaptycznych.W wynikach dotyczących neuronów obrazowych wykazano, że optyczna rejestracja synaptycznie oddziałujących neuronów generujących wzorce może uzupełnić tradycyjne techniki rejestracji i otworzyć nowe możliwości zrozumienia funkcjonowania sieci neuronowych centralnych generatorów wzorców. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rejestracje zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe, jest to, że po wypełnieniu barwnikiem można uzyskać optyczne zapisy zmian potencjału błonowego i oddziaływań synaptycznych bez ograniczeń sterycznych wynikających z rozmieszczenia elektrod oraz bez dalszych uszkodzeń neuronów podczas długotrwałych pomiarów. Metoda ta może zatem dostarczyć dodatkowych informacji na temat generowania wzorców w zwoju żołądkowym skorupiaków.Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak lokomocja i oddychanie u kręgowców. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ iniekcja i przygotowanie barwnika D są skomplikowane, a parametry analizy danych obrazowych muszą zostać odpowiednio ustawione, aby wykryć zmiany potencjału błonowego. Rozpocznij przygotowania od sporządzenia roztworu barwnika fluorescencyjnego w plastikowej fiolce: wymieszaj 5 mg fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na napięcie D eight i FPQ z 1 ml kwasu F1 27 onic w roztworze DMSO.Następnie odwiruj rozpuszczony barwnik przez 20 minut przy 12 000 obr./min. Aby oddzielić większe cząsteczki D, które mogłyby zapchać mikroelektrodę, po wirowaniu przygotuj się do odessania górnych 200 µL nadłoża i przelej nadłożo do oddzielnej plastikowej probówki. Owiń probówkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu na działanie światła.W dniu eksperymentu należy przechowywać roztwór D w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Roztwór barwnika należy rozmrozić, umieszczając owiniętą fiolkę w wodzie o temperaturze 25 °C na 10 do 15 minut. Aby przygotować się do rejestracji, należy rozpocząć od wyizolowania somatycznego układu nerwowego żołądka STS kraba i usunięcia osłonki z somatycznego zwoju żołądkowego.Nanieś wazelinę wokół fragmentu nerwu komory bocznej lub LVN, aby stworzyć elektrycznie izolowaną komorę. Użyj plasteliny modelarskiej, aby przymocować szalkę Petriego do platformy operacyjnej mikroskopu obrazującego. Umieść drucik elektrody ze stali nierdzewnej w komorze z wazeliną, aby rejestrować sygnały z miejsca LVN, a drugą elektrodę ze stali nierdzewnej umieść w kąpieli jako elektrodę referencyjną.Po rozmrożeniu roztworu D należy pobrać taką jego ilość, aby wypełnić około dwóch trzecich igły do mikronapełniania. Wstrzyknąć roztwór D z igły do mikronapełniania do końcówki szklanej mikroelektrody. Przykryć wypełnioną barwnikiem elektrodę pudełkiem i odczekać 15 minut.Następnie należy uzupełnić mikroelektrodę roztworem chlorku potasu o stężeniu 3 M. Umieścić mikroelektrodę z powrotem w ciemnym pojemniku do przechowywania elektrod na 10 do 20 minut, aby działanie kapilarne wciągnęło roztwór do cienkiego wierzchołka elektrody. Po 10 do 20 minutach umieścić mikroelektrodę w uchwycie i podłączyć ją do głowicy wzmacniacza wewnątrzkomórkowego.Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy jest podłączony do karty akwizycji danych, która dostarcza sygnał impulsowy w celu wprowadzenia impulsów prądowych do mikroelektrody. Następnie należy ustawić mikroelektrodę pod kątem i umieścić jej końcówkę nad somatycznym zwojem żołądkowym. Obniżaj obiektyw mikroskopu do momentu, aż końcówka elektrody znajdzie się w polu ostrości.Następnie opuść obiektyw, uważając, aby zatrzymać go przed dotknięciem mikroelektrody. Następnie obniżaj mikroelektrodę, aż pojawi się ona ponownie. W ognisku obiektywu, monitorując postępy na oscyloskopie, delikatnie przebij błonę wybranego neuronu somatycznego zwojów żołądkowych.W tym momencie należy porównać zarejestrowane potencjały czynnościowe wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Aby zidentyfikować przebity neuron, należy rozpocząć wtryskiwanie barwnika, przełączając wzmacniacz wewnątrzkomórkowy w tryb wstrzykiwania prądu i podając 10 nA dodatnich skoków prądowych do mikroelektrody. Skoki prądowe powinny trwać jedną sekundę, z jednosekundowymi przerwami bez przepływu prądu.Kontynuuj obecną iniekcję przez 30 minut. Po 10 minutach wstrzykiwania barwnika użyj systemu obrazowania MYCA zero two, aby sprawdzić rozprzestrzenianie się barwnika wewnątrz neuronu. Powtórz tę czynność, sprawdzając stan po 30 minutach.Jeśli wypełnienie barwnikiem przebiegło pomyślnie, zabarwiony obszar wokół mikroelektrody powinien powiększyć się pomiędzy obrazami wykonanymi w 10. a 30. minucie. Należy wyciągnąć elektrodę z neuronu i pozostawić go w spoczynku przez co najmniej 20 do 30 minut, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się w komórce. W tym czasie można wstrzyknąć barwnik do innego neuronu.Przełącz system obrazowania MYAM zero two na obiektyw o wysokiej sprawności transmisji z powiększeniem 20x. W razie potrzeby przesuń stół roboczy mikroskopu i ustaw ostrość na neuron w polu D. Przesyłaj dane z rejestracji zewnątrzkomórkowej do systemu obrazowania poprzez jego analogowy kanał wejściowy.Wyłącz oświetlenie pomieszczenia oraz wszystkie pozostałe źródła światła. Dodatkowo zasłoń stanowisko rejestracyjne czarną zasłoną, aby zapobiec ekspozycji na światło z zewnętrznych źródeł. Ustaw system obrazowania na odpowiednią rozdzielczość pikseli i czas obrazowania wskazane w tabeli.Jeśli barwienie neuronów jest słabe, należy zastosować ustawienie koszyka H. Ustaw poziom światła mikroskopu na jak najniższy, aby uniknąć fotomodulacji i fotouszkodzeń rejestrowanych neuronów. Czas trwania sesji obrazowania należy ustawić w przedziale od 4 do 16 sekund.Następnie zarejestruj aktywność spontaniczną neuronów DY podczas kilku sesji obrazowania. Aby rozpocząć analizę odpowiedzi optycznych przy użyciu oprogramowania do obrazowania BV A NA, wybierz odpowiedni obszar kołowy na każdym zarejestrowanym neuronie, jeśli konieczne jest wygładzanie czasowe danych. Na przykład, jeśli D generuje stosunkowo niską fluorescencję, użyj oprogramowania, aby zastosować wygładzanie czasowe z trzema do pięciu jednostek czasu.Dwa neurony w górnym lewym rogu tej ryciny, w które wstrzyknięto barwnik, zostały zidentyfikowane jako neuron PD i neuron LP na podstawie zapisów wewnątrzkomórkowych. Ślady napięcia po ich prawej stronie przedstawiają spontaniczne odpowiedzi optyczne każdego z neuronów. Na dole ryciny przedstawiono zapis pozakomórkowy LVN.Neurony LP i PD stanowią część pylorycznego generatora wzorców centralnych w zwoju żołądkowym kraba i wykazują wzajemne hamowanie. Ich rejestracje optyczne można dobrze dopasować do rejestracji zewnątrzkomórkowych LVN. Wstawka na dole przedstawia nałożenie kilku przebiegów potencjałów czynnościowych LP oraz ich średnią, co demonstruje zgodność między aktywnością rejestrowaną optycznie i elektrycznie.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w półtorej godziny. Po zastosowaniu tej metody można wykonać inne analizy, takie jak immunobarwienie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, jaki typ synapsy brał udział w wywołaniu obserwowanych zmian potencjału błonowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat optycznego rejestrowania aktywności wielu zidentyfikowanych i oddziałujących ze sobą neuronów w zwojach żołądkowych.

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Optyczne Obrazowanie Neuronów w Ganglion Stomatogastricznym Kraba z Użyciem Barwników Czułych na Napięcie

Niniejszy protokół ilustruje, w jaki sposób barwniki napięciowo-wrażliwe umożliwiają optyczną rejestrację aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych, takich jak sploty jelitowego układu nerwowego świnki morskiej, z regulowaną rozdzielczością obejmującą zakres od pojedynczych komórek po obwody wieloganglionarne.

Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

Ten film demonstruje procedurę obserwacji zmian w aktywności neuronalnej w wycinku mózgu zabarwionym barwnikiem wrażliwym na napięcie. Barwnik odzwierciedla zmiany w potencjale błonowym neuronu poprzez zmianę jego intensywności fluorescencji. Dzięki zastosowaniu bodźców elektrycznych i zaawansowanych technik obrazowania, proces ten umożliwia wizualne śledzenie zmian potencjału błony neuronalnej w czasie rzeczywistym w oparciu o fluorescencję VSD.

Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj technikę obrazowania neuronów w zwoju stomatożołądkowym kraba za pomocą barwników wrażliwych na napięcie. Metoda umożliwia optyczny zapis zmian potencjału błonowego i interakcji synaptycznych bez ograniczeń elektrodowych.

Obrazowanie optyczne neuronów w zwoju stomatogastrycznym kraba z wykorzystaniem barwników napięciowo-czułych

Przeglądaj więcej filmów