Name: Limfocyty T regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzucenia przeszczepu i cukrzycy typu I (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Poznaj mechanizmy tolerancji immunologicznej i terapie komórkowe oparte na limfocytach T regulatorowych w leczeniu chorób autoimmunologicznych oraz zapobieganiu odrzuceniu przeszczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

limfocyty t regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzutów przeszczepów i cukrzycy typu i

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Limfocyty T regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzutów przeszczepów i cukrzycy typu I

Nazywam się Jeff Bluestone. Jestem dyrektorem Centrum Cukrzycy UCSF. Znajdujemy się w laboratorium, w którym nadzoruję sieć tolerancji immunologicznej.Moja praca koncentruje się na podstawowym zrozumieniu tego, w jaki sposób układ odpornościowy odróżnia antygeny własne od obcych oraz na tym, jak możemy wykorzystać terapie do próby wywołania tzw. tolerancji immunologicznej. Jest to zdolność układu odpornościowego do bycia modulowanym w taki sposób, aby chronić organizm przed rozpoznawaniem własnych tkanek jako obcych i atakowaniem takich narządów jak trzustka, mózg czy stawy. Zjawisko to występuje w wielu chorobach autoimmunologicznych. Szczególnie interesują nas terapie – zarówno lekowe, jak i komórkowe – które mogłyby posłużyć do edukowania lub reedukowania układu odpornościowego, aby nie blokować ani nie niszczyć własnej zdolności do ochrony własnych tkanek.Zatem gdy limfocyt T przechodzi przez grasicę lub limfocyt B opuszcza szpik kostny, musi nauczyć się odróżniać antygeny własne od obcych; proces ten nazywamy tolerancją immunologiczną, czyli zdolnością do tolerowania własnych tkanek i niezniszczenia ani niezaatakowania ich. W wielu stanach chorobowych często zdarza się, że układ odpornościowy – z przyczyn środowiskowych i genetycznych – zaczyna atakować własne tkanki, co prowadzi do przerwania tolerancji; to właśnie ten system staramy się przywrócić za pomocą niektórych z naszych terapii. Nadrzędnym celem terapii tolerancji immunologicznej, w przeciwieństwie do ogólnej immunosupresji, jest opracowanie metod leczniczych lub leków, które faktycznie przywrócą tolerancję bez konieczności prowadzenia stałej terapii.Dzięki temu w przyszłości osoby po transplantacji nerki lub wątroby, które obecnie mogą potrzebować 20 lub 30 tabletek dziennie, aby zapobiec atakom układu odpornościowego na nerkę, trzustkę lub wątrobę, mogłyby otrzymać terapię modyfikującą układ immunologiczny w taki sposób, aby stał się on tolerancyjny wobec przeszczepionej nerki lub wątroby i nie odrzucił ich. Jednym z najciekawszych aspektów tolerancji immunologicznej było odkrycie istnienia w organizmie wyspecjalizowanych komórek, których zadaniem jest ochrona narządów oraz regulacja układu odpornościowego, aby nie atakował on tych tkanek.Te tak zwane limfocyty T regulacyjne stały się w ciągu ostatniej dekady bardzo istotnym i centralnym elementem rozumienia tolerancji immunologicznej. W rzeczywistości limfocyty T regulacyjne są często nazywane supresorami. Limfocyty T są znane od 30 lat, od czasów wczesnych odkryć i opisów sformułowanych przez osoby takie jak Dick Han.Niestety, w latach osiemdziesiątych komórki te straciły na znaczeniu z powodu braku unikalnych markerów biologicznych lub biochemicznych, które pozwoliłyby odróżnić je od innych komórek, a także ze względu na dane, które były trudne do zinterpretowania przy ówczesnym stanie wiedzy na temat tego, jak limfocyty T rozpoznają białka i jak działa układ odpornościowy. Jednak od połowy lat dziewięćdziesiątych, dzięki przełomym pracom badaczy takich jak Shimon Succi i inni, zaczęliśmy rozumieć zarówno komórkowe, jak i biochemiczne podstawy działania limfocytów T regulatorowych, tak że gdy na początku lat dwutysięcznych odkryto czynnik transkrypcyjny zwany Fox P3, mogliśmy w końcu przypisać tym komórkom wyspecjalizowany marker i naprawdę je zrozumieć. Od tego czasu mogliśmy w pełni wykorzystać te komórki poprzez ich namnażanie, izolowanie i ponowne wprowadzanie do organizmów zwierząt, aby wykazać, że są one zdolne do indukowania tolerancji immunologicznej, co stanowi główny cel naszych działań.Jednym z najważniejszych pytań stanowiących wyzwanie w tej dziedzinie jest próba zrozumienia mechanizmu działania tregs, zarówno w odpowiedziach odpornościowych, jak i podczas indukcji tolerancji. Pojawiło się szereg pytań dotyczących tego, czy komórki te oddziałują na inne, patogenne limfocyty T? Czy oddziałują one na komórki prezentujące antygen, czy może wytwarzają cytokiny, które ostatecznie regulują odpowiedź odpornościową?Nasze własne badania, oparte na obrazowaniu in vitro i in vivo, sugerują, że komórki te działają bezpośrednio na główną komórkę prezentującą antygen w trzustce, którą jest komórka dendrytyczna. Wykazaliśmy, że jesteśmy w stanie znakować limfocyty T regulatorowe jednym kolorem (zielonym), podczas gdy komórki dendrytyczne były znakowane innym kolorem, co pozwoliło wykazać, że limfocyty T regulatorowe wchodzą w bezpośrednie interakcje z komórkami dendrytycznymi, a tym samym zasadniczo zmieniają ich zdolność do aktywacji patogennej odpowiedzi limfocytów T. Uważamy zatem, że albo bezpośrednio, albo poprzez niektóre cytokiny pośredniczące, takie jak IL 10 lub TGF beta, limfocyty Treg edukują lub modyfikują komórki dendrytyczne, ograniczając ich zdolność do aktywacji patogennej odpowiedzi limfocytów T.Tak, jednym z ciekawszych aspektów limfocytów T regulatorowych jest koncepcja, według której poza tą bardzo wyspecjalizowaną subpopulacją istniejącą w grasicy i rozwijającą się podczas rozwoju grasiczego, tzw. naturalnymi Treg, w trakcie odpowiedzi immunologicznej inne limfocyty T mogą w rzeczywistości przekształcić się w limfocyty T regulatorowe – albo poprzez bezpośrednią nadekspresję Fox P three pod wpływem cytokin takich jak TGF beta, o których wiadomo, że aktywują FOX P three, albo nawet inne komórki, które nie są pozytywne pod kątem Fox P three, lecz przyjmują cechy limfocytów T regulatorowych. Te tzw. adaptacyjne Treg są zazwyczaj bardzo ważne w regulowaniu odpowiedzi zapalnej, ponieważ oddziałują one z antygenami obecnymi lokalnie w zapalnej tkance. I te komórki adaptacyjne są prawdopodobnie kluczowe w utrzymywaniu tolerancji lokalnie w docelowej tkance, podczas gdy naturalne Treg są prawdopodobnie bardziej użyteczne lub istotne w utrzymywaniu homeostazy immunologicznej lub ogólnego tłumienia autoreaktywności w całym organizmie zwierzęcia lub pacjenta.Skoro wiemy zatem, że komórki regulacyjne są niezbędne do utrzymania homeostazy immunologicznej, możemy wyobrazić sobie, co stałoby się w przypadku ich zaburzenia. W rzeczywistości, jeśli usunie się Fox P three w modelach mysich z wykorzystaniem technologii knockout lub w przypadku ludzkiej choroby zwanej I pex, zwierzęta i pacjenci umierają w krótkim czasie z powodu rozległej choroby autoimmunologicznej, w której każda docelowa tkanka – wątroba, nerki, serce – zostaje nacieknięta przez limfocyty T, co prowadzi do zniszczenia tkanek. To pokazuje, jak fundamentalna jest homeostaza immunologiczna i jak bardzo te komórki chronią organizm.Jednym z ważnych odkryć dotyczących limfocytów T regulatorowych jest możliwość ich izolacji oraz specyficznej ekspansji w celu ponownego wprowadzenia do organizmów osób chorych, aby przywrócić homeostazę układu odpornościowego. W rzeczywistości prace w naszym i innych laboratoriach pozwoliły na wyizolowanie tych komórek i ich namnożenie nawet tysiąckrotnie, wykazując, że zachowują one zdolność do supresji i mogą zostać ponownie wprowadzone do zwierząt w celu wywołania odpowiedzi regulacyjnej. Największe sukcesy osiągnięto dotychczas w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych w zwierzęcych modelach cukrzycy; na przykład jesteśmy w stanie zapobiec lub nawet odwrócić przebieg cukrzycy poprzez podanie niewielkiej liczby tych antygenowo specyficznych limfocytów T regulatorowych, które namnożyliśmy ex vivo. Mamy nadzieję, że wkrótce uda się zastosować podobne populacje komórek, powielone w analogiczny sposób, u ludzi.Mamy nadzieję, że w przyszłości zastosowania tych metod wyjdą poza choroby autoimmunologiczne i obejmą szersze uwarunkowania immunologiczne, z których być może najtrudniejszym jest transplantacja. Obecnie przeszczepiamy ludziom ponad sześć rodzajów organów, jednak wciąż konieczne jest stosowanie dożywotniej immunosupresji, aby zapobiec odrzuceniu tych przeszczepów. Nadzieją jest, że będziemy mogli wykorzystać komórki regulacyjne rozpoznające tkankę dawcy w przypadku przeszczepów nerek, wątroby, trzustki czy wysepek trzustkowych, a następnie skierować te komórki regulacyjne do wspomnianych tkanek i zapobiec rozpoznaniu ich przez układ odpornościowy jako obce. Pozwoliłoby to przekształcić odpowiedź alloimmunologiczną w bezpieczną odpowiedź typu auto (self) i zapobiec odrzutowi bez konieczności ciągłej farmakoterapii immunosupresyjnej.Naszą nadzieją jest, że ta konkretna terapia okaże się bardzo odpowiednia w leczeniu osób z cukrzycą typu 1. Gdy wszystkie insulinotwórcze komórki beta zostaną zniszczone, jedynym sposobem, w jaki będziemy w stanie ostatecznie leczyć tę chorobę, będzie zarówno przywrócenie pacjentowi wysepek trzustkowych lub innych komórek produkujących insulinę, jak i jednoczesne zapobieganie odpowiedziom autoimmunologicznym i allogenicznym, które mogłyby je zniszczyć. Nasze podejście polega więc na tym, aby u osób z wieloletnią cukrzycą przeszczepić obecnie wysepki od dawców zmarłych, a w przyszłości być może z komórek macierzystych lub innych źródeł, aby faktycznie zastąpić zdolność produkcji insuliny; mamy nadzieję, że wprowadzenie w tym środowisku regulacyjnych limfocytów T zapobiegnie odrzuceniu tych wysepek pochodzących z obcych źródeł.Jak wspomniałem, koncepcja indukowania tolerancji u tych osób będzie wymagała nie tylko źródła komórek produkujących insulinę, ale pewnej kombinacji leków i terapii komórkowych. Liczymy na to, że komórki regulacyjne wprowadzą organizm w stan tolerancji w homeostazie, tak aby wprowadzone do organizmu pacjenta z cukrzycą tkanki obce nie były rozpoznawane i niszczone. Konkretnie, nasze podejście do faktycznej rekonstrukcji insulinotwórczych komórek beta u pacjentów rozpoczyna się od eksperymentów, które przeprowadzamy na modelach zwierzęcych – polegają one na pobieraniu wysepek przygotowanych z trzustki (pamiętając, że tylko około 0,5% wszystkich komórek w trzustce to wysepki produkujące insulinę), aby wyizolować te komórki i oczyścić je w sposób, który pozwoli na ich ponowne wprowadzenie do biorcy.Wprowadzamy je ponownie, umieszczając je albo pod torebką nerki, co jest rutynowo stosowaną metodą w modelach zwierzęcych, albo bezpośrednio do wątroby, co stosujemy w przypadku ludzi. Gdy komórki trafią w dane miejsce, czyli do nerki lub wątroby, zasiedlają je i zaczynają pobierać krew oraz inne składniki odżywcze niezbędne do przeżycia i produkcji insuliny, która następnie krąży w organizmie i trafia do innych tkanek i narządów według potrzeb. Celem jest oczywiście, aby po umieszczeniu komórek w danej tkance zastosować odpowiednie immunoterapie, które zapobiegną atakom układu odpornościowego na komórki w tych tkankach.Oczywiście istnieje szereg wyzwań dotyczących wszystkich nowych immunoterapii, a Tregs nie są pod tym względem wyjątkiem. Musimy wziąć pod uwagę wiele kwestii, starając się wykorzystać je terapeutycznie. Obecnie problemem jest liczba komórek – jesteśmy w stanie zidentyfikować jedynie niewielką liczbę komórek o specyficzności antygenowej niezbędnej do zablokowania zarówno auto-, jak i alloimmunności.W związku z tym musimy opracować metody zarówno izolacji tych komórek, jak i ich namnożenia do liczby wystarczającej do leczenia pacjenta. Ponadto musimy upewnić się, że są to rzeczywiście czyste limfocyty T regulatorowe. Chcemy uniknąć błędu polegającego na wprowadzeniu komórek, które mogą być patogenne i atakować obcą tkankę, zamiast komórek regulatorowych, które pełnią funkcję ochronną.Zrozumienie stabilności i wytrzymałości tych komórek oraz sposobu, w jaki przetrwają one w różnych stanach zapalnych, będzie miało kluczowe znaczenie. Trzecią kwestią, którą musimy wziąć pod uwagę, jest możliwość wywołania nieswoistej immunosupresji. Komórki regulacyjne te są zaprojektowane tak, aby szeroko hamować odpowiedź immunologiczną.Dlatego też, blokując odrzucanie przeszczepu, nie chcemy jednocześnie blokować zdolności organizmu do rozpoznawania bakterii, wirusów czy komórek nowotworowych, które mogą się pojawić; chcemy natomiast pozostać ukierunkowani i skoncentrowani na tkance, którą przeszczepiono pacjentowi. Wreszcie uważam, że kolejnym wyzwaniem w przypadku każdej terapii komórkowej jest możliwość jej robustnego i rutynowego przeprowadzania wielokrotnie, ponieważ każdy pacjent będzie wymagał własnego zestawu komórek. Nie jest to lek, który można po prostu kupić w aptece.W związku z tym będziemy musieli opracować technologie wykorzystujące dobre praktyki produkcyjne zatwierdzone przez Food and Drug Administration, które pozwolą nam na powtarzalną hodowlę tych komórek w ten sam sposób za każdym razem i zapewnią, że pracujemy z naprawdę homogeniczną i dobrze zdefiniowaną populacją komórek. Kiedy myśli się o finansowaniu takich projektów, jest to zawsze połączenie funduszy federalnych, które otrzymujemy z NIH w celu wsparcia podstawowych badań naukowych istotnych dla rozwoju tego procesu, a także – co dla nas jest korzystne – wsparcia innych organizacji, takich jak Juvenile Diabetes Foundation, która bardzo nam pomogła, gromadząc ogromne fundusze od społeczności na pomoc w realizacji tych wysokoryzykowanych projektów.Mieliśmy szczęście móc współpracować zarówno z NIH i JDRF, jak i okazjonalnie z firmami farmaceutycznymi, aby móc posuwać tego typu projekty naprzód. Obecnie uważam, że finansowanie jest wystarczające i mamy wielką nadzieję, że uda nam się skutecznie rozwijać ten projekt. Mieliśmy szczęście w środowisku diabetycznym, ciesząc się tak silnym zainteresowaniem chorobą, zarówno na poziomie federalnym, jak i pozafederalnym.Oczywiście nie jest to niewłaściwe, biorąc pod uwagę fakt, że choroba ta naprawdę się rozwija i przybiera rozmiary epidemii, ale mamy nadzieję, że dostępne fundusze będą wystarczające, abyśmy mogli kontynuować ten projekt. Podobnie jak wszyscy naukowcy, zawsze mamy poczucie, że jesteśmy niedofinansowani i niedoceniani, gdy spojrzymy na to, ile pieniędzy wydaje się na rozwiązywanie problemów na całym świecie, na wojnę w Iraku czy na nasze wojsko, mając świadomość, że fundusze z zaledwie kilku dni takich wydatków mogłyby utrzymać NIH przez cały rok. Trudno wyobrazić sobie, jak ustaliliśmy nasze priorytety, ponieważ jako naukowcy uważamy, że istnieje wiele rzeczy, które możemy zrobić, aby zmienić zdrowie ludzi i ludzki stan.Zatem pozostaje nam tylko nadzieja, że patrząc na postępy w nauce za 50 lat, nie będziemy już rozmawiać o ubezpieczeniach zdrowotnych, o HMO czy zarządzaniu. Będziemy rozmawiać o niesamowitych odkryciach, które zostaną dokonane i które zmienią stan zdrowia w naszym kraju oraz zdrowie na całym świecie.Podobnie jak w przypadku rewolucji przemysłowej na przełomie ubiegłego wieku, w obecnym stuleciu największy wpływ będzie miało to, w jaki sposób zmieniliśmy podejście do chorób, zarówno tych ostrych, jak i przewlekłych. Mamy nadzieję, że opinia publiczna to doceni oraz uzna nasze wysiłki w dążeniu do wprowadzenia takich zmian.

regulatory-t-cells-therapeutic-potential-for-treating-transplant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Limfocyty T regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzucenia przeszczepu i cukrzycy typu I

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Opisujemy wartościowy test diagnostyczny, który mógłby potencjalnie służyć do podejmowania decyzji o odstawieniu immunosupresji po transplantacji, bez zwiększania ryzyka odrzucenia przeszczepu. Test ten opiera się na zasadach nadwrażliwości opóźnionej i umożliwia dokładną ocenę zarówno efektorowych, jak i regulacyjnych odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla dawcy, generowanych przez biorców.

Test opóźnionej nadwrażliwości trans-vivo w badaniu regulacji specyficznej dla antygenu

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.

Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Poznaj mechanizmy tolerancji immunologicznej i terapie komórkowe oparte na limfocytach T regulatorowych w leczeniu chorób autoimmunologicznych oraz zapobieganiu odrzuceniu przeszczepu.

Limfocyty T regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzutów przeszczepów i cukrzycy typu I

Przeglądaj więcej filmów