Name: Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-20T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Naucz się wytwarzać zewnątrzkomórkowe elektrody ssące do elektrofizjologicznych pomiarów rdzenia kręgowego noworodków gryzoni in vitro. Metoda obejmuje topienie rurki PE 90 lampą alkoholową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Samuel L. Pfaff jest profesorem w laboratoriach ekspresji genów w The Salk Institute for Biological Studies oraz badaczem w Howard Hughes Medical Institute. Praca ta była wspierana przez Christopher and Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker oraz Mike Sullivan z działu zasobów multimedialnych w Salk Institute pomogli w fotografii i montażu.

Rejestracje elektrofizjologiczne wyizolowanych rdzeni kręgowych mogą ujawnić genetyczne i rozwojowe zmiany w obwodach neuronalnych 1. Wcześniej zaprezentowaliśmy metodę wyizolowania rdzeni kręgowych myszy noworodkowych 2. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę przygotowania elektrod ssących, które są użyteczne w rejestracji fikcyjnej lokomocji w wyizolowanych rdzeniach kręgowych 3.
Koniec elektrody wykonanej z plastikowej rurki można ręcznie wyciągnąć do postaci bardzo cienkiej końcówki, używając niskotemperaturowej lampy alkoholowej 3-5. Plastikową rurkę (PE90, Clay Adams IntramedicTM) trzyma się nad płomieniem, aby zmiękczyć ją do formy plastycznej. Gdy rurka zaczyna topnieć i staje się bardziej przezroczysta, zostaje usunięta z źródła ciepła, a jej końce są delikatnie rozciągane. Moment usunięcia rurki z płomienia jest kluczowy, aby zapobiec zapadnięciu się lub pęknięciu plastiku podczas wyciągania. Cienką część rurki odcina się żyletką, aby uzyskać pożądaną średnicę wewnętrzną, zależną od wieku preparatu lub poziomu segmentarnego rdzenia. Aby ułatwić założenie o-ringu na rurkę, gruby koniec rurki przecina się żyletką pod kątem 45°. Na grubym końcu montuje się tulejkę i o-ring, aby przymocować końcówkę elektrody do korpusu elektrody.
Aby uzyskać elektrody o ściśle określonym rozmiarze i uniknąć trudności związanych z ręcznym wyciąganiem końcówek elektrod, można je skonstruować, wkładając cienką rurkę do rurki o większej średnicy (PE90). Długości rurek zależą od wymagań danej konfiguracji rejestracyjnej i mogą być zmienne. Przedstawiamy wymiary zastosowane w naszych eksperymentach 1-3,5. Za pomocą żyletki odcina się odcinek 1cm cienkiej rurki PTFE (Zeus, Small Parts) oraz odcinek 10cm rurki PE90. Należy sprawdzić końce cienkiej rurki, aby upewnić się, że nie są one zmiażdżone ani zamknięte. Można je udrożnić za pomocą szpilki entomologicznej (Fine Science Tools). Kroplę kleju (JB Weld) nanosi się na środek rurki PTFE. Rurkę PTFE wraz z klejem wciąga się do rurki PE90, zasysając powietrze ustami z końcówki rurki PE90. Na grubym końcu rurki wykonuje się cięcie pod kątem 45°, a następnie mocuje tulejkę i o-ring, zgodnie z wcześniejszym opisem.
Z komercyjnej elektrody ssącej odkręca się tulejkę i złącze BNC. Złącze BNC namacza się w ksylenie przez jedną godzinę w celu usunięcia woskowej uszczelki. Następnie złącze płucze się w wodzie i suszy.
W bocznej ścianie obudowy należy wykonać otwór boczny pod mniejszym kątem. Metalowy pręt jest podgrzewany palnikiem Bunsena i wciskany pod niskim kątem w istniejący otwór w bocznej ściance obudowy. Odcina się odcinek drutu srebrnego o długości 15cm i średnicy 0.010 inch (A-M Systems), a następnie moczy go w wybielaczu przez piętnaście minut. Zabieg ten ma na celu utworzenie powłoki z chlorku srebra, która wspomaga przewodzenie sygnału 6. Drut jest płukany wodą, suszony, a następnie lutowany do złącza BNC. Złącze BNC oraz srebrny drut są wkładane do obudowy elektrody ssącej w taki sposób, aby złącze BNC pozostało z boku obudowy. Do otworu bocznego wprowadza się rurkę ssącą na głębokość 2-3cm. Do obudowy wstrzykuje się około 2-3cm uszczelniacza silikonowego. Złącze BNC jest wkręcane do obudowy elektrody, przesuwając uszczelniacz do przodu.
Końcówkę elektrody należy teraz wprowadzić do przedniej części elektrody. W celu wzmocnienia linii ssącej z portu bocznego można dołożyć rurkę termokurczliwą.
Elektrody są zamontowane na mikromanipulatorach przymocowanych do podstaw magnetycznych i umieszczone w pobliżu naczynia do rejestracji. Koncentryczne kable BNC są podłączone do wzmacniacza wstępnego (headstage), który jest połączony z wzmacniaczem. Wzmacniacz jest podłączony do adaptera (Polyview), który z kolei jest połączony z kartą analogowo-cyfrową (National Instruments) w komputerze PC z oprogramowaniem do akwizycji danych (Polyview).
Podczas rejestracji danych elektrofizjologicznych konieczne jest wyeliminowanie wszelkich zakłóceń zewnętrznych. Naczynie pomiarowe, wzmacniacz i przedwzmacniacz głowicowy są umieszczane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya, aby zapobiec odpowiednio zakłóceniom mechanicznym i elektrycznym.
Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig1.jpg" alt="Schemat montażu elektrody: złącze BNC, uszczelniacz silikonowy, srebrny drut, tuleja, rurka ssąca." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Dostępna komercyjnie elektroda ssąca może zostać zmodyfikowana poprzez dodanie srebrnego drutu o większym przekroju oraz plastikowej końcówki, uformowanej ręcznie nad lampą alkoholową lub wykonanej z dostępnych komercyjnie plastikowych rurek o określonych wymiarach. Ponadto uszczelnienie parafiniowe zastąpiono trwalszym uszczelnianiem z silikonu.
<img src="/files/ftp_upload/2580/2580fig2.jpg" alt="Schemat układu elektrofizjologicznego z wzmacniaczem, naczyniem do sekcji dla sygnałów neuronowych; przetwarzanie danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat elektrody ssącej w odniesieniu do stołu pneumatycznego (izolacja mechaniczna), klatki Faradaya (izolacja elektryczna), wzmacniacza i komputera. Należy zauważyć, że istnieje uziemienie odniesione do naczynia rejestracyjnego oraz drugie uziemienie odniesione do stołu pneumatycznego i klatki Faradaya.

<ol><li>Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+rhythmic+locomotor+burst+patterns+using+a+continuous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform.</a> Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Gallarda, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, 233-236 (2008).</li>
<li>Landmesser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+motor+projection+patterns+in+the+chick+hind+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of motor projection patterns in the chick hind limb.</a> J Physiol. 284, 391-414 (1978).</li>
<li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Chanin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+chloride+by+use+of+the+silver-silver+chloride+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode.</a> Science. 119, 323-324 (1954).</li>
<li>Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+controlling+vertebrate+locomotion%3A+moving+in+a+new+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction.</a> Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Rozwój układu nerwowego można badać z wykorzystaniem wyizolowanych rdzeni kręgowych gryzoni. W obecności neuroprzekaźników w rdzeniu kręgowym można wywołać fikcyjną lokomocję w formie wzorców aktywności elektrycznej 1,3. Rytmiczne wyładowania te występują z częstotliwością od 0,2 do 0,5 Hz i charakteryzują się naprzemiennością lewo-prawo oraz zginacz-prostownik. Wytrzymałość i wzorce tej aktywności różnią się w zależności od etapu rozwoju 1. Mutacje genetyczne mogą również zakłócać strukturę tej akt...

<table><tbody><tr><td>Rurka PTFE Sub Lite Wall (mała rurka)</td><td>Zeus</td><td>36AWG</td><td>0.005&amp;#8221; ID x 0.003&amp;#8221; ścianka (małe elementy). Dostępna również w rozmiarach od 0.003&amp;#8221; do 0.006&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Duża rurka (0.86mm (0.34&amp;#8221;))</td><td>BD Biosciences</td><td>427420</td><td>0.86mm (0.34&amp;#8221;) O.D. 1.27mm (.050&amp;#8221;)</td></tr><tr><td>Korpus elektrody</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td>JB Weld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klej: silikonowy uszczelniacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyna i lutownica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Srebrny drut: 0.010&amp;#8221;</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne: Austerlitz 0.1mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Statyw magnetyczny</td><td>Narishige International</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Minopłyta (przedwzmacniacz głowicowy)</td><td>Grass Technologies</td><td>F-15EB/B1</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka adaptera Polyview</td><td>Grass Technologies</td><td>PVA 8</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny bipolarny system wzmacniaczy Physiodata</td><td>Grass Technologies</td><td>15LT</td><td></td></tr><tr><td>KARTA ANALOGOWO-CYFROWA</td><td>National Instruments</td><td>6035E</td><td></td></tr><tr><td>Stół pneumatyczny; Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizjologia rdzenia kręgowego ii: wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Rozwój obwodów neuronalnych i lokomocji można badać, analizując zachowanie centralnego generatora wzorców (CPG) w rdzeniu kręgowym noworodków gryzoni. Prezentujemy metodę wykonania elektrod ssących, które są wykorzystywane do badania aktywności CPG, czyli lokomocji fiktywnej, w wyizolowanych rdzeniach kręgowych gryzoni. Rdzenie kręgowe gryzoni umieszcza się w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, a korzenie brzuszne wprowadza do elektrody ssącej. Elektrodę konstruuje się poprzez modyfikację dostępnej komercyjnie elektrody ssącej. Zamiast standardowego drutu dołączonego do elektrody komercyjnej, stosuje się grubszy drut srebrny. Szklana końcówka elektrody komercyjnej zostaje zastąpiona końcówką plastikową w celu zwiększenia trwałości. Przygotowujemy elektrody wyciągane ręcznie oraz elektrody wykonane z rurek o określonych rozmiarach, co zapewnia spójność i powtarzalność. Dane są zbierane przy użyciu wzmacniacza i oprogramowania do akwizycji neurogramów. Pomiary są przeprowadzane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya, aby odpowiednio zapobiec zakłóceniom mechanicznym i elektrycznym.

Prezentacja sposobu wykonania i zastosowania zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej używanej do pomiarów elektrofizjologicznych w rdzonach kręgowych noworodków gryzoni in vitro

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

Rozwój obwodów neuronalnych i lokomocji można badać, analizując zachowanie centralnego wzorca generatora (CPG) rdzenia kręgowego noworodków gryzoni. Przedstawiamy...

Witajcie. Nazywam się Resh Gary Dory i jestem asystentem badawczym w laboratorium faf w Instytucie Badań Biologicznych Salka. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wykonać zewnątrzkomórkowe elektrody ssące przy użyciu dwóch metod. Elektrody te można wykorzystać do rejestracji elektrofizjologicznej rdzeni kręgowych in vitro.Użyj lampy alkoholowej jako źródła ciepła, aby stopić plastikową rurkę PE 90 do pożądanej szerokości. Trzymaj rurkę nad zapalonym płomieniem i zdejmij ją w momencie, gdy zacznie się topić, a następnie delikatnie rozciągnij końce, uważając, aby nie przerwać rurki w środkowej części. Proces ten jest pokazany ponownie.Zdjąć rurkę w momencie, gdy zacznie mięknąć i topić się, a następnie delikatnie rozsunąć jej końce. Odciąć rurkę ostrym ostrzem żyletki w miejscu odpowiadającym przybliżonej szerokości próbki do pomiaru na grubszym końcu rurki. Cięcie wykonać pod kątem 45 stopni.Teraz należy zainstalować pierścień zaciskowy i O-ring na grubszym końcu. Wsuń ten koniec rurki przez sześciokątny otwór pierścienia zaciskowego. Następnie wsuń koniec rurki do gumowego O-ringu.Ten zestaw zostanie przykręcony do przedniej części elektrody. Odetnij odcinek rurki Zeus o długości 1 cm za po

spinal-cord-electrophysiology-ii-extracellular-suction-electrode

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawek zewnątrzkomórkowych

Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Ten film prezentuje nagrania elektrofizjologiczne z organotypowych kokultur wycinków rdzenia kręgowego, uchwycone za pomocą matrycy wieloelektrodowej lub urządzenia MEA. Nagrania te oceniają regenerację neuronów między warstwami. Zaobserwowana zsynchronizowana aktywność elektryczna potwierdza udaną regenerację neuronów.

Zapisy elektrofizjologiczne do oceny regeneracji neuronów w współhodowanych wycinkach rdzenia kręgowego

Ten film pokazuje wykonanie płaskiej elektrody do owijania nerwów. Prezentuje integrację metalu ekranującego i precyzyjnych warstw polimeru w celu uzyskania efektywnej powierzchni nagrywania. Proces ten polega na łączeniu, utwardzaniu, przycinaniu i cięciu warstw polimerowych w celu uzyskania optymalnego kontaktu nerwowego i dokładnego rejestrowania sygnału.

Wytwarzanie elektrod nerwowych z płaskim interfejsem do rejestrowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę wszczepienia systemu elektrod na głowę znieczulonemu szczurowi w celu wykrywania napadów w czasie rzeczywistym. Zabieg polega na umieszczeniu elektrod stymulacyjnych i rejestrujących, zabezpieczeniu ich cementem dentystycznym oraz podłączeniu do wzmacniacza montowanego na głowie.

Implantacja systemu elektrod na głowie w modelu szczurzym w celu wykrywania napadów w czasie rzeczywistym

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Ten artykuł zawiera szczegółowy opis procesu produkcji płaskiej elektrody nerwowej o wysokiej gęstości kontaktu (FINE). Elektroda ta jest zoptymalizowana pod kątem selektywnego rejestrowania i stymulowania aktywności neuronalnej w nerwach obwodowych.

Wytwarzanie elektrod nerwowych o płaskim interfejsie o dużej gęstości kontaktowej do zastosowań związanych z rejestracją i stymulacją

Ten szczegółowy protokół opisuje umieszczanie elektrod stymulacji przezczaszkowej na kości skroniowej w celu zbadania krótko- i długoterminowych efektów przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u swobodnie poruszających się szczurów.

Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji wszczepialnego systemu do chronologicznego zapisu in vivo wywołanych i spontanicznych potencjałów elektromiograficznych. System jest stosowany do badania unerwienia mięśni krtani po uszkodzeniu nerwów.

Wszczepialny system do przewlekłej elektromiografii in vivo

Ten protokół opisuje metodę wykorzystującą patch-clamp do badania elektrycznych reakcji neuronów ruchowych na stymulację rdzenia kręgowego (SCS) z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, co może pomóc badaczom poprawić ich umiejętności w rozdzielaniu rdzenia kręgowego i jednoczesnym utrzymywaniu żywotności komórek.

Przygotowanie ex vivo wycinka rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach ruchowych podczas stymulacji rdzenia kręgowego

Naszym celem było dostarczenie zaktualizowanego, łatwego do zrozumienia przewodnika na temat produkcji i testowania elektrod do elektromiografii epimysalnej. W tym celu udostępniamy instrukcje dotyczące pozyskiwania materiałów oraz szczegółowy przewodnik po procesie produkcji i testowania.

Opracowanie taniej elektrody do elektromiografii epimysjalnej: uproszczony przepływ pracy przy produkcji i testowaniu

Naucz się wytwarzać zewnątrzkomórkowe elektrody ssące do elektrofizjologicznych pomiarów rdzenia kręgowego noworodków gryzoni in vitro. Metoda obejmuje topienie rurki PE 90 lampą alkoholową.

Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów