Name: Podwiązanie tętnicy wieńcowej i iniekcja domięśniowa w mysim modelu zawału (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj mikrochirurgiczne techniki podwiązania tętnicy wieńcowej i iniekcji domięśniowej w sercu myszy. Metoda ta umożliwia badanie uszkodzeń niedokrwiennych i procesów reperfuzyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragnę podziękować Wydziałowi Badań i Studiów Podyplomowych za zapewnienie środków na wsparcie moich badań oraz Wydziałowi Medycyny Porównawczej za ich czujność i pomoc. Chciałbym również wyrazić uznanie dla Wydziału Fizjologii za wsparcie i wskazówki, a także studentom i technikom w moim laboratorium za ich pomoc. Na koniec dziękuję mojemu mentorowi w okresie postdoktorskim, dr. Charlesowi E. Murry'emu, za możliwość odbycia szkolenia, podczas którego opanowałem mikrochurgię myszy.

<ol>
	<li>Jałowe instrumenty chirurgiczne (Tabela 1) oraz 3-calowe aplikatory z końcówką watną umieszcza się na jałowej podkładce. Sterylizator koralikowy (Germinator 500) zostaje włączony.</li>
	<li>Myszy (wiek: &gt; 6 tygodni; masa ciała: &gt; 18 g) poddaje się znieczuleniu poprzez wstrzyknięcie dojamowe (i.p.) 20 µl/g masy ciała tribromoetanolu (250 mg/kg; czas trwania – około 40 minut).</li>
	<li>Gdy myszy przestaną reagować na uciśnięcie palca u stopy, do oczu aplikuje się jałowy lubrykant (Tears Renewed), aby chronić je przed wysychaniem, a lewą stronę klatki piersiowej pokrywa się preparatem depilacyjnym (np. Nair) w celu usunięcia sierści ze skóry.</li>
	<li>Preparat depilacyjny zmywa się ciepłą bieżącą wodą, a obszar operacyjny dezynfekuje się za pomocą tamponów z betadyną/alkoholem.</li>
	<li>Mysz umieszcza się na ciepłej izotermicznej podkładce deltaphase przymocowanej do stołu z pleksiglasu. Każdą kończynę unieruchamia się za pomocą taśmy, a pod górnymi zębami poziomo umieszcza się grubą nić, aby utrzymać szczękę górną w stałej pozycji.</li>
	<li>Stół ustawia się pionowo, a światło z włókna światłowodowego kieruje się bezpośrednio na obszar szyi w celu iluminacji przezezygealnej. Wymaga to precyzyjnego ustawienia, tak aby otwór gardła był widoczny jako dobrze oświetlony otwór, co umożliwia wizualizację tchawicy i ułatwia wprowadzenie rurki PE.</li>
	<li>Rurkę podłącza się następnie do respiratora (podłączonego do mieszanki 95% O2/5% CO2), aby zastosować wentylację z dodatnim ciśnieniem (respirator TOPO; częstotliwość 125 oddechów/min; szczytowe ciśnienie wdechowe 10-12 cmH2O; *uwaga: ustawienia różnią się w zależności od szczepu i płci 1-3). Po potwierdzeniu wentylacji poprzez synchroniczne ruchy klatki piersiowej, połączenie mocuje się do podkładki taśmą, aby uniknąć ekstubacji podczas operacji.</li>
	<li>Używając pęsety z ząbkami do odciągnięcia skóry od klatki piersiowej, jałowym ostrzem skalpela nr 10 zamocowanym do rękojeści nr 3 wykonuje się nacięcie skóry o długości 1,5 cm równolegle do mostka.</li>
	<li>Zakrzywione mikronożyczki Vanna służą do przecięcia mięśni piersiowych i wykonania małego otworu w mięśniu międzyżebrowym.</li>
	<li>Prostymi, tępymi mikronożyczkami przecina się 3 żebra.</li>
	<li>Do rozszerzenia klatki piersiowej używa się 9-milimetrowego pediatrycznego rozwieraka okulistycznego.</li>
	<li>Używając zakrzywionej pęsety, odciąga się osierdzie od serca, a następnie za pomocą pęsety z ząbkami delikatnie je rozdziera.</li>
	<li>Używając prowadnicy igieł Castroviejo, igłą 3/8 o zwężonym ostrzu i długości 6 mm przeprowadza się szew polietylenowy 8-0 pod lewą przednią zstępującą tętnicą wieńcową (wzdłuż długiej osi serca), prostopadle do niej.
		<ol>
			<li>W przypadku ligatury tymczasowej, którą można usunąć w celu przeprowadzenia czasowej reperfuzji, na sercu, równolegle do tętnicy wieńcowej, umieszcza się jałowy fragment PE90 o długości 0,5-1 cm. Szew, który najpierw zapętlono pod tętnicą wieńcową, przywiązuje się następnie do rurki. W momencie planowanego zwolnienia, ligatura zostaje poluzowana. Czynność tę można powtarzać według uznania, a czas okluzji/reokluzji można modyfikować 4. W zależności od długości protokołu i zastosowanego rodzaju znieczulenia może być konieczne podanie dodatkowych dawek leku.</li>
			<li>W przypadku okluzji trwałej, ligaturę przeprowadzoną pod tętnicą wieńcową po prostu zawiązuje się. Widoczne staje się blaknięcie i dyskinezja, a następnie odcina się długi koniec szwu 5-10.</li>
			<li>W przypadku wstrzyknięć wewnątrzmięśniowych, jałową strzykawkę Hamiltona z jałową igłą skośną 30 G wprowadza się do podstawy serca powyżej obszaru uszkodzenia po prawej stronie ligatury. Igłę przesuwa się następnie do obszaru uszkodzenia i lekko wycofuje, aby skos był widoczny mniej więcej w strefie granicznej. Część roztworu ze strzykawki (2-3 µl) wstrzykuje się do serca, utrzymując igłę w miejscu. Strzykawkę wycofuje się o kolejne 1-3 mm i wstrzykuje resztę roztworu. Strzykawkę trzyma się w miejscu do czasu rozproszenia się powstałej pęcherzyka roztworu. Następnie usuwa się igłę. W przypadku wystąpienia krwawienia, aplikator z końcówką watną delikatnie dociska się do miejsca wkłucia igły, aż krwawienie ustanie 5-7.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu manipulacji na mięśniu sercowym usuwa się rozwieraki żeber, a jamę klatki piersiowej zamyka się 2-3 szwami materacowymi przy użyciu nici surgipro 6-0.</li>
	<li>Następnie wykonuje się dwa lub trzy szwy materacowe w celu zamknięcia mięśni piersiowych, aplikuje się 1-3 krople 0,25% markainy w proporcji 1:10 w jałowej soli fizjologicznej (0,1 ml/25 g myszy) na mięsień, a następnie wykonuje się 2-3 szwy materacowe w celu zamknięcia skóry.</li>
	<li>Mysz odłącza się od respiratora. Po potwierdzeniu rytmicznego, szybkiego i płytkiego oddychania można przeprowadzić ekstubację myszy.</li>
	<li>0,5 ml ciepłej jałowej soli fizjologicznej wstrzykuje się do podskórnej przestrzeni grzbietowej, a mysz umieszcza się na podkładce grzejnej w klatce, aż odzyska sprawność ruchową (minimum 1 godzina).</li>
	<li>W eksperymentach z przeżyciem myszy umieszcza się z powrotem w klatkach i przenosi do wiwarium do czasu utylizacji. Przez pierwsze 2 dni na dnie klatki umieszcza się zwilżony pokarm, aby ułatwić jedzenie (tak, aby myszy nie musiały się wyciągać, co mogłoby powodować ból), a buprenorfinę należy podawać co 6-12 godzin. Opieka pooperacyjna obejmuje również codzienne monitorowanie w pierwszym tygodniu w celu weryfikacji odpowiedniej ruchliwości, pielęgnacji i nawyków żywieniowych.</li>
	<li>Instrumenty chirurgiczne przeciera się etanolem i umieszcza w sterylizatorze koralikowym przed kolejną operacją.</li>
	<li>W momencie utylizacji myszy poddaje się znieczuleniu sodem pentobarbitalu (65 mg/ml; 55-65 mg/kg). Po osiągnięciu odpowiedniego stopnia znieczulenia otwiera się jamę klatki piersiowej.</li>
	<li>Gdy serce wciąż bije, strzykawką z igłą 23 G zawierającą zimny chlorek potasu (KCl, 30 mM) lub monoksym 2,3-butanodionu (BDM; 10 mM) nakłuwa się tylny obszar podstawy komory i powoli wstrzykuje roztwór do komory, aż do zatrzymania serca w rozkurczu.</li>
	<li>Po usunięciu serca, strzykawką z PBS wykonuje się wsteczną perfuzję płuczącą serce, aby usunąć pozostałą krew. W badaniach ostrych, pod koniec okresu reperfuzji, LAD zostaje ponownie podwiązana w pierwotnym miejscu okluzji. Do aorty wstrzykuje się roztwór zawierający 1% błękitu Evansa. Po wyjęciu serca przecina się je poprzecznie na 3 sekcje o jednakowej grubości, inkubuje w 1% chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolium i wykonuje obrazowanie do analiz morfometrycznych 11. W badaniach chronicznych serce zanurza się w utrwalaczu, a następnie przetwarza i zatapia zgodnie z rutynowymi procedurami. Preparaty mogą być następnie barwione histologicznie i obrazowane do analiz morfometrycznych (przy użyciu Scion, NIH Image J lub Image Pro Plus) 9,10,12.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu, przeżywalność myszy (samce: wiek 8-10 tygodni, 22-28g; samice: wiek 10-12 tygodni, 20-26g) wynosi: ponad 90% w eksperymentach nad ostrym niedokrwieniem/reperfuzją i prekondycjonowaniem niedokrwiennym, ponad 85% w badaniach nad trwałą ligacją tętnicy oraz około 80% w przypadku wtryskiwań wewnątrzmięśniowych do mięśnia sercowego. Ponieważ wczesne uszkodzenia są łatwiej dostrzegalne poprzez zmiany metaboliczne niż strukturalne, wyznaczanie wielkości zawału w eksperymentach nad niedokrwieniem/reperfuzją i prekondycjonowaniem niedokrwiennym przeprowadza się poprzez podanie 1% barwnika błękitu Evansa do aorty, który upłynni części serca niezaopatrywane przez LAD (Rycina 1A). Po wycięciu serca i przecięciu go poprzecznie na pół, tkankę inkubuje się w 1% roztworze chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliوم w celu pomiaru wielkości zawału (Rycina 1B). Powierzchnie mierzy się przy użyciu oprogramowania obrazującego Scion lub NIH, które można skalibrować za pomocą mikrometru obrazowanego przy tym samym powiększeniu. Wartości te są wykorzystywane do obliczenia stosunku obszaru zagrożonego do lewej komory oraz wielkości zawału do obszaru zagrożonego 11. Różnice między szczepami mogą prowadzić do zmienności masy ciała i wielkości serca, dlatego w celu porównawczym należy dbać o normalizację tych pomiarów do masy serca, masy ciała lub długości kości piszczelowej.
Trwałe podwiązanie tętnicy prowadzi do makroskopowych zmian strukturalnych, takich jak martwica, ścieńczenie ścian i rozszerzenie komory. Porównanie wpływu leczenia i/lub czasu na wielkość zawału i martwicę w stosunku do lewej komory, powierzchnię komory, grubość ściany przegrody oraz wolnej ściany lewej komory w modelu trwałej okluzji (Rycina 2A) można również przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do obrazowania Scion lub NIH. Barwienie kolagenu przy użyciu czerwieni picrosirius/fast green (Rycina 2B) może służyć do pomiaru włóknienia śródmiąższowego, które koreluje z funkcjonalnymi wskaźnikami sztywności ściany8-10. Obraz na Rycinie 3 przedstawia rozkład 6ul roztworu (błękitu Evansa) wstrzykniętego w strefę przyzawałową serca po trwałym podwiązaniu tętnicy. Należy zauważyć, że roztwór przemieszcza się w kierunku uszkodzenia, a także w stronę podstawy i przez całą grubość ściany.
<img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="Proces resekcji chirurgicznej; A) lokalizacja guza; B) próbka tkanki po resekcji; procedura medyczna" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A. Błękit Evansa wstrzyknięty do aorty przed wycięciem. Obraz przedstawia obszary serca poddane perfuzji (zabarwione) oraz obszar zamknięty (niezabarwiony). B. Barwienie Błękitem Evansa i TTC po ostrym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym. Jest to reprezentatywny obraz (20x) pokazujący rozkład niebieskiego barwnika, który zabarwił obszary niezamknięte, a także barwienie TTC tkanki metabolicznie żywej (czerwona). Obszary martwicze nie ulegają zabarwieniu, przez co pozostają blade (obrysowane).
<img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="Przekrój histologiczny, tkanka serca, preparaty barwione, przedstawiające strukturę komór, analiza porównawcza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. A. Barwienie hematoksyliną i eozyną. Jest to reprezentatywny obraz (20x) barwienia H&amp;E serca myszy przekrojonego poprzecznie przez obszar zawału 4 dni po MI (20x). Symbol * oznacza martwicę tkanki, strzałki wskazują tkankę ziarninową, RV = prawa komora i LV = lewa komora. B. Barwienie czerwienią picrosirius i fast green. Jest to reprezentatywny obraz (20x) barwienia czerwienią picrosirius/fast green przekroju serca myszy 4 tygodnie po MI. Cytoplazma barwi się na zielono, a włókna kolagenowe na czerwono. 
<img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="Wyniki eksperymentu z ligacją serca; widoki przedni, boczny, wierzchołek, przekroje poprzeczne; analiza niedokrwienia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rozkład barwnika Evan's Blue po wstrzyknięciu 6ul wewnątrzmięśniowo do serca. Jest to reprezentatywny obraz przedstawiający globalny i transmuralny rozkład barwnika Evan's Blue w całym sercu po wstrzyknięciu 6ul wewnątrzmięśniowo w strefie granicznej bezpośrednio po ligacji tętnicy wieńcowej (12x).

Niniejszy protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony i jest zgodny z wytycznymi oraz przepisami ustanowionymi przez Institutional Animal Care and Use Committee na East Carolina University.

Choroba wieńcowa pozostaje istotnym problemem zdrowia publicznego, zarówno pod względem epidemiologicznym, jak i finansowym. Wciąż niezbędne są znaczące badania podstawowe, aby zrozumieć mechanizmy, zgodnie z którymi postępują uszkodzenia i przebudowa, oraz w jaki sposób potencjalne terapie mogą modulować te procesy, jeśli mają zostać opracowane do zastosowań klinicznych. Najczęściej wykorzystuje się gryzonie, a szeroki zakres dostępnych myszy modyfikowanych genetycznie sprawia, że gatunek ten jest bardziej atrakcyjnym modelem.
Mimo że istnieją różnice między myszami a innymi gatunkami, model mysi oferuje wiele zalet. Użycie prostego mikroskopu sekcyjnego lub lupy oraz odpowiednie oświetlenie pozwalają na łatwe uwidocznienie naczyń krwionośnych (szczegółową anatomię makroskopową naczyń krwionośnych opisano w pracy Salto-Tellez et al., 200413). Aby zmniejszyć ryzyko śmiertelności pooperacyjnej, bardzo ważne jest unikanie przecinania dużych naczyń, ponieważ całkowita objętość krwi u myszy o masie 25g wynosi mniej niż 2ml14. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia, w celu jego zahamowania można zastosować delikatny ucisk lub kauteryzację punktową.
Procedurę tę można również zmodyfikować na różne sposoby. Na przykład myszy można znieczulić izofluranem, ketaminą/ksylazyną lub pentobarbitalem sodu, a właściwy wybór zależy od czasu trwania protokołu.15-18Odruch uciskowy palca stopy jest najczęściej stosowanym wskaźnikiem głębokości znieczulenia. Ponadto, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa długoterminowego przeżycia, niektórzy badacze stosują leki przeciwarytmiczne, takie jak lidokaina, aby zmniejszyć częstość występowania śmiertelnych arytmii.19,20 należy jednak wziąć pod uwagę, że ostatnio wykazano, iż posiada ono właściwości antyapoptotyczne w modelu ostrym21Dodatkowo, w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego, przez pierwsze 48 godzin po zabiegu można podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina.3,16,17,22,23Aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji (zwłaszcza w przypadku dłuższych protokołów), zamiast podkładki izotermicznej często stosuje się sondę rektalną połączoną szeregowo z podkładką grzewczą. W przypadku niedokrwienia/reperfusji i/lub przedwarunkowania lub powarunkowania niedokrwiennego: czas trwania zakrzepicy (zakrzepic) i reperfuzji (reperfuzji) może ulec zmianie; w przypadku trwałego zamknięcia naczynia wielkość obszaru zawału może być modyfikowana poprzez dostosowanie miejsca założenia ligatury; a w przypadku wstrzykiwań domięśniowych (np. komórek, białek) może być od 1 do 3 miejsc wstrzyknięcia, a objętość pojedynczej dawki może wynosić do 15 μl.24. W przypadku wstrzykiwania komórek, należy podać rozmiar użytej igły (zazwyczaj 26-30 G)5,25,26 należy dobrać na podstawie wielkości komórek, tak aby średnica wewnętrzna igły była wystarczająco duża, by uniknąć sił ścinających. Aby uniknąć czynników zakłócających wynik wynikających z procesów zapalnych wywołanych zabiegiem chirurgicznym, niektórzy badacze zgłaszali zastosowanie pętli, którą manipuluje się ex vivo aby przeprowadzić okluzję i reperfuzję serca u myszy z zamkniętą klatką piersiową w dowolnym momencie po zabiegu chirurgicznym27-29W ostatnim czasie Gao i wsp.30 wykazali, że czasowe i trwałe zamknięcie można przeprowadzić bez konieczności stosowania wentylacji, a niektóre laboratoria zaczęły wykorzystywać ultradźwięki do wykonywania domięśniowych iniekcji wewnątrzmiąższowych przy zamkniętej klatce piersiowej25,31.
Od czasu opublikowania przez Johnsa i Olsona w 1954 roku32 pierwszej pracy wykazującej możliwość przeprowadzenia ligacji tętnicy wieńcowej u myszy, wielu innych badaczy przyjęło ten model i zmodyfikowało go w celu badania różnych aspektów uszkodzenia i przebudowy mięśnia sercowego3,33-45. Cechy myszy, takie jak niewielki rozmiar, zdolność rozrodcza oraz stosunkowo niższe koszty zakupu i utrzymania, sprawiają, że gatunek ten jest atrakcyjnym narzędziem w szerokim zakresie badań fizjologicznych i patofizjologicznych. Wraz z postępem w miniaturyzacji technologii obrazowania in vivo46-49, a także rozwojem metod przeprowadzania i analizy genomiki i proteomiki na dużą skalę, przesiewania leków, badania skuteczności terapii opartych na komórkach i/lub białkach oraz biomateriałów50-64, w połączeniu z coraz szerszym zakresem manipulacji genetycznych umożliwianych przez powszechnie dostępne lub tkankowo specyficzne myszy transgeniczne bądź mutanty/knockouty, mysi model zawału mięśnia sercowego bez wątpienia pozostanie nieocenionym narzędziem w ocenie ostrego uszkodzenia serca i długoterminowej przebudowy. W związku z tym, umiejętność niezawodnego i powtarzalnego przeprowadzania tych eksperymentów ma niepodważalną wartość.

<table><tbody><tr><td>Długie nożyczki Vanna</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-159</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-nożyczki sekcyjne</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-161</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta &amp;#8211; prosta, 1x2 ząbki</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-205</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela nr 3</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-64</td><td>sterylne ostrze nr 10</td></tr><tr><td>Pinceta &amp;#8211; półzakrzywiona, ząbkowana</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-19</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki tkankowe</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-410</td><td></td></tr><tr><td>Igłotrzymacz Castroviejo</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-1828</td><td></td></tr><tr><td>Wziernik do oka Cooka</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-63</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 8-0</td><td>Suture Express</td><td>VP-900-X</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Suture Express</td><td>8776</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator koralikowy Germinator 500</td><td>Cellpoint Scientific</td><td>65369-1</td><td></td></tr><tr><td>Mata izotermiczna Deltaphase</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona - 25&amp;mu;l</td><td>Hamilton Co</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>Igła skośna G 30</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO</td><td></td></tr></tbody></table>

podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Modele mysie są cennym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia i przewlekłego przebudowywania mięśnia sercowego in vivo. Wraz z pojawieniem się modyfikacji genetycznych całego organizmu lub mięśnia sercowego oraz szerokiej gamy materiałów biologicznych i/lub syntetycznych, istnieje ogromny potencjał, aby dowolna kombinacja tych metod złagodziła zakres ostrego uszkodzenia niedokrwiennego i zahamowała wystąpienie niewydolności serca następującej po przebudowie mięśnia sercowego.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metody i materiały wykorzystywane do niezawodnego przeprowadzenia tej mikrochirurgii oraz modyfikacje stosowane w badaniach nad tymczasową (z reperfuzją) lub trwałą okluzją tętnicy wieńcowej, a także przy wstrzykiwaniach domięśniowych. Efekty w obrębie serca, które można zaobserwować w trakcie procedury oraz po zakończeniu eksperymentu, wraz z oceną histologiczną, posłużą do weryfikacji skuteczności.
Krótko mówiąc, przygotowanie chirurgiczne obejmuje znieczulenie myszy, usunięcie futra z klatki piersiowej, a następnie dezynfekcję pola operacyjnego. Intubację dotchawiczą przeprowadza się przy użyciu iluminacji przezezyofagealnej z wykorzystaniem światłowodu. Następnie rurkę podłącza się do respiratora. Nacięcie wykonane na klatce piersiowej odsłania mięśnie piersiowe, które zostają przecięte w celu odsłonięcia żeber. W badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją stosuje się 1 cm fragment rurki PE umieszczony nad sercem, do którego przywiązuje się ligaturę, co pozwala na dostosowanie procesu okluzji/reperfuzji. Do iniekcji domyocardialnych używa się strzykawki Hamiltona ze sterylną igłą skośną o rozmiarze 30gauge. Po zakończeniu manipulacji na mięśniu sercowym kolejno zamyka się klatkę piersiową, mięśnie piersiowe oraz skórę. Analgezję blokową linii wykonuje się za pomocą 0,25% marcainy w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, którą aplikuje się do warstwy mięśniowej przed zamknięciem skóry. Myszy otrzymują podskórny zastrzyk soli fizjologicznej i są umieszczane w komorze grzewczej, aż do momentu przyjęcia pozycji grzbietnej. Następnie są one przenoszone do wiwarium i utrzymywane w standardowych warunkach do czasu pobrania tkanek. W momencie poświęcenia myszy są znieczulane, a serce zostaje zatrzymane w rozkurczu za pomocą KCl lub BDM, przepłukane solą fizjologiczną i zanurzone w utrwalaczu. Następnie przeprowadza się rutynowe procedury przetwarzania, zatapiania, krojenia i barwienia histologicznego. 
Niesurgicalna intubacja myszy oraz opisane manipulacje mikrosurgicalne sprawiają, że jest to model trudny technicznie do opanowania i uzyskania powtarzalności. Procedury te, w połączeniu z trudnością w wykonywaniu spójnych manipulacji ligaturą w celu zaplanowanych w czasie okluzji i reperfuzji lub iniekcji domięśniowych, mogą również wpływać na przeżywalność, dlatego optymalizacja i spójność są kluczowe.

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Modele mysie stanowią cenne narzędzie do badania in vivo ostrego uszkodzenia oraz przewlekłego przebudowywania mięśnia sercowego. Wraz z pojawieniem się modyfikacji genetycznych w...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie mikrochirurgicznych metod wykonywania tymczasowej lub trwałej ligacji tętnicy wieńcowej, a także wtryskiwania substancji do mięśnia sercowego u myszy. Cel ten osiąga się poprzez wstępne przygotowanie i odkażenie obszaru operacyjnego. Następnie mysz zostaje zaintubowana rurką PE 90 w celu zapewnienia wentylacji z nadciśnieniem podczas torakotomii.Po wyizolowaniu tętnicę wieńcową można zamknąć tymczasowo lub trwale. Dodatkowo do serca można wstrzyknąć odpowiednią substancję. Wyniki pozwalają określić stopień uszkodzenia serca na podstawie punktów końcowych histologicznych i morfometrycznych, markerów białkowych w tkankach i surowicy, a także wskaźników funkcjonalnych.Nazywam się TKA Rag i pracuję w Katedrze Fizjologii w Brody School of Medicine na East Carolina University. Celem tego filmu jest zademonstrowanie procedur mikrochirurgicznych stosowanych do tymczasowego i trwałego podwiązania tętnicy wieńcowej, a także wstrzykiwania domięśniowego do serca myszy. Na początek należy umieścić sterylne narzędzia chirurgiczne oraz trzymające bawełniane aplikatory o długości trzech cali na sterylnym podkładzie.Następnie włącz sterylizator koralikowy, aby był gotowy do sterylizacji instrumentów pomiędzy poszczególnymi operacjami. Aby przygotować zwierzę do zabiegu, nanieś sterylny środek nawilżający na oczy znieczulonej myszy. Następnie usuń sierść z lewej strony klatki piersiowej za pomocą środka depilacyjnego, takiego jak nare.Dokładnie zetrzyj krem depilacyjny, aby uniknąć oparzeń chemicznych lub zapalenia skóry. Umieść mysz na izotermicznej podkładce fazy delta przymocowanej do stołu z pleksiglasu. Unieruchom każdą kończynę za pomocą taśmy i umieść grubą nitkę pod górnymi zębami, aby ustabilizować górną szczękę.Przemyj miejsce operacyjne Betadyną, a następnie alkoholem, powtarzając tę czynność łącznie trzy razy. Użyj światłowodu do oświetlenia obszaru szyi, aby ułatwić wizualizację tchawicy podczas wprowadzania rurki PE. Po oświetleniu ostrożnie wprowadź rurkę przez jamę ustną.Podłącz rurkę do respiratora w celu wprowadzenia wentylacji z dodatnim ciśnieniem. Po potwierdzeniu wentylacji poprzez synchroniczne ruchy klatki piersiowej, przymocuj połączenie do podkładki za pomocą taśmy, aby utrzymać je na miejscu. Podczas operacji użyj pęsety ząbkowanej, aby odciągnąć skórę od klatki piersiowej i wykonać nacięcie skóry o długości 1,5 centymetra równolegle do mostka.Następnie przy użyciu zakrzywionych mikronożyczek Vana należy przeciąć mięśnie piersiowe i wykonać niewielki otwór w mięśniach międzyżebrowych. Po odsunięciu mięśnia należy użyć prostych tępych mikronożyczek, aby przeciąć trzy żebra. Do odsunięcia klatki piersiowej należy użyć rozwieraka.Ostrożnie otwórz worek osierdziowy, aby uwidocznić serce, używając uchwytu do igieł TRO Viejo oraz nici z igłą o stożkowym czubku; przeprowadź szew polietylenowy pod lewą przednią tętnicą wieńcową, tworząc tymczasową ligaturę, którą można usunąć w celu przeprowadzenia reperfuzji czasowej. Odetnij fragment PE 90 o długości od 0,5 do 1 cm i umieść go na sercu. Równolegle do tętnicy wieńcowej zawiąż szew zapętlony pod tętnicą wieńcową do rurki. Po określonym czasie poluzuj ligaturę, aby umożliwić reperfuzję przed wykonaniem trwałej okluzji.Wiążany sznur założony pod tętnicą wieńcową zostaje zawiązany. Powinny pojawić się bladość i dyskinezja. Odciąć długi koniec nici chirurgicznej w celu wykonania wtryskiwów domięśniowych, a następnie wprowadzić sterylną igłę o rozmiarze 30G do podstawy serca powyżej obszaru uszkodzenia, na prawo od wiązania.Przesuń igłę do miejsca urazu i lekko ją wycofaj, tak aby ścięcie było widoczne mniej więcej w strefie granicznej. Wstrzyknij niewielką ilość roztworu i przytrzymaj igłę w miejscu. Wycofaj strzykawkę o kolejne jeden do trzech milimetrów i wstrzyknij resztę roztworu.Przytrzymaj strzykawkę w miejscu wkłucia, aż krew powstała w wyniku podania roztworu zniknie. Po jej ustąpieniu wyjmij igłę. W przypadku wystąpienia krwawienia delikatnie dociśnij aplikator z bawełnianym końcem do miejsca wkłucia, aż do momentu zatamowania krwawienia.Po zakończeniu manipulacji w mięśniu sercowym należy usunąć rozieracze żeber i zamknąć jamę klatki piersiowej za pomocą dwóch lub trzech szwów materacowych. Następnie należy zamknąć mięśnie piersiowe dwoma lub trzema szwami materacowymi. Na mięsień należy nanieść od jednej do trzech kropli 0,25% markeru w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, a następnie użyć dodatkowych dwóch lub trzech szwów materacowych do zamknięcia skóry.Odłącz mysz od respiratora i upewnij się, że występuje rytmiczny, szybki i płytki oddech. Wstrzyknij 0,5 milliliters ciepłej sterylnej soli fizjologicznej w przestrzeń podskórną grzbietu i umieść mysz w klatce z matą grzewczą do czasu odzyskania sprawności ruchowej. W przypadku eksperymentów dotyczących przeżywalności, myszy są umieszczane z powrotem w swoich klatkach macierzystych i przekazywane do wiwarium do czasu utylizacji.Przetrzyj narzędzia chirurgiczne etanolem w celu oczyszczenia, a następnie włóż je do sterylizatora koralikowego. Aby przygotować się do kolejnego zabiegu polegającego na pobieraniu próbek do analizy, wyizoluj serce i nakłuj igłą tylny obszar podstawy komory, zawierającą zimny chlorek potasu lub roztwór dwutlenku 2,3-butanodiolu. Powoli wstrzykuj roztwór do komory, aż do zatrzymania akcji serca w fazie rozkurczu. Wyjmij serce i przepłucz PBS, aby usunąć pozostałą krew.Po perfuzji serce należy zanurzyć w utrwalaczu, a następnie poddać procesowaniu i zatopieniu zgodnie ze standardowymi procedurami. Ostre uszkodzenie wywołane tymczasowym podwiązaniem można zwizualizować za pomocą barwienia. Na tym obrazie niebieski barwnik rozkłada się w obszarach zamknięcia naczyń w sercu, a barwienie TTC oznacza tkankę metabolicznie żywotną.Na czerwono zabarwione obszary nekrotyczne nie przyjmują barwnika i pozostają blade. Oprogramowanie do obrazowania można wykorzystać do obliczenia obszaru zagrożonego w stosunku do lewej komory oraz obszaru zawału w stosunku do obszaru zagrożonego. W tym przykładzie uszkodzone serce zostało przecięte w poprzek w regionie zawału, cztery dni po MI, i zabarwione hematoksyliną i eozyną.Gwiazdka oznacza martwicę tkanki, natomiast strzałki wskazują barwienie kolagenu w tkance ziarninowej przy użyciu prose. Do pomiaru włóknienia śródmiąższowego, które koreluje z wskaźnikami funkcjonalnymi sztywności ściany, można zastosować Sirius Red i Fast Green. Ten obraz serca myszy cztery tygodnie po MI pokazuje cytoplazmę na zielono, a włókna kolagenowe na czerwono.Ta seria obrazów przedstawia rozkład sześciu mikrolitrów roztworu barwnika błękitu Evansa wstrzykniętego w strefę graniczną serca po trwałym podwiązaniu tętnicy. Zwróć uwagę, że barwnik przemieszcza się w kierunku uszkodzenia, a także w stronę podstawy oraz przez ścianę. Wizualizacja tętnicy wieńcowej i jej niezawodne zamknięcie są bardzo trudne i wymagają dużej wprawy, aby osiągnąć biegłość.Podczas procedury bardzo ważne jest, aby unikać przebicia płuc, a ponadto zapobiegać ekstubacji zwierzęcia podczas manipulacji chirurgicznych.I.

coronary-artery-ligation-intramyocardial-injection-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ligatura tętnic wieńcowych i wstrzyknięcie do mięśnia sercowego w mysim modelu zawału

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano sposób wykorzystania szybkiego i wiarygodnego modelu do badania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych niedokrwienia mięśnia sercowego.

Ligacja LAD: mysi model zawału mięśnia sercowego

Procedura chirurgiczna stosowana w celu wywołania eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego u myszy rozpoczyna się od lewej torakotomii między trzecim a czwartym żebrem, aby umożliwić wizualizację przedniej powierzchni serca i lewego płuca. Następnie podwiązuje się lewą tętnicę wieńcową, zamyka klatkę piersiową i pozostawia mysz do samoistnego powrotu do sprawności.

Zmodyfikowana technika ligacji tętnicy wieńcowej u myszy

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na wygenerowaniu mysiego modelu zawału mięśnia sercowego poprzez trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej.

Generowanie mysiego modelu zawału mięśnia sercowego: zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej w modelu mysim

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji i główną przyczyną śmiertelności. Model trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy stosuje się do badania przebudowy komór i dysfunkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Przedstawiono technikę inwazyjnych pomiarów hemodynamicznych u myszy.

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy: model przebudowy po zawale mięśnia sercowego i niewydolności serca

Zapewniamy niezawodną metodę podwiązania lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) w modelu mysim. Metoda ta jest stosunkowo mniej inwazyjna niż inne metody, obejmujące intubację dotchawiczą, lewostronną torakotomię i toracentezę. Metoda ta może być stosowana jako model zarówno dla ostrego, jak i przewlekłego zawału mięśnia sercowego (MI).

Podwiązanie tętnicy wieńcowej lewej lewej przedniej zstępującej (LAD): ulepszony i uproszczony model zawału mięśnia sercowego

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Ten artykuł demonstruje model do badania przebudowy serca po kriouszkodzeniu mięśnia sercowego u myszy.

Model kriouszkodzeń do badania zawału mięśnia sercowego u myszy

Przedstawiono tutaj zabieg chirurgiczny trwałego podwiązania lewej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten można wykorzystać do zbadania patofizjologii i związanej z nią odpowiedzi zapalnej po zawale mięśnia sercowego.

Podwiązanie lewej tętnicy wieńcowej: chirurgiczny mysi model zawału mięśnia sercowego

Poznaj mikrochirurgiczne techniki podwiązania tętnicy wieńcowej i iniekcji domięśniowej w sercu myszy. Metoda ta umożliwia badanie uszkodzeń niedokrwiennych i procesów reperfuzyjnych.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Przeglądaj więcej filmów