Name: Analiza miomechaniczna izolowanych mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-22T18:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj technikę miomechaniczną do oceny siły i zmęczenia izolowanych mięśni szkieletowych u myszy. Ta metoda umożliwia ilościową analizę funkcji mięśniowej w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu Public Health Service (HL086513) z NHLBI dla P.E.O, kompleksowego grantu badawczego z California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), grantu Public Health Service (HL085377) z NHLBI oraz darowizny z Pollin Foundation dla H.S.B.
S.C. otrzymał wsparcie w ramach grantu California Institute for Regenerative Medicine Bridges to Stem Cell Research Award (TB1-01194) przyznanego San Francisco State University.

Protokół został wykonany za zgodą Instytucjonalnego Komitetu Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) UCSF.
1. Disekcja mięśnia prostownika długiego palców Extensor Digitorum Longus (EDL) myszy
<ol>
	<li>Wszystkie procedury z udziałem zwierząt należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Zwierzę należy uśmiercić, podając 20 mg/kg pentobarbitalu drogą dosytroniczną lub stosując zwichnięcie szyi bezpośrednio przed pobraniem mięśnia 10. Technikę sekcji należy dobrze przećwiczyć, tak aby mięsień mógł zostać pobrany i zamocowany w przetworniku napięcia w ciągu 15 minut od uśmiercenia.</li>
	<li>Tułowiec należy ułożyć na plecach na tacy sekcyjnej i przytwierdzić nogę do tacy.</li>
	<li>Pod mikroskopem sekcyjnym należy rozciąć skórę, ostrożnie otworzyć powięź (Rys. 1A) i odsunąć mięsień piszczelowy przedni od strony kostki w górę, aby odsłonić EDL (Rys. 1B). Aby utrzymać wilgotność mięśnia i zapewnić odpowiedni bufor podczas pobierania, należy stosować krople roztworu Ringera z mleczanem.</li>
	<li>Należy usunąć EDL, zachowując jak największą część ścięgna na każdym z końców, i umieścić go w naczyniu Petrigo zawierającym roztwór Ringera z mleczanem. Do każdego ze ścięgien mięśnia należy przywiązać szew (Rys. 1C). Kluczowe jest, aby podczas sekcji nie dotykać ani nie naruszać włókien mięśniowych.</li>
</ol>
2. Montaż mięśnia EDL myszy w miografie do pasków mięśniowych
<ol>
	<li>Do tych badań wymagana jest kąpiel tkankowa, która unieruchamia mięsień, umożliwiając jednocześnie jego zanurzenie w roztworze fizjologicznym o stałej temperaturze i ciągłym dotlenieniu. Kąpiel jest połączona z przetwornikiem siły w celu pomiaru napięcia mięśniowego. W tym celu stosujemy zintegrowany myograf do pasków mięśniowych firmy Danish Myo Technology (DMT Model 820MS). Ponadto, do wywoływania, rejestrowania i analizy odpowiedzi myomechanicznych niezbędny jest stymulator elektryczny impulsów prostokątnych (Grass Model S48) oraz platforma akwizycji danych (system akwizycji danych ADInstruments PowerLab oraz oprogramowanie LabChart). Model DMT 820MS posiada wbudowane w pokrywę komory elektrody platynowe, które są rozmieszczone po obu stronach mięśnia, w jego środkowej części. W przypadku innych myografów należy zwrócić szczególną uwagę na rozmieszczenie elektrod.</li>
	<li>Napełnić kąpiel myograficzną 5 mL roztworu Krebsa-Henseleita 1. Podgrzać do 25°C. Przez 15 minut przed użyciem przesycać kąpiel mieszaniną O2/CO2 (95%/5%).</li>
	<li>Za pomocą szwów rozciągnąć mięsień EDL między zaciskami myografu i unieruchomić ścięgna mięśnia EDL (Ryc.1D,E) w zaciskach. Należy uważać, aby nie ucisnąć samego mięśnia.</li>
	<li>Utrzymywać temperaturę kąpieli myograficznej na poziomie 25°C.</li>
</ol>
3. Analiza miomechaniczna
A. Napięcie drgawek
<ol>
	<li>Ustaw początkową długość w kąpieli w taki sposób, aby mięsień nie był wiotki.</li>
	<li>Wyznacz bodziec maksymalny (czas trwania 0,5 ms), regulując napięcie w celu uzyskania maksymalnego napięcia skurczu, a następnie ustaw bodziec na 20% powyżej wartości maksymalnej (aby uzyskać bodziec nadmaksymalny). W naszych badaniach bodziec nadmaksymalny jest zazwyczaj osiągany przy napięciu wyjściowym 40 V.</li>
	<li>Zweryfikuj sygnał wyjściowy ze stymulatora za pomocą oscyloskopu.</li>
	<li>Wyznacz długość optymalną, stopniowo rozciągając mięsień do momentu, aż nie nastąpi dalszy wzrost napięcia skurczu.</li>
	<li>Pozostaw mięsień na 3 min w celu stabilizacji.</li>
	<li>Zastosuj nadmaksymalny prostokątny bodziec (0,5 ms) przy długości optymalnej, używając elektronicznego stymulatora Grass S4, i zarejestruj wynik.</li>
	<li>Zarejestruj: krzywą napięcia skurczu (Pt w funkcji czasu; Rys. 2A).</li>
</ol>
B. Napięcie tężcowe
<ol>
	<li>Pozostawić mięsień w spoczynku przez 3 minuty.</li>
	<li>Zastosować serię stymulacji nadmaksymalnych przez 300ms z częstotliwością 150 Hz przy optymalnej długości, używając elektronicznego stymulatora Grass S4, a następnie zarejestrować wynik.</li>
	<li>Zarejestrować: krzywą napięcia tężcowego (Po w funkcji czasu; Rys. 2B).</li>
</ol>
C. Zależność siły od częstotliwości
<ol>
	<li>Pozostaw mięsień do odpoczynku na 3 minuty.</li>
	<li>Zależność siła-częstotliwość: zastosuj serie stymulacji nadmaksymalnych o częstotliwościach 30, 60, 10, 140 i 160 Hz, zachowując 3 minuty przerwy między każdą stymulacją (Rys.3). Alternatywnie, serie można aplikować przy 15, 25, 35, 45, 5, 65, 75, 10, 140 i 160 Hz w celu uzyskania lepszej rozdzielczości przy niższych częstotliwościach, gdzie siła ulega znaczącym zmianom.</li>
	<li>Wykres: zależność siły od częstotliwości (% maksymalnej siły w funkcji częstotliwości stymulacji).</li>
</ol>
D. Zmęczenie
<ol>
	<li>Zastosuj serię krótkich tężców: 60 Hz przez 30 ms (lub częstotliwość dostosowaną tak, aby uzyskać 50% siły szczytowej), co 3 sekundy przez 10 minut. Po 10 minutach siła tężcowa powinna spaść do poziomu plateau wynoszącego ok. 15% wartości początkowej (Ryc. 4).</li>
	<li>Wykreśl: zmęczenie niskoczęstotliwościowe (% maksymalnej siły w funkcji czasu).</li>
</ol>
E. Dodatkowe gromadzenie danych na koniec protokołu
<ol>
	<li>Przed zdjęciem mięśnia z miografu, ustaw go w optymalnej długości określonej w kroku III.A.4 i zmierz jego średnicę za pomocą mikrometrycznego okularu mikroskopu lub przymiaru suwmiarkowego. Oblicz pole przekroju poprzecznego (μm2).</li>
	<li>Zmierz masę mięśnia (mg), usuwając szwy i ważąc mięsień.</li>
	<li>Zważ mysz w celu oceny masy ciała (gm).</li>
</ol>
4. Obliczenia
<ol>
	<li>Stosunek masy mięśnia do masy ciała = 
	masa mięśnia/masa ciała</li>
	<li>Napięcie skurczowe, Pt (mN) = 
	maksymalne napięcie generowane podczas pojedynczego skurczu</li>
	<li>Specyficzne napięcie skurczowe (N/cm2) = 
	napięcie skurczowe (mN)/pole przekroju poprzecznego (μm2) x 105 N/mN•μm2/cm2</li>
	<li>Czas do osiągnięcia maksymalnego napięcia (ms) = 
	czas od początku skurczu do momentu osiągnięcia maksymalnego napięcia</li>
	<li>Czas połowy rozkurczu (ms) = 
	czas od maksymalnego napięcia do spadku napięcia o 50% wartości maksymalnej</li>
	<li>Napięcie tężcowe, PO (mN) = 
	maksymalne napięcie generowane podczas tężca</li>
	<li>Specyficzne napięcie tężcowe (N/cm2) = 
	napięcie tężcowe (mN)/pole przekroju poprzecznego (μm2) x 105 N/mN•μm2/cm2</li>
	<li>Maksymalna szybkość wzrostu napięcia tężcowego (N/s) = 
	maksymalna szybkość wzrostu napięcia podczas narastania napięcia w tężcu, tj. maksymalne nachylenie krzywej napięcia tężcowego (lub dPO/dt)</li>
	<li>Czas połowy rozkurczu w tężcu (ms) = 
	czas od zaprzestania stymulacji do spadku napięcia do 50% wartości z chwili zakończenia stymulacji</li>
	<li>Stosunek napięcia skurczowego do napięcia tężcowego, Pt/PO = 
	maksymalne napięcie skurczowe/maksymalne napięcie tężcowe</li>
	<li>Wskaźnik zmęczenia = 
	stosunek napięcia po dwóch minutach zmęczenia o niskiej częstotliwości do maksymalnego napięcia izometrycznego</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig1.jpg" alt="Preparacja i ustawienie do testowania mięśni; lokalizacja mięśnia piszczelowego przedniego (TA) i mięśnia prostownika długiego palców (EDL); aparat do pomiaru napięcia; analiza biomechaniczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Disekcja mięśnia EDL. A, Odsłonięcie mięśni kończyny tylnej. TA, mięsień piszczelowy przedni. B, odsłonięcie mięśnia prostownika długiego palców (EDL).C, Mocowanie szwów do ścięgien mięśnia prostownika długiego palców (EDL).D, Kąpiel z przetwornikiem napięcia (widok z boku). E, Mięsień EDL zamocowany w kąpieli (widok z góry). Mięsień jest zanurzony w buforze częściowo w celach ilustracyjnych; w praktyce mięsień powinien być całkowicie zanurzony, aby zapobiec jego wysychaniu.
<img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig2.jpg" alt="Wykresy skurczu serca przedstawiające napięcie (mN) w funkcji czasu (t), obrazujące szczytowe napięcie oraz czas połowy rozkurczu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykład krzywych napięcia. A, Przykład krzywej napięcia drżenia ilustrujący maksymalne napięcie drżenia (Pt), czas skurczu (CT) i połowa czasu relaksacji (HRT). Pasek skali, 1 s. B, Przykład krzywej napięcia tężcowego wykazujący maksymalne napięcie tężcowe (PProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.) oraz połowiczne napięcie tetaniczne w fazie relaksacji (HRTT). Pasek: 1 s.
<img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig3.jpg" alt="Wykresy stymulacji mięśni; wpływ częstotliwości na siłę, analizowany przy różnych wartościach Hz; wyniki doświadczalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykład analizy zależności siły od częstotliwości. A, Napięcia generowane przez stopniowo zwiększane częstotliwości stymulacji.B, Przykład pociągu impulsów o częstotliwości 30 MHz. Pasek skali, 80 ms. C, Przykład pociągu impulsów przy 140 MHz. Odcinek skali, 80 ms. D, Przykład krzywej siła-częstotliwość opracowanej na podstawie danych przedstawionych w AKształt krzywej siła-częstotliwość jest charakterystyczny dla siły mięśnia i może być porównywany pomiędzy mięśniami pochodzącymi od różnych zwierząt.
<img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig4.jpg" alt="Wykres przedstawiający spadek siły mięśniowej w czasie z podwykresami B-D obrazującymi krzywą siła-czas oraz analizę danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Przykład analizy zmęczeniowej przy niskiej częstotliwości. A, Spadki napięcia generowane w okresie stymulacji o niskiej częstotliwości. Przykłady pociągów impulsów w zaznaczonych punktach czasowych (B,C,D) przedstawiono poniżej. E, Przykład krzywej zmęczeniowej dla niskich częstotliwości, opracowany na podstawie danych przedstawionych w AKształt krzywej zmęczenia niskoczęstotliwościowego jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być porównywany pomiędzy mięśniami różnych zwierząt.

<ol><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).</li>
<li>Messina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+via+adeno-associated+virus+gene+transfer+promotes+skeletal+muscle+regeneration+and+enhances+muscle+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice.</a> FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+protects+mouse+extensor+digitorum+longus+skeletal+muscle+during+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).</li>
<li>MacIntosh, B. R., Willis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-frequency+relationship+and+potentiation+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).</li>
<li>Hayes, A., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+clenbuterol-treated+mdx+muscle+are+enhanced+by+low-intensity+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming.</a> J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).</li>
<li>Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+II.+Contractile+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+alpha-sarcoglycan+differently+affects+fast-+and+slow-twitch+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).</li>
<li>Chan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+for+speed%3A+contractile+properties+of+isolated+whole+EDL+muscle+from+an+alpha-actinin-3+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).</li>
<li>Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grip+force%2C+EDL+contractile+properties%2C+and+voluntary+wheel+running+after+postdevelopmental+myostatin+depletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl%22%5BJournal%5D)">Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice.</a> J Appl. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).</li>
<li>Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibre+bundles+from+mice+deficient+in+carbonic+anhydrase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II.</a> Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy szczegółowe podejście do oceny właściwości miomechanicznych wyizolowanego mięśnia kończyny tylnej myszy. Mięsień EDL, mimo że trudniejszy do wypreparowania ze względu na położenie za mięśniem tibialis anterior, jest łatwiejszy do oceny niż tibialis anterior dzięki wyraźnym przyczepom ścięgnistym do stawów kostki i kolana. Ścięgna te ułatwiają montaż w myografie pasków mięśniowych. W przeciwieństwie do niego, łatwiej dostępny mięsień tibialis anterior posiada szeroki, niemal pozbawiony ścięgien przyczep w stawie kolanowym, co sprawia, że jest on wyjątkowo trudny zarówno do wypreparowania bez uszkodzenia mięśnia, jak i do bezpiecznego zamocowania w myografie. Wskazujemy również, że szybkie umieszczenie mięśnia w natlenionej kąpieli w buforze fizjologicznym i odpowiedniej temperaturze jest niezbędne dla zachowania jego właściwości mechanicznych. Stwierdziliśmy, że w tych warunkach analiza ta może być powtarzana przez maksymalnie 30 minut bez istotnych zmian w odpowiedzi mięśnia. Wreszcie, kluczowe jest, aby nie dotykać włókien mięśniowych podczas procedur preparowania i montażu, ponieważ może to mieć niekorzystny wpływ na funkcję mięśnia i doprowadzić do niedoszacowania siły miomechanicznej. Stosując te procedury, analiza ta zapewnia solidne ilościowe podejście do oceny wpływu modyfikacji genetycznych na funkcję mięśni 6,7,8,9, a także do porównywania interwencji terapeutycznych w mysich modelach chorób mięśni 1,2,3,5.

<table><tbody><tr><td>szwy jedwabne 5-0</td><td>Oasis</td><td>MV682</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>pinceta Dupont #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne, proste</td><td>WPI</td><td>501241</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>Pinceta irydowa</td><td>WPI</td><td>15914</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; cel=&quot;_blank&quot;&gt;Oprogramowanie Lab Chart&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/&quot; cel=&quot;_puste&quot;&gt;ADInstruments&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; cel=&quot;_puste&quot;&gt;Wersja 7&lt;/a&gt;</td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>Miograf do pasków mięśniowych</td><td>DMT</td><td>820MS</td><td>Przetwarzanie napięcia</td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>WPI</td><td>501754</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>EZ</td><td>OS-5020</td><td>Stymulacja napięciowa</td></tr><tr><td>Pentobarbital, sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>Eutanazja</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/PL3508/&quot; Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;PowerLab &lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/&quot; cel=&quot;_puste&quot;&gt;ADInstruments&lt;/a&gt;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/PL3508/&quot; cel=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;8/30&lt;/a&gt;</td><td>Pozyskiwanie danych </td></tr><tr><td>Stymulator impulsów prostokątnych</td><td>Technologia traw</td><td>S48</td><td>Stymulacja napięciem</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannasa</td><td>WPI</td><td>14003</td><td>Chirurgia ogólna</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Roztwory i pożywki&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok JoVE&quot;&gt;&lt;em&gt;roztwór Ringera z mleczanem&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;µl&gt; &lt;li&gt;100 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;30 mM CH3CH(OH)COONa (mleczan sodu)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;4 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;$\text{CaCl}_2 \cdot 2\text{H}_2\text{O}$ (chlorek wapnia dwuwodny) &lt;ul&gt; &lt;li&gt;dostosować pH do wartości 6,75&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;&lt;em&gt;roztwór Krebsa-Henseleita&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;118 mM NaCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;4,7 mM KCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1,25 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1,2 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1,2 mM KH2PO4&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;25 mM NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;11 mM glukozy &lt;$\mu$l&gt; &lt;li&gt;dostosować pH do wartości 7,2–7,4 poprzez równoważenie z O2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gaz (95%/5%)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;&lt;em&gt;Pentobarbital&lt;/em&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;roztwór roboczy o stężeniu 5 mg/ml w wodzie sterylnej&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w leczeniu chorób mięśni 1,2,3, niezbędne są metody ilościowe pozwalające na pomiar generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonym mięśniu. Opisujemy szczegółowe podejście do oceny właściwości miomechanicznych w świeżo wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Opisujemy nieurazowy pobór mięśnia extensor digitorum longus u myszy, montaż mięśnia w myografie do pasków mięśniowych (Model 820MS; Danish Myo Technology) oraz pomiar maksymalnego napięcia drgającego i tężcowego, czasu skurczu i czasu połowy rozkurczu przy użyciu stymulatora impulsowego o przebiegu prostokątnym (Model S48; Grass Technologies). Wykorzystując te pomiary, demonstrujemy obliczanie specyficznego napięcia drgającego i tężcowego znormalizowanego do pola przekroju poprzecznego mięśnia, stosunku napięcia drgającego do tężcowego, krzywą zależności siły od częstotliwości oraz krzywą zmęczenia przy niskiej częstotliwości 4. Analiza ta dostarcza metody ilościowego porównania interwencji terapeutycznych w modelach mysich chorób mięśni 1,2,3,5, a także porównania wpływu modyfikacji genetycznych na funkcję mięśni 6,7,8,9.

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w leczeniu chorób mięśni 1,2,3, niezbędne są metody ilościowe umożliwiające pomiar siły ...

Celem tej procedury jest oznaczenie generowanej siły oraz podatności na zmęczenie izolowanego mięśnia szkieletowego jako sposób na ilościową ocenę efektów modyfikacji genetycznej lub terapii. Najpierw z tylnej kończyny myszy wypreparowuje się mięsień prostownik palców długi. Następnie mięsień jest montowany w urządzeniu do badań pasków mięśniowych (muscle strip myo).Kolejnym krokiem jest ustalenie napięcia stymulacji oraz wstępnego napięcia mięśnia, przy których osiągane jest maksymalne napięcie skurczu pojedynczego. Ostatnim etapem jest określenie zależności siły od częstotliwości dla mięśnia, a także momentu wystąpienia i stopnia zmęczenia przy stymulacji o częstotliwości od niskiej do tętniczej. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące mierzalne zmiany w właściwościach mechanicznych mięśnia za pomocą miografii.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy wysiłkowe, jest to, że miografia pozwala na ilościową ocenę siły i funkcji mięśni. Zastosowaliśmy tę metodę po raz pierwszy, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że w miarę testowania nowych terapii opartych na komórkach i bioinżynierii w przedklinicznych modelach zwierzęcych w chorobach mięśni, niezbędne są ilościowe pomiary do oceny funkcji mięśniowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mięśni i dystrofii mięśniowej, takie jak to, czy konkretne terapie lub modyfikacje genetyczne zmieniają funkcję mięśni.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki niezbędne do prawidłowego przygotowania mięśnia są trudne do opanowania. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, gdyż szybka i nietraumatyczna sekcja mięśni kończyn tylnych wymaga praktyki i nabytych umiejętności. Procedurę demonstrują naukowiec oraz student studiów magisterskich pracujący w naszych laboratoriach.Po eutanazji myszy umieść truchło stroną brzuszną do góry na tacy sekcyjnej i przypnij kończynę do tacy pod mikroskopem sekcyjnym. Roznij skórę i ostrożnie otwórz powięź. Następnie odwarstw mięsień piszczelowy przedni od kostki w górę, aby odsłonić mięsień prostownik palców długi (EDL).Podczas pobierania mięśnia należy zwilżać go kroplami roztworu Ringera z mleczanem. Następnie należy wypreparować mięsień EDL, zachowując jak najwięcej ścięgna na obu końcach i uważając, aby nie dotykać samych włókien mięśnia EDL. Mięsień EDL należy umieścić w szalce Petriego zawierającej roztwór Ringera z mleczanem.Następnie zawiąż szwy na każdym z ścięgien mięśniowych. W badaniach tych wykorzystuje się kąpiel tkankową do unieruchomienia mięśnia oraz przetwornik siły do pomiaru napięcia mięśniowego. Dodatkowo używa się stymulatora elektrycznego o przebiegu prostokątnym oraz platformy akwizycji danych do wywoływania, rejestrowania i analizy odpowiedzi mechanicznych.Kolejnym krokiem jest napełnienie kąpieli dla przeszczepu mięśniowego 6,5 mililitrów roztworu Krebsa, który służy jako roztwór satelicki. Podgrzej kąpiel do 25 °C i napowietrzaj roztwór Krebsa mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 15 minut. Za pomocą szwów na ścięgnach przenieś mięsień EDL do kąpieli.Zabeziecz ścięgna między zaciskami graftu mięśniowego. Należy uważać, aby nie zacisnąć samego mięśnia. Utrzymuj kąpiel z graftem mięśniowym w temperaturze 25 °C.Aby rozpocząć analizę napięcia, dostosuj początkową długość mięśnia tak, aby była ona równa początkowej długości mięśnia. Przy czasie trwania bodźca wynoszącym 0,5 milliseconds stopniowo zwiększaj napięcie, aby wyznaczyć bodziec wymagany do uzyskania maksymalnego napięcia skurczu pojedynczego.Następnie zwiększ stymulację o 20%, aby uzyskać bodziec supramaksymalny, który zazwyczaj wynosi około 40 V. Kolejnym krokiem jest stopniowe rozciąganie mięśnia aż do momentu, gdy nie nastąpi już dalszy wzrost napięcia skurczu. Taką długość uznaje się za optymalną długość mięśnia.Pozostaw mięsień do wyrównania na trzy minuty, a następnie utrzymując mięsień w jego optymalnej długości, podaj supramaksymalny impuls prostokątny i zarejestruj krzywą napięcia skurczu w tej figurze.Maksymalne napięcie skurczowe oznaczono jako pt. Czas skurczu oznaczono jako ct. Połowę czasu rozkurczu oznaczono jako HRT.Pasek reprezentuje jedną sekundę po trzy minutowym okresie odpoczynku. Pomiar napięcia tężcowego wykonuje się poprzez zastosowanie nadmaksymalnych bodźców o czasie trwania 300 milisekund z częstotliwością 150 hertz przy optymalnej długości. Procedura ta pozwala wygenerować krzywą napięcia tężcowego.Maksymalne napięcie tytaniczne oznaczono jako po. Połowę napięcia tytanicznego w fazie relaksacji oznaczono jako HRTT. Słupek reprezentuje jedną sekundę po trzy minutowym okresie odpoczynku.Rozpocznij analizę częstotliwości siły, stosując 300 milisekundowe serie stymulacji supermaksymalnych przy częstotliwościach 30, 60, 100, 140 i 160 Hz. Po trzyminutowym okresie odpoczynku zachowaj trzy minuty przerwy między każdą serią stymulacji. Rozpocznij analizę zmęczenia, stosując serie krótkich impulsów o częstotliwości 60 Hz przez 300 milisekund co trzy sekundy przez 10 minut.Siła tetaniczna powinna spaść do poziomu plateau wynoszącego około 15% wartości początkowej. Po zakończeniu pomiarów siły przy optymalnej długości mięśnia, należy zmierzyć jego średnicę za pomocą okularu mikroskopu. Następnie należy usunąć szwy i zważyć mięsień w celu określenia jego masy.Ostatnim krokiem jest zważenie myszy w celu oceny masy ciała. Pomiary te są wykorzystywane do obliczeń opisanych w towarzyszącym artykule. Na tym rysunku przedstawiono wzrost napięcia generowanego wraz ze zwiększaniem częstotliwości stymulacji pokazanej na wykresie.Oto odpowiedź mięśnia na pociąg impulsów o częstotliwości 30 Hz. Ten rysunek przedstawia większą siłę uzyskaną przy pociągu impulsów o częstotliwości 140 Hz. Wykres ten pokazuje zależność siły od częstotliwości, przedstawioną jako procent maksymalnej siły w funkcji częstotliwości stymulacji.Kształt krzywej siła-częstotliwość jest charakterystyczny dla siły mięśnia i może być wykorzystany do porównywania mięśni pochodzących od różnych zwierząt. Ten wykres demonstruje zmęczenie mięśnia w ciągu 10 minut stymulacji o niskiej częstotliwości. Te wykresy przedstawiają odpowiedź mięśnia na serię bodźców w wskazanych punktach czasowych.Wykres ten przedstawia zmęczenie mięśni o niskiej częstotliwości jako procent maksymalnej siły w funkcji czasu. Kształt krzywej zmęczenia niskoczęstotliwościowego jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być wykorzystany do porównywania mięśni pochodzących od różnych zwierząt. Po opanowaniu tej techniki, procedura ta może zostać przeprowadzona w 30 minut.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy i w jakim stopniu specyficzne białka miogenne oraz markery komórek macierzystych są ekspresowane w traktowanym mięśniu podczas wykonywania tej procedury, można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia, western blot oraz ilościowe PCR. Należy pamiętać o przygotowaniu całego sprzętu, aby zminimalizować czas pomiędzy pobraniem mięśnia a analizą. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić sekcję tylnej kończyny, zamocować mięsień w myometrze do pasków mięśniowych, takim jak ten zaprezentowany z firmy Danish Myo Technology, oraz mierzyć zmiany w jego właściwościach mechanicznych.

myo-mechanical-analysis-of-isolated-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza miomechaniczna odizolowanego mięśnia szkieletowego

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki.   Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.  Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego.  Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Ten raport techniczny opisuje odmianę zmodyfikowanej techniki Bergströma do biopsji mięśnia piszczelowego przedniego, która ogranicza uszkodzenia włókien.

Pobieranie biopsji mięśni szkieletowych z górnego przedziału mięśnia piszczelowego ludzkiego mięśnia piszczelowego przedniego w celu oceny mechanicznej

Funkcja mięśni szkieletowych może być oceniana poprzez ilościowe określenie kurczliwości izolowanych włókien mięśniowych, tradycyjnie przy użyciu pracochłonnych, niskoprzepustowych metod. W tym miejscu opisujemy opartą na optyce, wysokoprzepustową metodę ilościowego określania kurczliwości włókien mięśniowych osadzonych w hydrożelu. Podejście to ma zastosowanie w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu terapii.

Wysokoprzepustowe pomiary kurczliwości nienaruszonych włókien mięśniowych myszy zanurzonych w hydrożelu przy użyciu systemu opartego na optyce

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Poznaj technikę miomechaniczną do oceny siły i zmęczenia izolowanych mięśni szkieletowych u myszy. Ta metoda umożliwia ilościową analizę funkcji mięśniowej w badaniach przedklinicznych.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Przeglądaj więcej filmów