Analiza miomechaniczna izolowanych mięśni szkieletowych

Celem tej procedury jest określenie siły generowanej i zmęczenia izolowanych mięśni szkieletowych jako sposób ilościowego określenia efektów modyfikacji genetycznej lub terapii. Najpierw najdłuższy mięsień prostownika palca jest wycinany z tylnej kończyny myszy. Następnie mięsień jest montowany w mięśniu paskowym

Następnym krokiem jest ustalenie napięcia potrzebnego do stymulacji i napięcia wstępnego mięśnia, przy którym osiągane jest maksymalne napięcie skurczowe. Ostatnim krokiem jest określenie zależności częstotliwości siły dla mięśnia, a także początku i stopnia zmęczenia przy niskiej częstotliwości do stymulacji tanicznej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują mierzalne zmiany we właściwościach mechanicznych mięśnia poprzez miografię.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak testy wysiłkowe, jest to, że miografia pozwala na ilościową ocenę siły i funkcji mięśni. Po raz pierwszy przyjęliśmy tę metodę, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że potrzebne są ilościowe środki do oceny funkcji mięśni, ponieważ nowe terapie komórkowe i bioinżynieryjne dotyczące chorób mięśni są testowane na przedklinicznych modelach zwierzęcych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mięśni i dystrofii mięśniowej, takie jak to, czy specyficzne terapie lub modyfikacje genetyczne zmieniają funkcję mięśni.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki potrzebne do prawidłowego radzenia sobie z mięśniem są trudne do opanowania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ szybkie, traumatyczne rozwarstwienie mięśni tylnych wymaga praktyki i nabytych umiejętności. Demonstracją procedury będzie sytuacja, w której w naszych laboratoriach zaprosimy naukowca i doktoranta SAB ler.

Po eutanazji myszy ułóż tuszę brzuszną stroną do góry na tacy sekcyjnej i przypnij nogę do tacy pod mikroskopem sekcyjnym. Rozetnij skórę i ostrożnie otwórz powięź. Następnie oderwij mięsień piszczelowy przedni od kostki w górę, aby odsłonić mięsień prostownik długi palca lub mięsień EDL.

Używaj kropli roztworu dzwonka z mleczanami, aby utrzymać wilgotność mięśni podczas zbiorów. Następnie wypreparuj EDL, zachowując jak najwięcej ścięgna na każdym końcu i uważając, aby nie dotknąć samych włókien mięśniowych EDL. Umieścić mięsień EDL na szalce Petriego zawierającej mleczanowy roztwór pierścienia.

Teraz przywiąż szwy do każdego ze ścięgien mięśniowych. W badaniach tych wykorzystuje się kąpiel tkankową do utrzymywania mięśnia i przetwornik siły do pomiaru napięcia mięśniowego. Ponadto stymulator elektryczny z impulsem kwadratowym i platforma do gromadzenia danych są używane do wywoływania, rejestrowania i analizowania moich reakcji mechanicznych.

Następnym krokiem jest napełnienie kąpieli myo graft 6,5 mililitra Krebsa, stąd roztwór satelitarny. Podgrzej kąpiel do 25 stopni Celsjusza, bąbelkuj roztwór Krebsa 95% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla po bulgotaniu przez 15 minut. Użyj szwów na ścięgnach, aby przenieść mięsień EDL do kąpieli.

Zabezpiecz ścięgna między zaciskami przeszczepu mięśniowego. Uważaj, aby nie zacisnąć samego mięśnia. Utrzymuj kąpiel myo graft w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Aby rozpocząć analizę napięcia, dostosuj początkową długość mięśnia tak, aby była równa długości mięśnia inci. Używając czasu trwania bodźca wynoszącego 0,5 milisekundy. Stopniowo zwiększaj napięcie, aby określić bodziec wymagany do uzyskania maksymalnego napięcia drgań.

Następnie ustaw bodziec o 20% wyższy, aby uzyskać bodziec ponadmaksymalny, który zwykle wynosi około 40 woltów. Następnym krokiem jest stopniowe rozciąganie mięśnia, aż do momentu, gdy nie będzie dalszego wzrostu napięcia skurczowego. Ta długość jest uważana za optymalną długość mięśni.

Pozwól mięśniowi zrównoważyć się przez trzy minuty, a następnie utrzymuj mięsień na optymalnej długości. Dostarcz ponadmaksymalny bodziec kwadratowy i zapisz wyjście, zapisz krzywą napięcia drgającego. Na tym rysunku.

Maksymalne napięcie drgań jest oznaczone jako pt. Czas skurczu jest oznaczony jako ct. Czas połowicznego relaksu jest oznaczony jako HTZ.

Słupek reprezentuje jedną sekundę po trzyminutowym okresie odpoczynku. Zmierz napięcie Titanica, stosując napięcie super maksymalnych bodźców przez 300 milisekund przy 150 Hz przy optymalnej długości. Ta procedura generuje krzywą napięcia tężca.

Maksymalne napięcie Titanica jest oznaczone jako po. Napięcie Titanica o połowie relaksacji jest oznaczone jako HRTT. Pasek reprezentuje jedną sekundę po trzyminutowym okresie odpoczynku.

Rozpocznij analizę częstotliwości siły od zastosowania 300-milisekundowych ciągów super maksymalnych bodźców o częstotliwości trzydziestu sześćdziesięciu stu, stu czterdziestu i sześćdziesięciu lat. Pozwól na trzy minuty odpoczynku między każdym ciągiem bodźców po trzyminutowym okresie odpoczynku. Rozpocznij analizę zmęczenia od zastosowania krótkich ciągów taai 60 Hz przez 300 milisekund co trzy sekundy przez 10 minut na 10 minut.

Siła Titanica powinna spaść do poziomu plateau wynoszącego około 15% wartości początkowej. Po zakończeniu zapisów siły z mięśniem na optymalnej długości, zmierz średnicę mięśnia za pomocą oka na mikroskopie. Następnie usuń szwy i zważ mięsień, aby określić masę mięśniową.

Ostatnim krokiem jest zważenie myszy w celu oceny masy ciała. Pomiary te są wykorzystywane do obliczeń wymienionych w załączonym artykule. Rysunek ten pokazuje wzrost napięcia generowanego wraz ze wzrostem częstotliwości bodźców.

Oto reakcja mięśnia na ciąg impulsów o częstotliwości 30 Hz. Rysunek ten pokazuje większą siłę żądaną w ciągu impulsów o częstotliwości 140 Hz. Ten wykres przedstawia zależność częstotliwości siły wykreśloną jako procentowa siła maksymalna w stosunku do częstotliwości stymulacji.

Kształt krzywej częstotliwości siły jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być wykorzystany do porównań między mięśniami różnych zwierząt. Liczba ta pokazuje zmęczenie mięśni w trakcie 10 minut stymulacji o niskiej częstotliwości. Liczby te pokazują reakcję mięśnia na pociąg bodźców we wskazanych punktach czasowych.

Ten wykres pokazuje zmęczenie mięśni o niskiej częstotliwości jako plus procentowej siły maksymalnej w funkcji czasu. Kształt krzywej zmęczenia o niskiej częstotliwości jest charakterystyczny dla siły mięśni i może być wykorzystany do porównań między mięśniami różnych zwierząt. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w 30 minut Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak immunohistochemia, western blot i ilościowy PCR, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy podczas próby tej procedury w leczonym mięśniu dochodzi do ekspresji określonych białek miogennych i markerów komórek macierzystych. Ważne jest, aby pamiętać, aby mieć cały sprzęt w gotowości, aby zminimalizować czas między pobraniem masy mięśniowej a analizą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozciąć mięsień kończyny tylnej, zamontować mięsień w mięśniu paskowym, takim jak ten, który pokazaliśmy Ci z duńskiej technologii myo i zmierzyć zmiany w moich właściwościach mechanicznych.