Name: Metodologia pobierania krwi z opuszki palca w celu określenia apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Poznaj metodę pobierania krwi z opuszki palca do analizy apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym. Technika ta umożliwia szybkie i precyzyjne badanie wpływu ćwiczeń na komórki układu odpornościowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane z grantu dla nowej kadry naukowej (New Faculty Grant) przyznanego przez Radę Stypendialną Wydziału (Faculty Scholarship Council) na Western Kentucky University.

1. Pobieranie krwi z palca
<ol>
<li>Pobieranie krwi pełnej zazwyczaj przeprowadza się w spoczynku w celu uzyskania pomiaru bazowego (zazwyczaj po 10–15 min odpoczynku w pozycji siedzącej), w trakcie lub bezpośrednio po wysiłku fizycznym oraz w okresie po wysiłku (zazwyczaj od 1 do 3 godzin po zakończeniu ćwiczeń).</li>
<li>Stosując uniwersalne środki ostrożności, należy najpierw zdezynfekować opuszkę palca 70% alkoholem izopropylowym.</li>
<li>Następnie nakłuć miejsce pobrania za pomocą automatycznego lancetu lub urządzenia o podobnym działaniu. W celu zapewnienia komfortu badanemu stosujemy lancet o rozmiarze 30G, jednak można użyć igły o większym rozmiarze.</li>
<li>Przetrzeć pierwszą kroplę krwi, a następnie pobrać krew do kapilar lub mikrowet kuchennych z dodatkiem heparyny litowej w celu zapobiegania krzepnięciu.</li>
</ol>
2. Fenotypowanie komórek i barwienie na apoptozę
<ol>
<li>Do miareczkowanego panelu przeciwciał w 250 μL buforu wiążącego dodać 10 μL heparynowanej krwi pełnej (patrz schemat w tabeli 1). Z powodzeniem zastosowano czynnik rozcieńczenia 1:20, jednak każde laboratorium powinno zmiareczkować odczynniki, aby ustalić optymalny roztwór roboczy. 
Tabela 1. Panel przeciwciał do oznaczania apoptozy indukowanej wysiłkiem w subpopulacjach leukocytów. Wczesną apoptozę definiowano poprzez ekspresję Annexin V, natomiast późną apoptozę poprzez podwójne znakowanie Annexin V i 7-AAD. Komórki nekrotyczne to wyłącznie komórki Annexin V- i 7-AAD+. 
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Probówka 1</td >
 <td >Probówka 2</td >
 <td >Probówka 3</td >
 <td >Probówka 4</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >Probówka z samymi komórkami</td >
 <td >Annexin V - FITC</td >
 <td >Annexin V - FITC</td >
 <td >Annexin V - FITC</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >&nbsp;</td >
 <td >Anti Human CD4 - PE</td >
 <td >Anti Human CD8 - PE</td >
 <td >Anti Human CD19 - PE</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >&nbsp;</td >
 <td >7-AAD</td >
 <td >7-AAD</td >
 <td >7-AAD</td >
 </tr >
 <tr >
 <td >&nbsp;</td >
 <td >Anti Human CD45RA - APC</td >
 <td >Anti Human CD45RA - APC</td >
 <td >&nbsp;</td >
 </tr >
 </tbody >
 </table >
 
7-AAD = 7-aminoaktynominyna D, APC = allofikocyjanina, CD4 = limfocyty T pomocnicze, CD8 = limfocyty T supresoryjne/cytotoksyczne, CD19 = limfocyty B, CD45RA = naiwne subpopulacje komórek, FITC = izotiocyjanian fluoresceiny, PE = fikoerytryna.</li >
<li >Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.</li >
<li >Wirować przy 1075 x g przez 5-10 minut.</li >
<li >Zlać nadsącz, dodać 300 μL buforu do lizy erytrocytów i dokładnie wymieszać na wortexie.</li >
<li >Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li >
<li >Dodać 300 μL PBS, aby zatrzymać reakcję lizy erytrocytów.</li >
<li >Wirować przy 1075 x g przez 5-10 minut.</li >
<li >Zlać nadsącz, ustawić w statywie i dodać 50 μL buforu wiążącego.</li >
<li >Analizować za pomocą cytometrii przepływowej.</li >
</ol>
Zaleca się zastosowanie co najmniej następujących kontroli: probówki zawierającej wyłącznie komórki jako kontroli negatywnej w celu wykrycia tła autofluorescencji oraz probówek zawierających każdy z fluorochromów osobno w celu ustawienia kompensacji podczas wstępnej konfiguracji cytometru przepływowego. Dodatkowo, do przygotowania naszych eksperymentów z sukcesem wykorzystaliśmy standardowe kulek kompensacyjne.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiono małoinwazyjną procedurę pobierania próbek i późniejszej analizy w celu badania zarówno wczesnej, jak i późnej fazy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym. Możliwe jest również wyraźne wykluczenie komórek nekrotycznych, które nie wykazują cech apoptozy. Procedura ta eliminuje wady i dyskomfort związane z inwazyjnym nakłuciem żył w regionie łokciowym w wielu punktach czasowych przed, w trakcie i bezpośrednio po wysiłku, a także konieczność zakładania cewnika na cały czas trwania sesji ćwiczeń. Z ...

<table><tbody><tr><td>Bufor wiążący do cytometrii przepływowej</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów (RBC)</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Nakłuwacz</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>Kapilary heparynowane</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Aneksyna V sprzężona z FITC</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4 sprzężone z PE</td><td>Przeciwciało antyludzkie, klon RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8 sprzężone z PE</td><td>Przeciwciało antyludzkie, klon OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19 sprzężone z PE</td><td>Przeciwciało antyludzkie, klon HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia żywotności 7-AAD</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA sprzężone z APC</td><td>Przeciwciało antyludzkie, klon HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodyka pobierania krwi z palca w celu oznaczenia apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Ćwiczenia fizyczne są bodźcem fizjologicznym zdolnym do indukowania apoptozy w komórkach odpornościowych. Do tej pory zidentyfikowano szereg ograniczeń w pomiarze tego zjawiska, szczególnie w odniesieniu do czasu wymaganego do izolacji i przygotowania próbki krwi przed oceną śmierci komórkowej. Z tego powodu trudno jest ustalić, czy zgłaszane zwiększenie apoptozy komórek odpornościowych wynika z rzeczywistego wpływu wysiłku fizycznego na organizm, czy jest odzwierciedleniem czasu i procesów niezbędnych do przeprowadzenia tego pomiaru. W niniejszym artykule prezentujemy szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym. W przeciwieństwie do innych technik, krew pełną dodaje się do panelu przeciwciał natychmiast po pobraniu próbki. Po okresie inkubacji erytrocyty ulegają lizie, a próbki są gotowe do analizy. Zastosowanie procedury pobierania krwi z palca zmniejsza objętość wymaganej krwi i minimalizuje dyskomfort badanego.

Wysiłek fizyczny może indukować apoptozę w komórkach odpornościowych. Istnieją różne ograniczenia pomiarowe, szczególnie w odniesieniu do czasu wymaganego na izolację i przygotowanie próbki krwi przed przeprowadzeniem oceny. Przedstawiono szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym.

Metodyka pobierania krwi z palca w celu oznaczenia apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym

Ćwiczenia fizyczne stanowią bodziec fizjologiczny zdolny do indukowania apoptozy w komórkach odpornościowych. Do tej pory zidentyfikowano liczne ograniczenia w pomiarach...

Witajcie, nazywam się James Volta i reprezentuję Program Nauk o Wysiłku Fizycznym w Katedrze Kinezjologii, Rekreacji i Sportu na Western Kentucky University. W tym materiale zaprezentujemy procedurę, którą opracowaliśmy i której używamy do pomiaru apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym. Zapraszam do oglądania.Próbkę krwi z palca pobiera się zgodnie z zasadami powszechnych środków ostrożności metodą kropli z palca. Opuszek palca zostaje wysterylizowany, a następnie nakłuty. Pierwszą kroplę krwi usuwa się, a następnie krew pobiera do kapilar lub mikrokrawędzi.10 µL krwi pełnej pipetowano do panelu przeciwciał zawierającego odpowiednie fluorochromy do cytometrii przepływowej w buforze stojącym, w tym Annexin V, 7-AAD, CD4, CD8 lub CD19 oraz CD45RA; dodatkowo przygotowano probówkę zawierającą wyłącznie komórki. W celu pomocy w konfiguracji eksperymentów jako kontrolę wykorzystano kulek kompensacyjnych. Próbkę dokładnie zmieszano w wirówce typu vortex, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Po inkubacji próbki wirowano przez 10 minut, a następnie nadsączono je jednym płynnym ruchem.Dodaje się 300 µL buforu do lizy erytrocytów, a następnie próbki są dokładnie mieszane w wirówce vortex. Bardzo ważne jest, aby próbka i bufor do lizy zostały dokładnie wymieszane. W celu ułatwienia maksymalnego usunięcia erytrocytów można zauważyć, że próbka staje się mętna.Po co najmniej 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, gdy roztwór stanie się klarowny w wyniku lizy erytrocytów, dodaje się 300 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym, która pełni rolę roztworu zatrzymującego reakcję lizy. Następnie próbki ponownie wiruje się przez 10 minut. Należy pamiętać, że po procedurze wirowania na dnie probówki powstanie osad komórkowy; należy go odlać jednym płynnym ruchem, a następnie dokładnie wymieszać w wirówce (vortex), aby resuspendować komórki w roztworze.Próbka jest już gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wykresy rozproszenia światła przedniego i bocznego z bramkowaniem na podfrakcje limfocytów oraz identyfikację komórek dodatnich pod kątem Annexin V w obrębie tej populacji. Opisaliśmy właśnie metodologię stosowaną do określania indukowanej wysiłkiem fizycznym apoptozy limfocytów i uważamy, że metoda ta może znaleźć wiele dalszych zastosowań.Metoda ta może być wykorzystana do analizy każdego rodzaju białych krwinek poza limfocytami oraz subfrakcjami limfocytów. Może być również stosowana do pomiaru każdego markera znajdującego się na powierzchni komórki. Uważamy zatem, że rozwiązanie to ma szersze zastosowanie.

finger-stick-blood-sampling-methodology-for-determination-exercise

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metodologia pobierania próbek krwi z klina palca do określenia apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Ten film demonstruje technikę in vitro do stymulacji limfocytów za pomocą nietypizowanego Haemophilus influenzae (NTHi) i oceny odpowiedzi immunologicznej. Inkubacja izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z NTHi powoduje, że komórki bakteryjne stymulują limfocyty T, co prowadzi do produkcji cytokin. Po zahamowaniu wydzielania cytokin przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia nagromadzonych cytokin wewnątrzkomórkowych w stymulowanych limfocytach T.

Technika in vitro do stymulacji limfocytów przez bakterie chorobotwórcze

Celem tego filmu jest przedstawienie zmodyfikowanej techniki biopsji mięśni szkieletowych Bergströma na ludziach.

Procedury biopsji mięśni szkieletowych człowieka z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Bergströma

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie metody pomiaru fagocytozy monocytów i granulocytów oraz aktywności wybuchu oksydacyjnego w próbkach ludzkiej krwi.

Pomiar fagocytozy granulocytów i monocytów oraz aktywności oksydacyjnej we krwi ludzkiej

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

Badanie metabolizmu staje się coraz bardziej istotne dla badań immunologicznych. W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w mysich splenocytach oraz limfocytach T i B.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Tutaj prezentujemy protokół pobierania kilku próbek krwi z żyły łokciowej podczas treningu interwałowego o wysokiej intensywności. Protokół ten może być przydatny do pomiaru metabolitów we krwi i markerów endokrynnych podczas wysiłku fizycznego.

Ocena stężenia mleczanu we krwi i insuliny w osoczu podczas wysiłku o wysokiej intensywności poprzez cewnikowanie żyły łokciowej

Aby ocenić wpływ intensywności ćwiczeń na reakcje fizjologiczne i biologiczne, wykorzystano dwa różne protokoły testowania ćwiczeń. Opisano metody przedstawiające testy wysiłkowe na ergometrze rowerowym jako przyrostowy test maksymalnego zużycia tlenu i wytrzymałość, test wytrzymałości submaksymalnej w stanie ustalonym.

Przeprowadzanie testów wytrzymałości maksymalnej i submaksymalnej w celu zmierzenia fizjologicznych i biologicznych reakcji na ostry wysiłek fizyczny u ludzi

Poznaj metodę pobierania krwi z opuszki palca do analizy apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym. Technika ta umożliwia szybkie i precyzyjne badanie wpływu ćwiczeń na komórki układu odpornościowego.

Metodyka pobierania krwi z palca w celu oznaczenia apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym

Przeglądaj więcej filmów