Metodologia pobierania krwi z opuszki palca w celu określenia apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym
24 lutego 2011
Ćwiczenia są w stanie wywołać apoptozę w komórkach odpornościowych. Istnieją różne ograniczenia pomiarowe, w szczególności dotyczące czasu wymaganego do wyizolowania i leczenia próbki krwi przed oceną. Zademonstrowano szybką i minimalnie inwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym.
Cześć, nazywam się James Volta i uczę się w Programie Nauk o Ćwiczeniach na Wydziale Kinezjologii, Rekreacji i Sportu na Uniwersytecie Western Kentucky. Pokażemy wam procedurę, którą opracowaliśmy i procedurę, której używamy do pomiaru wysiłku fizycznego, limfocytów, apoptozy. Spójrzmy więc.
Próbkę krwi z opuszki palca uzyskuje się przy użyciu uniwersalnych środków ostrożności kropli z palca. Opuszek palca jest sterylizowany, a następnie nakłuwany. Pierwsza kropla krwi jest wycierana, a następnie krew jest wciągana do rurek kapilarnych lub mikrołóżek
.10 mikrolitrów krwi pełnej zostało odpipetowane do panelu przeciwciał zawierającego cytometrię przepływową, odpowiednie fluorochromy w buforze stałym, w tym załącznik i V siedmioaminoaktynę D, albo CD cztery, CD ósemkę, albo CD 19 i CD 45 ra, oprócz probówki tylko komórek, użyliśmy kulek kompensacyjnych jako kontroli, aby pomóc w przygotowaniu naszych eksperymentów. Próbkę dokładnie miesza się w wirze, a następnie pozostawia do inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Po inkubacji próbki odwirowuje się przez 10 minut, a następnie próbki dekantuje się jednym płynnym ruchem.
Dodaje się 300 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek, a próbki są dokładnie wirowane. Bardzo ważne jest, aby próbka i bufor do lizy były dokładnie wymieszane. Aby ułatwić maksymalne usunięcie czerwonych krwinek, zauważysz, że próbka zaczyna być mętna.
Ale po co najmniej 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej wyjaśni się, ponieważ czerwone krwinki to Ls, dodaje się 300 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, działając jako roztwór zatrzymujący, aby zakończyć reakcję lizy. Próbki są ponownie wirowane przez 10 minut. Zwróć uwagę, że po procedurze centrfuzji będziesz mieć pele komórek na dnie dekantacji probówki jednym płynnym ruchem, dokładnie wirując, aby ponownie zawiesić komórki i roztwór.
Twoja próbka jest gotowa do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj pokazujemy reprezentatywne wykresy rozproszenia do przodu wewnątrz bramkowania do podfrakcji limfocytów oraz identyfikację komórek aneksowych i V dodatnich w podzbiorze. Właśnie opisaliśmy metodologię, której używamy do określania opadania limfocytów wywołanego wysiłkiem fizycznym i uważamy, że istnieje wiele dalszych zastosowań, które można wykorzystać za pomocą tej metodologii.
To naprawdę może być używane do patrzenia na każdy rodzaj białych krwinek oprócz limfocytów i limfocytów, podfrakcji. Może być również używany do pomiaru dowolnego markera, który znajduje się na zewnątrz komórki. Więc naprawdę uważamy, że ma to jakieś większe zastosowanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów wywołanej wysiłkiem fizycznym. Badania podkreślają wpływ wysiłku na apoptozę komórek odpornościowych i odnoszą się do ograniczeń pomiarowych związanych z przetwarzaniem próbek krwi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauka o sporcie
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Aktywność fizyczna może indukować apoptozę w komórkach odpornościowych.
- Tradycyjne przetwarzanie próbek krwi wiąże się z ograniczeniami pomiarowymi.
- Do skutecznej analizy niezbędne są techniki szybkiej oceny.
- Zrozumienie apoptozy limfocytów jest kluczowe dla badań nad odpowiedzią immunologiczną.
Cel badania
- Opracowanie procedury pomiaru apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym.
- Zminimalizowanie czasu wymaganego do izolacji i obróbki próbek krwi.
- Zwiększenie dokładności pomiaru apoptozy w komórkach odpornościowych.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek krwi z palca z zachowaniem środków ostrożności uniwersalnych.
- Pobieranie krwi do kapilar lub mikro-podłoży.
- Usunięcie pierwszej kropli krwi w celu zapewnienia czystości próbki.
- Szybkie przetwarzanie próbek w celu oceny apoptozy limfocytów po wysiłku fizycznym.
Główne wyniki
- Przedstawiono skuteczną metodę analizy apoptozy limfocytów.
- Wykazano, że ćwiczenia fizyczne mają istotny wpływ na apoptozę komórek odpornościowych.
- Odniesiono się do wcześniejszych ograniczeń w technikach pomiarowych.
- Stworzono ramy dla przyszłych badań w dziedzinie immunologii wysiłku fizycznego.
Wnioski
- Opracowana procedura jest skuteczna w szybkim badaniu apoptozy limfocytów.
- Ćwiczenia fizyczne mają mierzalny wpływ na dynamikę komórek odpornościowych.
- Metoda ta może ułatwić dalsze badania nad ćwiczeniami fizycznymi i odpowiedzią immunologiczną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka ocena apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym rozwiązuje kluczowy problem w badaniach immunologicznych: odróżnienie rzeczywistych efektów biologicznych od artefaktów wynikających z opóźnionego przetwarzania próbek. Metodyka ta umożliwia dokładniejszy pomiar dynamiki komórek odpornościowych, wspierając walidację celów w fizjologii wysiłku oraz immunofarmakologii. Dzięki minimalizacji czasu przetwarzania i objętości próbek, zwiększa ona wiarygodność danych w badaniach mechanistycznych nad modulacją układu odpornościowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wysiłku fizycznego jako bodźca fizjologicznego dla apoptozy komórek odpornościowych, co wspiera testowanie hipotez celowych w immunologii.
- Wartość operacyjna: Skraca czas przetwarzania próbek z godzin do minut, umożliwiając ocenę szlaków śmierci limfocytów w czasie rzeczywistym.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia ilościowe odczyty dla anneksyny V i 7-AAD w celu oceny apoptozy w subpopulacjach limfocytów (CD4+, CD8+, CD19+).
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Krew pełna jest dodawana bezpośrednio do paneli przeciwciał niezwłocznie po pobraniu, co pozwala zachować natywny stan komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej.
- Powtarzalność: Standaryzowane etapy inkubacji (30 min, RT, w ciemności) i lizy zapewniają spójną izolację limfocytów i detekcję apoptozy.
- Skalowalność: Pobieranie krwi z palca redukuje objętość próbki do 10 µL, umożliwiając częste monitorowanie podłużne w badaniach przedklinicznych lub klinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera badania nad immunologią wysiłku poprzez powiązanie stresu fizycznego z apoptozą limfocytów za pomocą mierzalnych biomarkerów.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Izoluje apoptozę indukowaną wysiłkiem od artefaktów ex vivo, zwiększając pewność w badaniach nad angażowaniem celu.
- System istotny w kontekście chorób: Stosowalny w modelach modulacji odpornościowej, w których interwencje stanowią wysiłek fizyczny lub mimetyki wysiłku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od weryfikacji hipotez po walidację celów, szczególnie w programach z zakresu immunologii i fizjologii wysiłku, w których śmierć komórek odpornościowych służy jako odczyt mechanistyczny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację funkcjonalną apoptozy limfocytów jako biomarkera odpowiedzi immunologicznej na stresory fizjologiczne.
- Screening: Pozwala na generowanie ustandaryzowanych, ilościowych wyników cytometrii przepływowej w celu porównania apoptozy w różnych warunkach lub genotypach.
- Analityka: Umożliwia zastosowanie strategii bramkowania w celu ilościowego oznaczenia limfocytów annexin V+ w subfrakcjach CD4+, CD8+ oraz CD19+.
- Badania translacyjne: Łączy efekty wysiłku fizycznego o charakterze ostrym z dynamiką komórek odpornościowych, co pozwala na dobór biomarkerów dla modeli przedklinicznych.
- Zastosowania komercyjne: Panel przeciwciał i protokół lizy mogą zostać zaadaptowane do innych markerów odpornościowych lub typów komórek poza limfocytami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w testach apoptozy poprzez minimalizację zmiennych przedanalitycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek przy minimalnych wymaganiach szkoleniowych i kompatybilności z diagnostyką w punkcie opieki (point-of-care).
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go w programach immunologicznych poprzez dostarczanie wiarygodnych danych specyficznych dla apoptozy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków immunomodulujących lub mimetyków wysiłku fizycznego z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość w zakresie cytometrii przepływowej oraz projektowania paneli przeciwciał do immunofenotypowania limfocytów.
- Wymagany jest dostęp do wirówki, vortexa oraz odczynników do lizy erytrocytów.
- Niezbędna jest standaryzacja czasu inkubacji i ochrony przed światłem dla wszystkich użytkowników i ośrodków.
- Należy uwzględnić zmienność jakości próbek pobranych z palca oraz uzyskanej ilości leukocytów.
- Metoda ograniczona do markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych kompatybilnych z etapami fiksacji/lizy; nie nadaje się do badania niestabilnych białek sygnałowych.
