Name: Neuromodulacja i transport mitochondrialny: obrazowanie na żywo w neuronach hipokampa przez długi czas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Poznaj metodę obrazowania transportu mitochondrialnego w neuronach hipokampa przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Technika ta wykorzystuje ekspresję białka fluorescencyjnego i inkubator do długotrwałych obserwacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Donaldowi Hutsonowi za wkład w postaci wiedzy technicznej i ogromnych umiejętności podczas projektowania i budowy inkubatora nakładanego na stół mikroskopu. Jesteśmy również wdzięczni Aydzie Dashtaei za doskonałą pomoc techniczną. Wszystkie prace były wspierane przez Neurosciences Research Foundation.

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystując ekspresję białka fluorescencyjnego ukierunkowanego na mitochondria za pośrednictwem lentiwirusów w zakażonych hodowlach neuronów oraz tani, zbudowany laboratoryjnie inkubator nakładkowy na stolik mikroskopu, który umożliwia obrazowanie żywych komórek przez dłuższy czas, byliśmy w stanie zbadać związek między ruchem mitochondriów a sygnałami neuromodulacyjnymi, takimi jak serotonina (5-HT), dopamina (DA) i acetylocholina (ACh). Nasze badania pomogły wyjaśnić szlak sygnalizacyjny, który po raz pierwszy łączy transport mitochondriów ze zmianami w aktywności neuronów – modulowanymi przez neuroprzekaźniki takie jak 5-HT i DA – które stanowią podstawę funkcji neuronalnych. Stwierdziliśmy, że zastosowanie ukierunkowanych białek fluorescencyjnych pozwala na obserwację znakowanych mitochondriów w żywych hodowlach neuronów przez dłuższe okresy, które mogą być bardziej istotne fizjologicznie niż znacznie krótsze czasy możliwe do osiągnięcia przy użyciu barwników witalnych. Ponadto intensywność sygnału białka fluorescencyjnego pozwala na zachowanie krótkich czasów ekspozycji podczas akwizycji obrazów, co minimalizuje ryzyko fotoblaknięcia lub fototoksyczności. Wreszcie, prosty i tani inkubator nakładkowy, który utrzymuje temperaturę otoczenia, wilgotność i poziom CO2, minimalizując jednocześnie odparowywanie pożywki, pozwala nam śledzić ruch mitochondriów w żywych neuronach przez wiele godzin, a nawet dni. Badacze chcący zbudować inkubator nakładkowy do długoterminowych obserwacji mitochondriów w żywych neuronach nie muszą ściśle trzymać się szczegółów naszej konstrukcji, pod warunkiem że właściwości użytych materiałów (np. membrana przepuszczalna dla gazów w celu uniknięcia odparowania pożywki) oraz zastosowane zasady (np. kontrola temperatury i wilgotności, buforowanie pH, utrzymanie osmolarności) będą ogólnie zgodne z opisem zawartym w niniejszym protokole.

<table><tbody><tr><td>(1) Inkubator do hodowli tkankowej (H)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) Żaroodporna obudowa plastikowa (A)</td><td></td><td></td><td>(delrin lub materiał porównywalny)</td></tr><tr><td>(1) Plastikowa ramka do pokrywek GBM 35 mm (M)</td><td></td><td></td><td>(do mocowania membrany do szalki Petriego)</td></tr><tr><td>(1-2) stóp przezroczystego PFTE (Teflonu)</td><td></td><td></td><td>materiał membranowy</td></tr><tr><td>(4) Mosiężne śruby motylkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(2) Małe rezystory radiatorowe 10 kOhm</td><td></td><td></td><td>używane jako elementy grzejne wewnątrz obudowy inkubatora nadstolikowego</td></tr><tr><td>(1) Transformator</td><td></td><td></td><td>zasilanie rezystorów prądem 9 V</td></tr><tr><td>(1) Kontroler temperatury do terrariów z sondą</td><td></td><td></td><td>termostatyczna regulacja mocy rezystorów radiatorowych poprzez transformator</td></tr><tr><td>(1) Kolba Erlenmeyera 2000 ml (K)</td><td></td><td></td><td>tłumik do redukcji wibracji w wężu przed inkubatorem nadstolikowym</td></tr><tr><td>(1) Arkusz sorbotanu 1/8&quot;</td><td></td><td></td><td>materiał uszczelki do podstawy inkubatora nadstolikowego</td></tr><tr><td>(1) Szczelne plastikowe pudełko ABS (lub porównywalne) (J)</td><td></td><td></td><td>obudowa pompy akwariowej</td></tr><tr><td>(1) Pompa akwariowa (I)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) Mały komputerowy wentylator chłodzący</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) Plastikowa obudowa wentylatora chłodzącego (L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1) Transformator 9 V do komputerowego wentylatora chłodzącego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20-30 stóp) Wąż Nalgene lub silikonowy (F, G, N)</td><td></td><td></td><td>połączenia między inkubatorem do hodowli tkankowej a inkubatorem nadstolikowym; pułapki wilgoci</td></tr><tr><td>(2) Plastikowe kurki (O)</td><td></td><td></td><td>do otwierania i zamykania przepływu powietrza przed i za inkubatorem nadstolikowym</td></tr><tr><td>(4) Mosiężne złączki węża z karbem</td><td></td><td></td><td>do połączeń węży z/do inkubatora nadstolikowego i obudowy pompy akwariowej</td></tr><tr><td>(2) Mosiężne szybkozłączki</td><td></td><td></td><td>do połączeń węży z/do inkubatora nadstolikowego</td></tr><tr><td>(2) Mosiężne szybkozłączki</td><td></td><td></td><td>do połączeń węży z/do inkubatora nadstolikowego</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;strong&gt;Tabela 1. Części inkubatora nadstolikowego:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Poly-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Roche Group</td><td>11243217001</td><td></td></tr><tr><td>szalki z dnem szklanym 35 mm</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10567</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>BSA bogate w lipidy</td><td>Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381-100G</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>5-HT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9523-25MG</td><td></td></tr><tr><td>8-OH-DPAT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8520-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dopamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502-5G</td><td></td></tr><tr><td>Bromokryptyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2134-25MG</td><td></td></tr><tr><td>SKF38393</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D047-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Aby zrozumieć związek między transportem mitochondrialnym a funkcją neuronalną, kluczowe jest obserwowanie zachowania mitochondriów w żywych hodowlach neuronów przez dłuższy czas1-3. Jest to obecnie możliwe dzięki zastosowaniu barwników witalnych i białek fluorescencyjnych, za pomocą których można znakować komponenty cytoszkieletu, organelle oraz inne struktury w żywych komórkach, a następnie wizualizować je przy użyciu dynamicznej mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład w embrionalnych neuronach współczulnych kurczaka ruch mitochondriów opisano z wykorzystaniem barwnika witalnego rhodamine 1234. W innym badaniu mitochondria w neuronach przedniego mózgu szczura wizualizowano poprzez transfekcję eYFP ukierunkowanego na mitochondria5. Jednak obrazowanie pierwotnych neuronów przez minuty, godziny, a nawet dni wiąże się z szeregiem problemów. Do najważniejszych z nich należą: 1) utrzymanie warunków hodowli, takich jak temperatura, wilgotność i pH podczas długich sesji obrazowania; 2) silny, stabilny sygnał fluorescencyjny, aby zapewnić zarówno jakość pozyskanych obrazów, jak i dokładny pomiar intensywności sygnału podczas analizy obrazu; oraz 3) ograniczenie czasu ekspozycji podczas akwizycji obrazu w celu zminimalizowania fotobleachingu i uniknięcia fototoksyczności.
W niniejszej pracy opisujemy protokół umożliwiający obserwację, wizualizację i analizę ruchu mitochondriów w hodowanych neuronach hipokampa z wysoką rozdzielczością czasową i w optymalnych warunkach podtrzymywania życia. Skonstruowaliśmy przystępny cenowo inkubator nakładkowy na stolik mikroskopu, który zapewnia dobrą regulację temperatury i przepływ gazów atmosferycznych, a także ogranicza stopień odparowywania medium, zapewniając stabilne pH i osmolarność. Inkubator ten jest połączony, za pomocą węży wlotowych i wylotowych, ze standardowym inkubatorem do hodowli tkanek, który zapewnia stały poziom wilgotności oraz atmosferę zawierającą 5-10% CO2/powietrza. Taka konstrukcja stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla znacznie droższych inkubatorów mikroskopowych, które niekoniecznie gwarantują żywotność komórek przez wiele godzin, a nawet dni. Aby zwizualizować mitochondria, infekujemy komórki lentiwirusem kodującym czerwone białko fluorescencyjne ukierunkowane na mitochondrium. Zapewnia to silny i trwały sygnał, który w połączeniu z zastosowaniem stabilnego źródła światła ksenonowego pozwala nam ograniczyć czasy ekspozycji podczas akwizycji obrazu i niemal całkowicie eliminuje fotoblaknięcie oraz fototoksyczność. Dwa porty wtryskowe na górze inkubatora nakładkowego umożliwiają ostre podawanie neuroprzekaźników i innych odczynników mających na celu modulację ruchu mitochondriów. Podsumowując, ekspresja czerwonego białka fluorescencyjnego ukierunkowanego na organellum za pośrednictwem lentiwirusa oraz połączenie naszego inkubatora nakładkowego, konwencjonalnego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, kamery CCD i źródła światła ksenonowego pozwalają nam pozyskiwać obrazy time-lapse transportu mitochondriów w żywych neuronach przez dłuższy czas, niż jest to możliwe w badaniach wykorzystujących konwencjonalne barwniki witalne i gotowe systemy podtrzymywania życia.

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Aby zrozumieć związek między transportem mitochondriów a funkcją neuronów, kluczowe jest obserwowanie zachowania mitochondriów w żywych hodowlach...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja transportu mitochondriów w hodowlach neuronów w długim odstępie czasu przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie znakowanie mitochondriów w hodowlanych neuronach białkiem fluorescencyjnym ukierunkowanym na organelle. Drugim krokiem procedury jest wykonanie obrazowania transportu mitochondriów w warunkach kontrolnych.Trzecim krokiem procedury jest wykonanie serii obrazów time-lapse transportu mitochondriów po ostrym podaniu neuromodulatorów, takich jak serotonina. Ostatnim krokiem procedury jest analiza uzyskanych serii obrazów time-lapse. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące, że neuroprzekaźniki modulują transport mitochondriów.Takie wyniki można osiągnąć jedynie poprzez obrazowanie mitochondriów znakowanych fluorescencyjnie w neuronach przez długi czas. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak znakowanie barwnikami witalnymi czy przejściowa transfekcja GFP, jest to, że umożliwia ona prowadzenie długoterminowych obserwacji transportu mitochondrialnego w zdrowych hodowlach neuronów. Procedurę tę zaprezentuje Chen, adiunkt z mojego laboratorium, w celu zapewnienia stabilnie podgrzewanego i nawilżanego środowiska.Inkubator nadstolikowy jest połączony ze standardowym inkubatorem do hodowli tkanek za pomocą zamkniętego obwodu, a pokrywka z membrany A-P-F-T-E do szklanych naczyń hodowlanych o średnicy 35 milimetrów umożliwia wymianę gazową między hodowlą neuronową a środowiskiem wewnątrz inkubatora. Wspólnie funkcje te oraz inne rozwiązania pozwalają na długoterminową obserwację hodowli neuronów w różnych warunkach eksperymentalnych. Przenieś naczynie hodowlane zawierające hodowlę neuronów hipokampa wykazujących ekspresję białka mito turbo red do komory z laminarnym przepływem powietrza.Zastąp plastikową pokrywkę pokrywką z membraną PTFE i przenieś naczynie hodowlane pod mikroskop. Przymocnij podstawę inkubatora do stolika mikroskopu, a następnie ostrożnie osadź naczynie hodowlane z pokrywą membranową. W zagłębieniu dopasuj obudowę inkubatora do stalowych słupków w podstawie inkubatora i opuść obudowę na podstawę.Dokręć śruby motylkowe, aż do uzyskania szczelnego połączenia między obudową a podstawą. Przed uruchomieniem oprogramowania do obrazowania włącz sterownik koła filtrów mikroskopu, źródło światła oraz kamerę CCD. W niniejszym protokole do akwizycji obrazów wykorzystuje się książkę slajdów numer pięć.Przełącz na obiektyw imersyjny 63x i opuść rewolwer obiektywów. Ostrożnie nanieś olej imersyjny na powierzchnię obiektywu. Kliknij ikonę okna ostrości na pasku narzędzi i włącz lampę pola jasnego, przesuwając suwak lampy.Aby dostosować intensywność światła, należy ustawić ostrość na polu komórek za pomocą okularów i znaleźć interesującą komórkę. Wybierz filtr XI trzy w zakładce zakresu widzenia, używając okularów znajdź płaszczyznę ostrości dla mitochondriów w komórkach znakowanych białkiem mito turbo red, a następnie przełącz się na kamerę CCD. Kliknij ikonę przechwytywania obrazu na pasku narzędzi, zaczynając od początkowego czasu ekspozycji 100 milisekund.Wyznacz optymalny czas ekspozycji, korzystając z przycisków „test” oraz „best” w oknie przechwytywania obrazu. W sekcji typu przechwytywania (capture type) zaznacz opcję time-lapse, a następnie wybierz pożądany odstęp czasu pomiędzy zdjęciami oraz czas trwania sesji obrazowania w opcjach przechwytywania time-lapse.Rozpocznij akwizycję obrazów w trybie poklatkowym, klikając przycisk start w prawym dolnym rogu okna przechwytywania. Po przeprowadzeniu kontrolnej sesji obrazowania podaj neurotransmitery lub inne odczynniki przez porty wtryskowe znajdujące się na górze inkubatora sceny. Po dodaniu agonisty receptorów serotoninowych 8-OH-DPAT mitochondria, wcześniej stacjonarne i wskazane przez grot strzałki, zaczynają poruszać się wzdłuż aksonu neuronu hipokampa.Średnia prędkość i kierunkowość poszczególnych mitochondriów została podsumowana przed dodaniem serotoniny. Większość mitochondriów pozostaje nieruchoma; jednak po dodaniu serotoniny 42% mitochondriów wykazuje obecnie ruch kierunkowy i przebywa większe odległości niż te wykazujące ruch kierunkowy w przypadku braku serotoniny. I odwrotnie, po dodaniu dopaminy 92% mitochondriów pozostaje nieruchomych w ciągu ostatnich 15 minut sesji obrazowania po zastosowaniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody monitorowania więcej niż jednego sygnału. Przykładem może być badanie związku między aktywnością wapnia a transportem mitochondrialnym w neuronach.

neuromodulation-mitochondrial-transport-live-imaging-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Neuromodulacja i transport mitochondrialny: Obrazowanie na żywo w neuronach hipokampu przez długi czas

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Źródło: Katsalifis, A., et al. Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika fluorescencyjnego. Stosując dwie długości fal wzbudzenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, mierzy się współczynnik intensywności fluorescencji w celu oceny utleniania mitochondriów. Protokół obejmuje...

Obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego

Wewnątrzkomórkowa przebudowa Ca2+ w procesie starzenia się może przyczyniać się do ekscytotoksyczności i uszkodzenia neuronów, procesów, w których pośredniczy przeciążenie Ca2+. Naszym celem było zbadanie przebudowy Ca2 + w starzejącym się mózgu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego cytozolowego i mitochondrialnego Ca2 + w długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa szczura, modelu starzenia się neuronów.

Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę obrazowania transportu mitochondrialnego w neuronach hipokampa przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Technika ta wykorzystuje ekspresję białka fluorescencyjnego i inkubator do długotrwałych obserwacji.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Przeglądaj więcej filmów