Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja transportu mitochondriów w hodowlach neuronów w długim odstępie czasu przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie znakowanie mitochondriów w hodowlanych neuronach białkiem fluorescencyjnym ukierunkowanym na organelle. Drugim krokiem procedury jest wykonanie obrazowania transportu mitochondriów w warunkach kontrolnych.

Trzecim krokiem procedury jest wykonanie serii obrazów time-lapse transportu mitochondriów po ostrym podaniu neuromodulatorów, takich jak serotonina. Ostatnim krokiem procedury jest analiza uzyskanych serii obrazów time-lapse. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące, że neuroprzekaźniki modulują transport mitochondriów.

Takie wyniki można osiągnąć jedynie poprzez obrazowanie mitochondriów znakowanych fluorescencyjnie w neuronach przez długi czas. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak znakowanie barwnikami witalnymi czy przejściowa transfekcja GFP, jest to, że umożliwia ona prowadzenie długoterminowych obserwacji transportu mitochondrialnego w zdrowych hodowlach neuronów. Procedurę tę zaprezentuje Chen, adiunkt z mojego laboratorium, w celu zapewnienia stabilnie podgrzewanego i nawilżanego środowiska.

Inkubator nadstolikowy jest połączony ze standardowym inkubatorem do hodowli tkanek za pomocą zamkniętego obwodu, a pokrywka z membrany A-P-F-T-E do szklanych naczyń hodowlanych o średnicy 35 milimetrów umożliwia wymianę gazową między hodowlą neuronową a środowiskiem wewnątrz inkubatora. Wspólnie funkcje te oraz inne rozwiązania pozwalają na długoterminową obserwację hodowli neuronów w różnych warunkach eksperymentalnych. Przenieś naczynie hodowlane zawierające hodowlę neuronów hipokampa wykazujących ekspresję białka mito turbo red do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Zastąp plastikową pokrywkę pokrywką z membraną PTFE i przenieś naczynie hodowlane pod mikroskop. Przymocnij podstawę inkubatora do stolika mikroskopu, a następnie ostrożnie osadź naczynie hodowlane z pokrywą membranową. W zagłębieniu dopasuj obudowę inkubatora do stalowych słupków w podstawie inkubatora i opuść obudowę na podstawę.

Dokręć śruby motylkowe, aż do uzyskania szczelnego połączenia między obudową a podstawą. Przed uruchomieniem oprogramowania do obrazowania włącz sterownik koła filtrów mikroskopu, źródło światła oraz kamerę CCD. W niniejszym protokole do akwizycji obrazów wykorzystuje się książkę slajdów numer pięć.

Przełącz na obiektyw imersyjny 63x i opuść rewolwer obiektywów. Ostrożnie nanieś olej imersyjny na powierzchnię obiektywu. Kliknij ikonę okna ostrości na pasku narzędzi i włącz lampę pola jasnego, przesuwając suwak lampy.

Aby dostosować intensywność światła, należy ustawić ostrość na polu komórek za pomocą okularów i znaleźć interesującą komórkę. Wybierz filtr XI trzy w zakładce zakresu widzenia, używając okularów znajdź płaszczyznę ostrości dla mitochondriów w komórkach znakowanych białkiem mito turbo red, a następnie przełącz się na kamerę CCD. Kliknij ikonę przechwytywania obrazu na pasku narzędzi, zaczynając od początkowego czasu ekspozycji 100 milisekund.

Wyznacz optymalny czas ekspozycji, korzystając z przycisków „test” oraz „best” w oknie przechwytywania obrazu. W sekcji typu przechwytywania (capture type) zaznacz opcję time-lapse, a następnie wybierz pożądany odstęp czasu pomiędzy zdjęciami oraz czas trwania sesji obrazowania w opcjach przechwytywania time-lapse.

Rozpocznij akwizycję obrazów w trybie poklatkowym, klikając przycisk start w prawym dolnym rogu okna przechwytywania. Po przeprowadzeniu kontrolnej sesji obrazowania podaj neurotransmitery lub inne odczynniki przez porty wtryskowe znajdujące się na górze inkubatora sceny. Po dodaniu agonisty receptorów serotoninowych 8-OH-DPAT mitochondria, wcześniej stacjonarne i wskazane przez grot strzałki, zaczynają poruszać się wzdłuż aksonu neuronu hipokampa.

Średnia prędkość i kierunkowość poszczególnych mitochondriów została podsumowana przed dodaniem serotoniny. Większość mitochondriów pozostaje nieruchoma; jednak po dodaniu serotoniny 42% mitochondriów wykazuje obecnie ruch kierunkowy i przebywa większe odległości niż te wykazujące ruch kierunkowy w przypadku braku serotoniny. I odwrotnie, po dodaniu dopaminy 92% mitochondriów pozostaje nieruchomych w ciągu ostatnich 15 minut sesji obrazowania po zastosowaniu tej procedury.

W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody monitorowania więcej niż jednego sygnału. Przykładem może być badanie związku między aktywnością wapnia a transportem mitochondrialnym w neuronach.