Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie zapisów elektrycznych z neuronów przyparametycznych w organotypowych skrawkach neokory. Cel ten osiąga się najpierw poprzez wykonanie ostrych skrawków z szczurów w wieku postnatalnym od P8 do P10. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie transfekcji cDNA za pomocą wektora Bic. Trzecim krokiem procedury jest hodowla skrawków przez okres od trzech do siedmiu dni.

Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie rejestracji elektrycznej z transfekowanych komórek przy użyciu metody clampingu prądowego lub napięciowego. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że komórki parametalne w skrawkach organotypowych posiadają właściwości podobne do komórek ze skrawków świeżych w tym samym wieku. Transfekcja GFP nie zmienia tych właściwości, co umożliwia badanie neuronów po manipulacjach genetycznych kanałami jonowymi poprzez rejestracje prądowe lub napięciowe w konfiguracji whole-cell.

Główną zaletą tej techniki, w przeciwieństwie na przykład do przekrojów ostrych, jest możliwość utrzymania komórek w normalnym środowisku przez czas wystarczająco długi, aby przeprowadzić genetyczną manipulację kanałami jonowymi. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kanałów jonowych, takie jak funkcjonalne role specyficznych typów kanałów jonowych. Należy przygotować komorę z laminarnym przepływem powietrza, dygestorium próżniowe, akcesoria chirurgiczne i roztwory zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Na wszystkich kolejnych etapach należy stosować rękawiczki; po przefiltrowaniu przygotowanej porcji 250 milliliters roztworu tnącego, należy odmierzyć 40 milliliters do zlewki o pojemności 50 milliliters.

Umieść komorę tnącą, alikwot 40 ml oraz pozostałe 210 ml roztworu tnącego w zamrażarce o temperaturze -20 °C pod laminarnym dygestorium. Wlej 1,1 ml pożywki hodowlanej do trzech przekątnie położonych studni płytki 6-dołkowej. Powtórz tę czynność po raz drugi.

Płytka 6-dołkowa. Umieść płytki 6-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej jedną godzinę. Następnie, za pomocą sterylnych nożyczek, skróć cztery pipety transferowe, które będą służyć do przenoszenia przekrojów.

Kolejne trzy pipety pozostawia się nienaruszone, gdy roztwory zmienią się w gęste mieszaniny. Wyjmij 40 mililitrów alikwotu roztworu do cięcia z zamrażarki i umieść go pod dygestorium próżniowym. Napowietrz go mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Następnie wyjmij 210 ml roztworu do cięcia z zamrażarki i umieść go pod dyfuzorem w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Nasyć go mieszanką 95%tlenu i 5%dwutlenku węgla. Następnie wyjmij medium do płukania z lodówki i nasyć je 100%tlenem w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Nalej dwa mililitry pożywki do szalki Petriego. Pozostałą pożywkę umieść w lodówce w celu późniejszej wymiany w ciągu tygodnia, aby przygotować się do krojenia mózgu. Pod wyciągiem próżniowym przelej około 10 mililitrów zimnego roztworu do cięcia z zlewki o objętości 50 mililitrów do zlewki o objętości 25 mililitrów.

Po znieczuleniu i dekapitacji wyjmij mózg szczura w 8. do 10. dniu po urodzeniu. Płucz mózg w zlewce zawierającej 30 milliliters zimnego roztworu do cięcia przez około 30 sekund. Następnie ostrożnie przenieś mózg do zlewki o pojemności 25 milliliters.

Zmień rękawiczki i nasącz je etanolem. Następnie przenieś mózg w zimnym roztworze do cięcia pod komorę z laminarnym przepływem powietrza. Kolejnym krokiem jest zorientowanie i zablokowanie mózgu poprzez usunięcie móżdżku oraz bieguna czołowego i wykonanie częściowego cięcia pośrodkowego w płaszczyźnie strzałkowej; przyklej zablokowany mózg do stolika korą czołową skierowaną do góry.

W razie potrzeby wykonać dodatkowe nacięcia skalpelem, aby ograniczyć rozmiar plastrów. Następnie umieścić stół z mózgiem w sterylizowanej metalowej komorze do krojenia. Przymocować go do wibracyjnego kroicza do tkanek.

Napełnić kąpiel lodowatym, napowietrzonym roztworem do cięcia. Wlać 30 mililitrów pozostałego roztworu do cięcia do zlewki o pojemności 50 mililitrów i napowietrzyć mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Zlewka ta będzie służyć do zbierania przekrojów.

Wykonaj koronalne przekroje kory czołowo-parietalnej o grubości 250 micron. Umieść co najmniej sześć przekrojów w zlewce o pojemności 50 milliliter zawierającej roztwór do cięcia. Następnie wlej około two milliliters medium płuczącego do szalki Petriego o średnicy 35 millimeter.

Za pomocą odciętej końcówki pipety przenieś plasterki z roztworu do cięcia do szalki Petriego zawierającej medium płuczące. Przepłucz plasterki trzykrotnie, używając nowych końcówek pipet do dodawania medium oraz odsysania zużytych roztworów po płukaniu; następnie przenieś plasterki do 35 milimetrowej szalki Petriego zawierającej medium hodowlane. Następnie zdejmij górne części opakowań wkładów siatkowych, pozostawiając wkładki wewnątrz opakowań.

Następnie za pomocą pęsety i uciętej pipety transferowej wyjmij jeden wkład siatkowy z opakowania. Przenieś jeden plasterek z pożywki hodowlanej na siatkę. Wprowadź i umieść plasterek na środku membrany, używając nienaruszonej pipety transferowej.

Usunąć nadmiar pożywki hodowlanej. Następnie umieścić wkład siatkowy z plastrem tkanki w jednym z wypełnionych cieczą dołków płytki sześciodołkowej. Należy zachować ostrożność, aby po umieszczeniu jednego plastra w każdym z wypełnionych cieczą dołków nie powstały pęcherzyki powietrza pod siatką.

Umieścić obie płytki sześciodołkowe z powrotem w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C przez około jedną godzinę. W międzyczasie należy oczyścić obszar roboczy pod laminarnym wyciągiem w celu przygotowania do transfekcji. Następnym krokiem jest załadowanie gene gun BioRad Helios, pozostawiając pierwszą pozycję wolną.

Włożyć kasetę zawierającą mikrocząsteczki powlekane CD NA w co drugą pozycję uchwytnika kaset w urządzeniu do transfekcji genetycznej. Następnie umieścić uchwytnik kaset w urządzeniu. W pierwszej kolejności oczyścić urządzenie, wykonując strzał z lufy bez mikrocząsteczek.

Następnie przesunij bęben do naboju zawierającego CDNA.Bullets. Wyjmij płytki 6-dołkowe z inkubatora i umieść je pod laminarnym dygestorium. Trzymając pistolet pionowo tuż nad górną częścią płytki 6-dołkowej, wykonaj strzał w jedną sekcję przy ciśnieniu 100 PSI, a następnie przesuń bęben i oczyść go, oddając strzał pusty. W pozostałe sekcje wykonaj po jednym strzale na sekcję.

Po wykonaniu zdjęć należy przenieść płytki 6-dołkowe z powrotem do inkubatora i inkubować skrawki w temperaturze 37°C przez dwa do siedmiu dni w atmosferze 5% CO2. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień w następujący sposób: pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy dodać nową pożywkę do trzech nieobsadzonych dołków. Następnie płytkę 6-dołkową należy pozostawić w inkubatorze na co najmniej jedną godzinę; po tym czasie płytkę przenosi się z powrotem do komory laminarnej, a następnie za pomocą oczyszczonej etanolem pęsety zakrzywionej należy przenieść każdy wkład siatkowy wraz ze skrawkiem do nowego dołka, odessać starą pożywkę i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora.

Po kilku dniach inkubacji plastry są gotowe do rejestracji z całych komórek. Wyjmij płytkę sześciodołkową z inkubatora pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą wyczyszczonej etanolem pęsety zakrzywionej wyjmij jeden wkład z siatką wraz z plastrem.

Następnie umieść płytkę sześciodołkową z powrotem w inkubatorze. Potem przenieś szalkę Petriego z wkładką z siatki i skrawkiem tkanki do obszaru rejestracji, napinając siatkę za pomocą pęsety lub elastycznego kawałka metalu. W razie potrzeby użyj skalpela nr 11, aby wyciąć siatkę wokół skrawka tkanki, a końcowe cięcia wykonaj nożyczkami.

Następnie za pomocą pęsety przenieś skrawek wraz z przytwierdzoną siatką do komory rejestracyjnej. Na stoliku mikroskopu odwróconego utrzymuj skrawek w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym nasyconym karbogenem, korzystając z optyki IR DIC. Zwizualizuj neurony parametalne w warstwie drugiej, trzeciej lub piątej, używając epi-fluorescencji i filtra fitz.

Zlokalizuj zielone komórki przetransfekowane pod mikroskopem IR DIC. Poszukaj kulek CDNA, które widoczne są jako małe czarne kropki wewnątrz komórek. Wybierz przetransfekowaną komórkę do rejestracji z całej komórki.

Następnie należy przesunąć mikroelektrodę do wybranej komórki i zastosować delikatne ssanie, aby uzyskać uszczelnienie gigaomowe. Potem należy przyłożyć dodatkowe ssanie, aby przebić błonę komórkową i przejść do rejestracji z całej komórki. Komórka jest teraz gotowa do rejestracji metodą clampingu prądowego lub napięciowego.

Rycina ta przedstawia obraz fluorescencyjny komórek przetransfekowanych CDNA dla GFP. Poniższe rejestracje zostały wykonane z komórek przetransfekowanych CDNA dla GFP. Przedstawiono tutaj potencjał czynnościowy w komórce parametal warstwy trzeciej w odpowiedzi na ponadprogowe wstrzyknięcie prądu trwające 10 milisekund.

Rysunek przedstawia seryjne wyładowania neuronu parametalnej warstwy piątej w odpowiedzi na dwusekundową iniekcję prądu o natężeniu 400 pA. Rysunek przedstawia zapis z zacisku napięciowego neuronu parametalnej warstwy piątej. Do zablokowania napięciozależnego prądu sodowego użyto tetrodotoksyny.

Ślady przedstawiają zewnętrzne prądy potasowe wywołane serią skoków napięcia o czasie trwania 500 ms z potencjału spoczynkowego wynoszącego -70 mV. Po opanowaniu metody, drobne przygotowania i transfekcja mogą zostać wykonane w około dwie godziny, wliczając czas przygotowania. Podczas próby wykonania tej procedury.

Ważne jest zachowanie warunków sterylnych oraz ograniczenie grubości i wymiarów skrawka, aby zapobiec jego wysychaniu. Dziękujemy za obejrzenie materiału. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

Dziękujemy.