Name: Zapis całych komórek z organotypowego preparatu warstwy kory nowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę zapisów całokomórkowych z organotypowych preparatów kory nowej szczurów. Technika umożliwia badanie właściwości neuronów piramidowych po transfekcji genetycznej przy użyciu klamry prądowej lub napięciowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Mayumi Sakurabie i Rebeccie Foehring za wyjątkową pomoc techniczną. Ponadto chcielibyśmy podziękować dr. Rodrigo Andrade za pomoc w implementacji protokołów organotypowej hodowli plastrów oraz transfekcji biolistycznej, a także dr Jeanne Nerbonne za udostępnienie konstruktów cDNA do transfekcji. Praca ta była finansowana z grantu NIH: NS044163 z NINDS (dla RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Badaliśmy ekspresję i role funkcjonalne napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach piramidalnych nowokory ratów (4, 9-11). Ze względu na brak specyficznych czynników farmakologicznych dla tych kanałów, stosujemy podejście genetyczne do manipulowania ich ekspresją (1,14,15,17-19). Wykorzystujemy preparat hodowli organotypowej (2,3;5-8;12,13,15-22), zmodyfikowany na podstawie metody Stoppini et al. (16), w celu zachowania morfologii komórek i warstwowej struktury kory. Izolujemy świeże skrawki nowokory w ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Chirurgia / transfekcja / hodowla:&lt;/p&gt;&lt;lista uporządkowana&gt;&lt;li&gt;Slicer do mózgu: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA&lt;/li&gt;&lt;li&gt;System do biolistyki (Gene Gun): Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Zawartość: pistolet genowy, zestaw węża helowego z regulatorem, stacja do przygotowania rurek (#165-2418), zestaw strzykawek, rurki Tefzel, przecinak do rurek, zestaw optymalizacyjny (#165-2424), przecinak do rurek&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Regulator helu Bio-Rad (#165-2413)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;materiały jednorazowe do systemu Helios firmy Bio-Rad:&lt;ul&gt;&lt;li&gt;1.6 &amp;#x03BC;Złote mikronośniki: #165-2264&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Przewód Tefzel: #165-2441&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Inkubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Pożywki:&lt;/p&gt;&lt;lista uporządkowana&gt;&lt;li&gt;Surowica końska: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;HMEM (minimalne podłoże niezbędne z HBSS i HEPES, bez glutaminy: Lonza BioWhittaker nr katalogowy 12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955-6288, opcja 1. &lt;/li&gt;&lt;li&gt;HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, opcja 1.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;MEM (podłoże minimalne niezbędne GIBCO, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Opcja 1.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;250 ml Millipore 0,2 &amp;#x03BC;filtr m: #SC6PU02RE&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Plastikowe pipety transferowe: Fisher #13-711-20.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;50 ml Millipore steriflip 0,22 &amp;#x03BC;filtr m (#SCGP00525)&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;Proszę podać treść do tłumaczenia.&quot;&gt;Pozycje 6-8 otrzymano z: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;krok JoVE&quot;&gt;Nagranie:&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;Pipeta szklana: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Pozioma wyciągarka elektrod Sutter P-87: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Wzmacniacz Axon Instruments Multiclamp 700B: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Oprogramowanie do akwizycji danych PClamp 10: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Położenie elektrody jest kontrolowane za pomocą Sutter R&amp;#8211;manipulatory -200 i sterownik PC-200: &lt;silny&gt;Sutter Instrument Company&lt;/strong&gt;, One Digital Drive, Novato, CA 94949. &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikroskop: pionowy mikroskop Olympus BX-50WI z optyką IR-DIC&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Kamera czuła na podczerwień OLY-150 (Olympus) lub DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North R&amp;#8211;ske Avenue, Michigan City, IN 46360).&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Badamy ekspresję i role funkcjonalne napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach piramidowych z neokory szczura. Ze względu na brak specyficznych środków farmakologicznych dla tych kanałów, zastosowaliśmy podejście genetyczne do manipulowania ich ekspresją. Wykorzystujemy preparat hodowli organotypowej (16), aby zachować morfologię komórek i warstwową strukturę kory. Zazwyczaj izolujemy świeże skrawki neokory w 8-10 dniu po urodzeniu i utrzymujemy je w hodowli przez 3-7 dni. Pozwala nam to badać neurony w wieku zbliżonym do tych stosowanych w naszych badaniach na świeżych skrawkach oraz minimalizuje rozwój nadmiernych połączeń pobudzających w skrawku. Rejestrujemy aktywność wizualnie zidentyfikowanych neuronów piramidowych w warstwach II/III lub V, wykorzystując oświetlenie w podczerwieni (IR-) oraz mikroskopię kontrastową z interferencją różnicową (DIC), stosując metodę patch clamp w konfiguracji whole-cell w trybie clamp prądowy lub napięciowy. Do manipulowania ekspresją kanałów w celu badania ich funkcji stosujemy transfekcję biolistyczną (pistolet genowy) DNA kanałów potasowych typu dzikiego lub zmutowanych. Komórki przetransfekowane są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej po kotransfekcji cDNA dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Rejestracje z przetransfekowanych komórek porównujemy z sąsiednimi, nietransfekowanymi neuronami z tej samej warstwy tego samego skrawka.

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Badaliśmy ekspresję i role funkcjonalne potencjałowo zależnych kanałów potasowych w neuronach piramidalnych z nowokory neocortex szczura. Ze względu na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie zapisów elektrycznych z neuronów przyparametycznych w organotypowych skrawkach neokory. Cel ten osiąga się najpierw poprzez wykonanie ostrych skrawków z szczurów w wieku postnatalnym od P8 do P10. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie transfekcji cDNA za pomocą wektora Bic. Trzecim krokiem procedury jest hodowla skrawków przez okres od trzech do siedmiu dni.Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie rejestracji elektrycznej z transfekowanych komórek przy użyciu metody clampingu prądowego lub napięciowego. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że komórki parametalne w skrawkach organotypowych posiadają właściwości podobne do komórek ze skrawków świeżych w tym samym wieku. Transfekcja GFP nie zmienia tych właściwości, co umożliwia badanie neuronów po manipulacjach genetycznych kanałami jonowymi poprzez rejestracje prądowe lub napięciowe w konfiguracji whole-cell.Główną zaletą tej techniki, w przeciwieństwie na przykład do przekrojów ostrych, jest możliwość utrzymania komórek w normalnym środowisku przez czas wystarczająco długi, aby przeprowadzić genetyczną manipulację kanałami jonowymi. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kanałów jonowych, takie jak funkcjonalne role specyficznych typów kanałów jonowych. Należy przygotować komorę z laminarnym przepływem powietrza, dygestorium próżniowe, akcesoria chirurgiczne i roztwory zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Na wszystkich kolejnych etapach należy stosować rękawiczki; po przefiltrowaniu przygotowanej porcji 250 milliliters roztworu tnącego, należy odmierzyć 40 milliliters do zlewki o pojemności 50 milliliters.Umieść komorę tnącą, alikwot 40 ml oraz pozostałe 210 ml roztworu tnącego w zamrażarce o temperaturze -20 °C pod laminarnym dygestorium. Wlej 1,1 ml pożywki hodowlanej do trzech przekątnie położonych studni płytki 6-dołkowej. Powtórz tę czynność po raz drugi.Płytka 6-dołkowa. Umieść płytki 6-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej jedną godzinę. Następnie, za pomocą sterylnych nożyczek, skróć cztery pipety transferowe, które będą służyć do przenoszenia przekrojów.Kolejne trzy pipety pozostawia się nienaruszone, gdy roztwory zmienią się w gęste mieszaniny. Wyjmij 40 mililitrów alikwotu roztworu do cięcia z zamrażarki i umieść go pod dygestorium próżniowym. Napowietrz go mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.Następnie wyjmij 210 ml roztworu do cięcia z zamrażarki i umieść go pod dyfuzorem w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Nasyć go mieszanką 95%tlenu i 5%dwutlenku węgla. Następnie wyjmij medium do płukania z lodówki i nasyć je 100%tlenem w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Nalej dwa mililitry pożywki do szalki Petriego. Pozostałą pożywkę umieść w lodówce w celu późniejszej wymiany w ciągu tygodnia, aby przygotować się do krojenia mózgu. Pod wyciągiem próżniowym przelej około 10 mililitrów zimnego roztworu do cięcia z zlewki o objętości 50 mililitrów do zlewki o objętości 25 mililitrów.Po znieczuleniu i dekapitacji wyjmij mózg szczura w 8. do 10. dniu po urodzeniu. Płucz mózg w zlewce zawierającej 30 milliliters zimnego roztworu do cięcia przez około 30 sekund. Następnie ostrożnie przenieś mózg do zlewki o pojemności 25 milliliters.Zmień rękawiczki i nasącz je etanolem. Następnie przenieś mózg w zimnym roztworze do cięcia pod komorę z laminarnym przepływem powietrza. Kolejnym krokiem jest zorientowanie i zablokowanie mózgu poprzez usunięcie móżdżku oraz bieguna czołowego i wykonanie częściowego cięcia pośrodkowego w płaszczyźnie strzałkowej; przyklej zablokowany mózg do stolika korą czołową skierowaną do góry.W razie potrzeby wykonać dodatkowe nacięcia skalpelem, aby ograniczyć rozmiar plastrów. Następnie umieścić stół z mózgiem w sterylizowanej metalowej komorze do krojenia. Przymocować go do wibracyjnego kroicza do tkanek.Napełnić kąpiel lodowatym, napowietrzonym roztworem do cięcia. Wlać 30 mililitrów pozostałego roztworu do cięcia do zlewki o pojemności 50 mililitrów i napowietrzyć mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Zlewka ta będzie służyć do zbierania przekrojów.Wykonaj koronalne przekroje kory czołowo-parietalnej o grubości 250 micron. Umieść co najmniej sześć przekrojów w zlewce o pojemności 50 milliliter zawierającej roztwór do cięcia. Następnie wlej około two milliliters medium płuczącego do szalki Petriego o średnicy 35 millimeter.Za pomocą odciętej końcówki pipety przenieś plasterki z roztworu do cięcia do szalki Petriego zawierającej medium płuczące. Przepłucz plasterki trzykrotnie, używając nowych końcówek pipet do dodawania medium oraz odsysania zużytych roztworów po płukaniu; następnie przenieś plasterki do 35 milimetrowej szalki Petriego zawierającej medium hodowlane. Następnie zdejmij górne części opakowań wkładów siatkowych, pozostawiając wkładki wewnątrz opakowań.Następnie za pomocą pęsety i uciętej pipety transferowej wyjmij jeden wkład siatkowy z opakowania. Przenieś jeden plasterek z pożywki hodowlanej na siatkę. Wprowadź i umieść plasterek na środku membrany, używając nienaruszonej pipety transferowej.Usunąć nadmiar pożywki hodowlanej. Następnie umieścić wkład siatkowy z plastrem tkanki w jednym z wypełnionych cieczą dołków płytki sześciodołkowej. Należy zachować ostrożność, aby po umieszczeniu jednego plastra w każdym z wypełnionych cieczą dołków nie powstały pęcherzyki powietrza pod siatką.Umieścić obie płytki sześciodołkowe z powrotem w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C przez około jedną godzinę. W międzyczasie należy oczyścić obszar roboczy pod laminarnym wyciągiem w celu przygotowania do transfekcji. Następnym krokiem jest załadowanie gene gun BioRad Helios, pozostawiając pierwszą pozycję wolną.Włożyć kasetę zawierającą mikrocząsteczki powlekane CD NA w co drugą pozycję uchwytnika kaset w urządzeniu do transfekcji genetycznej. Następnie umieścić uchwytnik kaset w urządzeniu. W pierwszej kolejności oczyścić urządzenie, wykonując strzał z lufy bez mikrocząsteczek.Następnie przesunij bęben do naboju zawierającego CDNA.Bullets. Wyjmij płytki 6-dołkowe z inkubatora i umieść je pod laminarnym dygestorium. Trzymając pistolet pionowo tuż nad górną częścią płytki 6-dołkowej, wykonaj strzał w jedną sekcję przy ciśnieniu 100 PSI, a następnie przesuń bęben i oczyść go, oddając strzał pusty. W pozostałe sekcje wykonaj po jednym strzale na sekcję.Po wykonaniu zdjęć należy przenieść płytki 6-dołkowe z powrotem do inkubatora i inkubować skrawki w temperaturze 37°C przez dwa do siedmiu dni w atmosferze 5% CO2. Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień w następujący sposób: pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy dodać nową pożywkę do trzech nieobsadzonych dołków. Następnie płytkę 6-dołkową należy pozostawić w inkubatorze na co najmniej jedną godzinę; po tym czasie płytkę przenosi się z powrotem do komory laminarnej, a następnie za pomocą oczyszczonej etanolem pęsety zakrzywionej należy przenieść każdy wkład siatkowy wraz ze skrawkiem do nowego dołka, odessać starą pożywkę i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora.Po kilku dniach inkubacji plastry są gotowe do rejestracji z całych komórek. Wyjmij płytkę sześciodołkową z inkubatora pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą wyczyszczonej etanolem pęsety zakrzywionej wyjmij jeden wkład z siatką wraz z plastrem.Następnie umieść płytkę sześciodołkową z powrotem w inkubatorze. Potem przenieś szalkę Petriego z wkładką z siatki i skrawkiem tkanki do obszaru rejestracji, napinając siatkę za pomocą pęsety lub elastycznego kawałka metalu. W razie potrzeby użyj skalpela nr 11, aby wyciąć siatkę wokół skrawka tkanki, a końcowe cięcia wykonaj nożyczkami.Następnie za pomocą pęsety przenieś skrawek wraz z przytwierdzoną siatką do komory rejestracyjnej. Na stoliku mikroskopu odwróconego utrzymuj skrawek w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym nasyconym karbogenem, korzystając z optyki IR DIC. Zwizualizuj neurony parametalne w warstwie drugiej, trzeciej lub piątej, używając epi-fluorescencji i filtra fitz.Zlokalizuj zielone komórki przetransfekowane pod mikroskopem IR DIC. Poszukaj kulek CDNA, które widoczne są jako małe czarne kropki wewnątrz komórek. Wybierz przetransfekowaną komórkę do rejestracji z całej komórki.Następnie należy przesunąć mikroelektrodę do wybranej komórki i zastosować delikatne ssanie, aby uzyskać uszczelnienie gigaomowe. Potem należy przyłożyć dodatkowe ssanie, aby przebić błonę komórkową i przejść do rejestracji z całej komórki. Komórka jest teraz gotowa do rejestracji metodą clampingu prądowego lub napięciowego.Rycina ta przedstawia obraz fluorescencyjny komórek przetransfekowanych CDNA dla GFP. Poniższe rejestracje zostały wykonane z komórek przetransfekowanych CDNA dla GFP. Przedstawiono tutaj potencjał czynnościowy w komórce parametal warstwy trzeciej w odpowiedzi na ponadprogowe wstrzyknięcie prądu trwające 10 milisekund.Rysunek przedstawia seryjne wyładowania neuronu parametalnej warstwy piątej w odpowiedzi na dwusekundową iniekcję prądu o natężeniu 400 pA. Rysunek przedstawia zapis z zacisku napięciowego neuronu parametalnej warstwy piątej. Do zablokowania napięciozależnego prądu sodowego użyto tetrodotoksyny.Ślady przedstawiają zewnętrzne prądy potasowe wywołane serią skoków napięcia o czasie trwania 500 ms z potencjału spoczynkowego wynoszącego -70 mV. Po opanowaniu metody, drobne przygotowania i transfekcja mogą zostać wykonane w około dwie godziny, wliczając czas przygotowania. Podczas próby wykonania tej procedury.Ważne jest zachowanie warunków sterylnych oraz ograniczenie grubości i wymiarów skrawka, aby zapobiec jego wysychaniu. Dziękujemy za obejrzenie materiału. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.Dziękujemy.

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracja całego neuronu z przygotowania kropkowego płata czołowego kory mózgowej

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Ten film pokazuje umieszczanie pipety o cienkim czubku w pobliżu wycinków mózgu, tworząc pieczęć z komórką neuronalną. Zasysanie przerywa błonę komórkową, tworząc w ten sposób klamrę krosową całej komórki, która umożliwia pomiary prądu do eksperymentów elektrofizjologicznych.

Ustalenie konfiguracji cęgów napięciowych całej komórki dla zapisów elektrofizjologicznych w wycinkach mózgu

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Nagrania par to równoczesne nagrania klamrów całych komórek z dwóch synaptycznie połączonych neuronów, umożliwiające precyzyjną elektrofizjologiczną i farmakologiczną charakterystykę synaps między poszczególnymi neuronami. Poniżej opisujemy szczegółową metodologię i wymagania dotyczące ustalenia tej techniki w organotypowych kulturach plastrów hipokampa w dowolnym laboratorium wyposażonym do elektrofizjologii.

Sparowane nagrania całych komórek w organotypowych wycinkach hipokampa

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

W tym artykule omawiamy trzy preparaty mózgowe używane do rejestracji klamer z całych komórek w celu zbadania obwodu siatkówkowego kijanek Xenopus laevis. Każdy preparat, z własnymi specyficznymi zaletami, przyczynia się do eksperymentalnej wykonalności kijanki Xenopus jako modelu do badania funkcji obwodów neuronalnych.

Preparaty i protokoły do rejestracji całych komórek w postaci klamry krosowej neuronów tektalnych Xenopus laevis

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Tutaj prezentujemy protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologicznego funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych. Protokół ten zapewnia skuteczny sposób badania synaps z wysokim i niskim prawdopodobieństwem uwalniania w tych samych ostrych wycinkach mózgu.

Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Poznaj metodę zapisów całokomórkowych z organotypowych preparatów kory nowej szczurów. Technika umożliwia badanie właściwości neuronów piramidowych po transfekcji genetycznej przy użyciu klamry prądowej lub napięciowej.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Przeglądaj więcej filmów