Oczyszczanie mysich komórek mejotycznych za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest natychmiastowe i wysokiej czystości oczyszczenie szerokiej gamy komórek mitycznych z dorosłych jąder myszy w celu zbadania dynamicznych procesów zachodzących podczas tego wyjątkowego cyklu komórkowego. Osiąga się to poprzez skuteczną dysocjację komórek jąder za pomocą serii enzymatycznych trawień z kolagenazą i trypsyną w obecności DNA. Jednym z nich jest uzyskanie zawiesiny jednokomórkowej jako drugi krok.

Zawiesina jest barwiona fluorescencyjnym barwnikiem DNA Hulka 3 33 42, który pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek miotycznych na podstawie ich zawartości i gęstości DNA. Następnie komórki miotyczne są analizowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu zidentyfikowania i oczyszczenia wszystkich niezbędnych frakcji do dalszej analizy, takiej jak analiza cytogenetyczna lub analiza ekspresji genów. Uzyskano wyniki, które wskazują na skuteczne oczyszczanie trudnych do uzyskania populacji komórek miotycznych o wysokiej czystości w oparciu o kompleksowe badania cytogenetyczne i macierze ekspresji.

Główną zaletą tego opartego na faktach protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sedymentacja odśrodkowa, literacja lub sedymentacja grawitacyjna, jest to, że pozwala on na zebranie maksymalnie jednej frakcji miotycznej o bardzo wysokiej czystości. Osoby, które nie znają tej metody, będą musiały połączyć bardzo różne zestawy umiejętności, aby przeprowadzić skuteczny test, dysocjację i pozycję, a następnie optymalne sortowanie komórek, dobre interakcje między osobą przygotowującą komórki a operatorem cytometrii przepływowej, a także dobre zrozumienie podstaw tego protokołu, które są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Protokół dysocjacji komórek zademonstruje dr I Gatun, starszy doktor habilitowany w naszym laboratorium, który znacznie ulepszył ten protokół.

BVN Tores. Nasz operator cytometrii przepływowej przeprowadzi Cię przez optymalną konfigurację do wydajnego sortowania komórek. W tym protokole zostanie wykazana dysocjacja dwóch jąder dorosłych myszy, jednak objętości można odpowiednio dostosować dla młodych osobników lub dla dodatkowych jąder.

Na początek trzy mililitry zbilansowanego roztworu soli zawierającego 120 jednostek na mililitr kolagenazy wpisz jeden do probówki Wydajne, smaczne skojarzenie ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego barwienia i problemów z uciekaniem się komórek. Dodanie wystarczającej ilości G nase, a także umieszczenie rurki w pozycji poziomej podczas mieszania, jest bardzo ważne dla skutecznej dysocjacji testu. Umieść jedno zamknięte jądro w 15-mililitrowej probówce.

Dodaj 10 mikrolitrów DNA jeden do jądra i energicznie potrząsaj probówką ręcznie, aż zobaczysz, że kanalik jądra zaczyna się dysocjować W następnym miejscu i zabezpiecz probówkę poziomo na obracającej się wytrząsarce i mieszaj probówkę maksymalnie 120 obr./min przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza po 15 minutach, Dekantować przez jedną minutę pionowo w temperaturze pokojowej. Następnie użyj jednorazowej pipety, aby wyrzucić supernatant. Do próbki dodać trzy mililitry zbilansowanego roztworu soli zawierającego kolagenazę typu pierwszego, a także 10 mikrolitrów D nase one.

Ponownie potrząśnij rurką kilka razy ręcznie. Mieszać probówkę poziomo z maksymalną prędkością 120 obr./min przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza, tak jak poprzednio, zdekantować przez jedną minutę pionowo w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 2,5 mililitra GBSS zawierającego kolagenazę.

Wpisz jeden 50 mikrolitrów trypsyny i 10 mikrolitrów dazy. Jeden raz odwróć rurkę, mieszaj poziomo z maksymalną prędkością 120 obr./min przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po 15-minutowym mieszaniu użyj jednorazowej plastikowej pipety obok z szerokim otworem, aby delikatnie pipetować próbkę w górę iw dół przez trzy minuty.

W tym miejscu nie powinny być widoczne żadne grudki. Następnie dodaj 30 mikrolitrów trypsyny, 10 mikrolitrów DNA jeden i 40 mikrolitrów Hulks 3 33 42 zawieszonych w DMSO. Odwróć rurkę kilka razy.

Mieszać poziomo z maksymalną prędkością 120 obr./min przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po zakończeniu mieszania próbki dodaj 400 mikrolitrów surowicy płodu cielęcego i wymieszaj, odwracając probówkę, aby dezaktywować trypsynę. Aby wykonać końcowe barwienie, dodaj 50 mikrolitrów mistyfikacji 3 33 42 i 10 mikrolitrów DNA.

Ponownie mieszaj rurkę poziomo z maksymalną prędkością 120 obr./min przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Zdysocjowana próbka jądra jest następnie przepuszczana przez dwa jednorazowe filtry o grubości 40 mikronów wstępnie połączone z GBSS na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Dodać pięć mikrolitrów roztworu jodku propydyny do próbki i delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując jednorazową pipetą do pasty.

Następnie przenieś próbkę do pięciomililitrowej plastikowej strzykawki przez igłę o rozmiarze 18. Następnie zastąp igłę o rozmiarze 18 igłą o rozmiarze 22 w celu dostarczenia próbki. Na koniec należy przechowywać strzykawkę na lodzie i chronić ją przed światłem do czasu, gdy próbka będzie gotowa do przetworzenia faksem.

W tym eksperymencie sortowanie komórek jest przeprowadzane na obszarze Backin Dixon. Po drugie, warunki sortowania komórek zostały dostosowane do tych stosowanych wcześniej dla cytometru przepływowego wyposażonego w ultrafioletowy laser argonowy o długości 360 nanometrów i laser argonowy o długości 488 nanometrów. Ostatecznie konfiguracja cytometru przepływowego będzie musiała zostać zoptymalizowana przez operatora sortera komórek.

Ponieważ Becton Dixon Aria two U nie jest wyposażony w laser UV, protokół wykrywania barwienia jastrzębia jest dostosowany przy użyciu fioletowego lasera o długości 405 nanometrów. Hooks jest wzbudzany przez fioletowy laser o długości 405 nanometrów, a niebieski laser o długości 488 nanometrów jest używany zarówno do wzbudzenia PI, jak i wykrywania rozproszenia do przodu i na boki. Ponadto filtry do wykrywania hos zostały zmodyfikowane w celu ograniczenia nieszczelności czerwonego lasera, co skutkuje poprawą ostrości wykresu punktowego.

Fioletowy laser jest skonfigurowany z pasmem 4 50 40 nanometrów do wykrywania fałszywej emisji niebieskiej i 5 85 42 nanometry pasma do fałszywej emisji czerwonej. Przejście o długości 5 0 2 nanometrów służy do oddzielenia fluorescencji niebieskiej od czerwonej. Różnica w stosunku do używania dwóch różnych zestawów filtrów jest pokazana tutaj.

Filtr 5 85 42 nanometrowy daje bardziej zwarte populacje komórek niż filtr 6 30 30 nanometrów. Dlatego operator powinien być gotowy do wypróbowania różnych kombinacji na własnym instrumencie, aby uzyskać najlepszy kompromis. Używana jest dysza o średnicy 100 mikronów z częstotliwością napędu kropli 28 000 kropli na sekundę.

Częstotliwość progowa próbkowania wynosi około 4 000 zdarzeń na sekundę z natężeniem przepływu od jednego do trzech, aby zachować większą rozdzielczość. Sortować próbkę w porcjach o objętości około 750 mikrolitrów dozowanych ze strzykawki Podczas tych przerw należy przechowywać pozostałą próbkę w strzykawce na lodzie i chronić przed światłem. Zbierz posortowane próbki do szklanych probówek zbiorczych o wymiarach 12 na 75 milimetrów, zawierających 250 mikrolitrów DMEM uzupełnionych 10% FCS.

Aby utrzymać próbkę w probówkach zbiorczych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy użyć opcji kontroli temperatury przez cały czas trwania sortowania. Dodatkowo należy użyć funkcji mieszania próbki przy 200 obr./min, aby zapobiec osadzaniu się próbki podczas sortowania. Za każdym razem, gdy dodawana jest podwielokrotność próbki głównej, ważne jest, aby przesunąć probówki w celu zachowania integralności pobranych komórek.

Reprezentatywne profile faktów są pokazane tutaj, gdzie wszystkie główne etapy mejozy typu dzikiego są identyfikowane na tym wykresie punktowym, na którym wskazane są bramkowane komórki, w dorosłych jądrach znajduje się duża ilość szczątków zawierających głównie puste błony i ogony plemników. Reprezentatywny wykres jodku propidyny wykazuje bardzo ograniczoną ilość komórek dodatnich jodku propidyny obecnych w próbce. Typowy chód jest wskazany w tym reprezentatywnym profilu faksu typu dzikiego 3 33 42.

Różne populacje komórek mięśniowych, które można oczyścić za pomocą tej metody w celu dalszych badań, są wskazane spermatogonia, pre leptyna, leptyna, zygoty, pacu, diploten i okrągły sperat. Te dwa ostatnie profile faktów pochodzą z jądra SPO 11 N i jądra typu dzikiego od 13-dniowych myszy. SPO 11 jest endonukleazą miotyczną, która kieruje nicią dubletową i przerywa swoje miejsca hotspotów rekombinacji miotycznej, a jak zaobserwowano tutaj, brak SPO O 11 powoduje wyraźną awarię miotyczną, ponieważ nie można wykryć etapu poza zygotą leptyny we wczesnym PACU.

Natomiast profil 13-dniowego samca myszy typu dzikiego wykazuje wysokie stężenie komórek zygoty leptyny. Ta pierwsza fala miozy jest raczej asynchroniczna, jak wyraźnie widać. Korzystanie z tej metodologii Podczas wykonywania tego eksperymentu ważne jest, aby użyć wystarczającej ilości DNA.

Centrum miasta dla bezproblemowego sortowania. Chociaż badacze początkowo niechętnie go używają, dodanie DNA zmniejszy lepkość próbki i poprawi separację i barwienie komórek, poza tym nienaruszone komórki nie zostaną uszkodzone. Metoda FOX do oznaczania komórek matycznych może być stosowana w szerokim zakresie dalszych zastosowań, takich jak na przykład ekstrakcja D-N-A-R-N-A w celu zbadania dynamiki ekspresji genów lub w technice immunoprecypitacji chromatyny w celu ustalenia różnych profilowań epigenetycznych.