Name: Oczyszczanie mysich komórek mejotycznych za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania żywych komórek mejotycznych z jąder myszy za pomocą cytometrii przepływowej FACS. Technika ta umożliwia badanie dynamiki cyklu komórkowego i ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był częściowo finansowany ze środków stanu Floryda przekazanych dla Scripps oraz z grantów o numerach R01GM085079 i R21HD061304 przyznanych odpowiednio przez National Institute of General Medical Sciences oraz National Institute of Child Health and Human Development. Jest to manuskrypt numer 20917 z The Scripps Research Institute.

Niniejszy protokół można podzielić na dwa główne etapy: (1) dysocjację i barwienie komórek jądra myszy barwnikiem Hoechst 342, a następnie, w razie potrzeby, (2) sortowanie metodą FACS odpowiednich frakcji meiotycznych, obejmujących wszystkie stadia mejozy, od komórek zarodkowych po okrągłe spermatydy. Po zebraniu te wysoce wzbogacone populacje meiotyczne mogą być wykorzystane do szerokiego zakresu analiz. Protokół ten opisuje dysocjację jednego jądra dorosłego osobnika; objętości można odpowiednio dostosować dla osobników młodych lub dla dodatkowych jąder.
1. Dysocjacja jąder
<ol>
	<li>Umieść jeden odkapsułowany jądro w probówce 15-ml.</li>
	<li>Dodaj 3-ml soli Gey's Balance Salt Solution (GBSS) zawierającej 120 U/ml kolagenazy typu I.</li>
	<li>Dodaj 10 μl DNAzy I (roztwór stok 1mg/ml w 50% glicerolu) i energicznie potrząśnij ręcznie, aż zauważysz dysocjację kanalików jawych.</li>
	<li>Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 33°C.</li>
	<li>Wirować przez 1 min pionowo w temperaturze pokojowej i odlać nadosad.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1.2 do 1.5.</li>
	<li>Dodaj 2,5 ml GBSS zawierającego kolagenazę typu I, 50 μl roztworu stoku trypsyny 50mg/ml resuspendowanej w 1mM HCl oraz 10 μl DNAzy I (1mg/ml), a następnie kilkakrotnie odwróć probówkę.</li>
	<li>Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 3°C.</li>
	<li>Używając jednorazowej plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, delikatnie pipetuj w górę i w dół przez 3 min. Na tym etapie nie powinny być widoczne żadne grudki.</li>
	<li>Dodaj 30 μl trypsyny, 10 μl DNAzy I, 40 μl Hoechst 342 resuspendowanego w DMSO (10 mg/ml) i kilkakrotnie odwróć probówkę.</li>
	<li>Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 33°C.</li>
	<li>Dodaj 40-μl płodowej surowicy cielęcej (FCS) i wymieszaj poprzez odwracanie w celu inaktywacji trypsyny.</li>
	<li>Ostateczne barwienie przeprowadza się poprzez dodanie 50 μl Hoechst 342 resuspendowanego w DMSO (10 mg/ml) oraz 10 μl DNAzy I (1 mg/ml).</li>
	<li>Mieszaj poziomo przy maksymalnej prędkości 120 rpm przez 15 min w temperaturze 33°C.</li>
	<li>Dysocjowaną próbkę jądra przepuszcza się przez dwa jednorazowe filtry 40-μm zwilżone GBSS do probówki stożkowej 50-ml, następnie dodaje 5 μl roztworu jodku propidyny (PI) i delikatnie miesza próbkę, pipetując kilkakrotnie jednorazową pipetą Pasteura.</li>
	<li>Próbkę przenosi się do plastikowej strzykawki 5-ml przez igłę 18G. Tę ostatnią zastępuje się igłą 2G w celu podania próbki. Strzykawkę przechowuje się na lodzie i chroni przed światłem do momentu analizy FACS.</li>
</ol>
2. Konfiguracja FACS i oczyszczanie
<ol>
	<li>Sortowanie przeprowadzono na sorterze komórek Becton-Dickinson Aria IIu. Opisane warunki powinny zatem służyć jako punkt wyjścia, szczególnie w przypadku korzystania z innego sprzętu. Zastosowano warunki opisane wcześniej7,8.</li>
	<li>Ponieważ Aria IIu nie posiada lasera UV, dostosowano protokół detekcji barwienia Hoescht, wykorzystując fioletowy laser 405nm; dodatkowo zastosowano niebieski laser 48nm do detekcji rozpraszania przedniego i bocznego. Ponadto zmodyfikowano niektóre filtry w celu ograniczenia prześwitu lasera czerwonego, co pozwoliło na uzyskanie większej ostrości wykresów rozproszenia.</li>
	<li>Laser fioletowy skonfigurowano z filtrem przepustowym 450/40nm do detekcji emisji Hoescht Blue oraz filtrem przepustowym 585/42nm dla emisji Hoescht Red. Do oddzielenia fluorescencji niebieskiej od czerwonej użyto filtra długoprzepustowego 502nm.</li>
	<li>Użyto dyszy 100 μm przy częstotliwości generowania kropli 28 0 kropli/sekundę. Szybkość progu próbek wynosiła około 40 zdarzeń/sekundę. Opcję kontroli temperatury wykorzystano do utrzymania próbek i probówek odbiorczych w 4°C przez cały czas trwania sortowania. Dodatkowo zastosowano funkcję mieszania próbek przy 20 rpm, aby zapobiec sedymentacji próbki podczas sortowania.</li>
	<li>Zazwyczaj w ciągu 6-godzinnego sortowania przetwarzano od dwóch do trzech jąder, co pozwalało na zebranie 0,5- 2,0x106 komórek dla każdej populacji (patrz sekcja reprezentatywna).</li>
	<li>Próbkę sortowano w aliquotach około 750μl dozowanych ze strzykawki. W czasie tych przerw probówki odbiorcze były przechowywane w 4°C, chronione przed światłem i delikatnie mieszane przed wznowieniem sortowania.</li>
	<li>Posortowane próbki zbierano do borokrzemianowych szklanych probówek odbiorczych 12x75mm zawierających 250μl DMEM uzupełnionego o 10% FCS.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Typowy profil FACS przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie główne etapy mejozy zostały zidentyfikowane i wskazane w legendzie. Jeśli barwienie Hoechst 342 nie jest optymalne, profil ogólny będzie wydawał się znacznie bardziej zwarty i mniej wyraźny. Częstym problemem jest niedostateczna ilość dodanego DNAse, co prowadzi do szybkiego zlepiania się komórek. Dodanie dodatkowej ilości DNAse na wszystkich wskazanych etapach zazwyczaj rozwiązuje ten problem. Należy minimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania zapasu DNAse (przechowywanego w -20°C), ponieważ prowadzi to do szybkiej utraty aktywności enzymatycznej.
Spo1 to meiotyczna endonukleaza odpowiedzialna za wprowadzanie pęknięć dwuniciowych w miejscach tzw. hotspotów rekombinacji meiotycznej12.Rysunek 2 przedstawia typowe profile jądra z brakiem genu Spo1, w którym nie powstają pęknięcia dwuniciowe, co prowadzi do przerwania procesu mejozy12, a także profil przedpokwitowy 13-dniowej myszy, wykazujący asynchroniczny charakter tej pierwszej fali mejozy. Standardowe analizy cytogenetyczne z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białku kompleksu synaptonemalnego 3 (SCP3) oraz fosforylowanej histonie H2AX jako markerów specyficznych dla poszczególnych etapów mejozy powinny zostać początkowo zastosowane w celu potwierdzenia czystości i charakteru posortowanych komórek meiotycznych, zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu1.
<img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej; rozkład komórek na wykresach FSC, SSC i HOECHST; wizualizacja analizy danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Profile FACS mejozy typu dzikiego. A) Przedstawiono reprezentatywny wykres rozrzutu. Pokazano wyselekcjonowane bramką komórki. Należy zwrócić uwagę na dużą ilość obecnych w jądrach dorosłych samców zanieczyszczeń, składających się głównie z pustych błon i ogonków spermatyd. B) Reprezentatywny wykres PI pokazuje bardzo ograniczoną liczbę komórek PI-dodatnich obecnych w próbce. Przedstawiono typową bramkę. C) Przedstawiono reprezentatywny profil FACS dla Hoechst 3342 typu dzikiego. Wskazano poszczególne populacje komórek meiotycznych, które można oczyścić za pomocą tej metody do dalszych badań: spermatogonia (Sp), preleptoten (pL), leptoten-zygoten (L/Z), wczesny pachiten (eP), środkowy pachiten (mP), późny pachiten (lP), diploten (D) oraz okrągłe spermatydy (RS).
<img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej przedstawiający intensywność barwienia Hoechst blue w stosunku do red, służący do analizy zawartości DNA w komórkach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Spo1-null i profil FACS mejozy w 13. dniu dla typu dzikiego. A) Typowy Spo1-profil wykazuje wyraźną niewydolność mejozy, w której nie można wykryć żadnego etapu poza leptotenem/zygotenem i wczesnym pachytenem. B) Profil 13-dniowego samca myszy typu dzikiego wykazuje wysoką koncentrację komórek w stadium leptotenu/zygotenu. Ta pierwsza fala mejozy jest raczej asynchroniczna, co zostało wyraźnie zobrazowane przy użyciu tej metodologii.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na jednoczesne oczyszczanie z dorosłych samców myszy pełnego zakresu komórek w różnych stadiach mejozy z bardzo wysoką czystością, co umożliwia badaczom analizę dynamiki tego podstawowego procesu. Oczyszczone komórki mogą być wykorzystywane w licznych zastosowaniach, od ekstrakcji RNA9,10, mapowania nukleosomów11, detekcji cząsteczek rekombinowanych, analiz białek i wielu innych. Metody detekcji muszą być jednak dostosowane do ilości oczyszczonych komórek mejozy....

<table><tbody><tr><td>Kollagenaza typu 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>Rozpuścić do stężenia 12 000 U/ml w GBSS, przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>Rozpuścić w 1 mM HCl do stężenia 50 mg/ml, przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Roztwór nasycony (10 mg/ml w DMSO, przechowywać w 4°C)&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>Rozpuścić w wodzie/50% glicerolu do stężenia 1 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot; Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Heterogeniczność typów komórek w jądrach oraz brak modeli kultur komórek meiotycznych stanowiły istotne przeszkody w badaniu unikalnych programów różnicowania, które przejawiają się podczas mejozy. Opracowano dwie główne metody oczyszczania, w różnym stopniu, poszczególnych frakcji meiotycznych zarówno u zwierząt dorosłych, jak i niedojrzałych: elutriację lub Staput (sedymentację) z wykorzystaniem gradientów BSA i/lub percollu. Obie te metody opierają się na wielkości i gęstości komórek w celu oddzielenia komórek meiotycznych1-5. Ogólnie rzecz biorąc, z wyjątkiem kilku populacji komórkowych6, protokoły te nie pozwalają na uzyskanie wystarczającej czystości licznych populacji komórek meiotycznych niezbędnych do szczegółowych analiz molekularnych. Co więcej, przy zastosowaniu takich metod zazwyczaj w danym czasie można oczyścić tylko jeden typ komórek meiotycznych, co zwiększa poziom złożoności w zakresie powtarzalności i homogeniczności podczas porównywania próbek komórek meiotycznych.
W niniejszej pracy opisujemy udoskonaloną metodę, która pozwala na łatwą wizualizację, identyfikację i oczyszczanie komórek meiotycznych – od komórek linii zarodkowej po okrągłe spermatydy – z wykorzystaniem FACS w połączeniu z barwieniem Hoechst 333427,8. Metoda ta umożliwia uzyskanie ogólnego obrazu całego procesu mejozy oraz pozwala na wysoką puryfikację żywych komórek z większości etapów mejozy. Oczyszczone w ten sposób komórki mogą być następnie szczegółowo analizowane pod kątem zmian molekularnych towarzyszących przebiegowi mejozy, na przykład zmian w ekspresji genów9,10 oraz dynamiki zajmowania nukleosomów w punktach gorących (hotspots) rekombinacji meiotycznej11.

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Heterogeniczność typów komórek w jądrze oraz brak modeli hodowli komórek meiotycznych stanowiły znaczące przeszkody w badaniu ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest jednoczesne i wysokiej czystości oczyszczenie szerokiego zakresu komórek mitotycznych z dorosłych jąder myszy, aby móc badać dynamiczne procesy zachodzące podczas tego wyjątkowego cyklu komórkowego. Osiąga się to poprzez wydajną dysocjację komórek jąder za pomocą serii trawień enzymatycznych kolagenazą i trypsyną w obecności dna. Pierwszym krokiem jest uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek jądra.Zawiesinę testową barwi się fluorescencyjnym barwnikiem do żywego DNA Hulk's 3 33 42, co pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek mitotycznych na podstawie zawartości i gęstości DNA. Następnie komórki mitotyczne są analizowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) w celu identyfikacji i oczyszczenia wszystkich frakcji niezbędnych do dalszych analiz, takich jak analizy cytogenetyczne lub analiza ekspresji genów. Uzyskane wyniki wykazują efektywne oczyszczanie trudnych do pozyskania populacji komórek mitotycznych przy wysokiej czystości, co potwierdzono w kompleksowych badaniach cytogenetycznych i analizach mikromacierzy ekspresyjnych.Główną zaletą niniejszego protokołu opartego na faktach w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie, literacja czy sedymentacja grawitacyjna, jest możliwość zebrania największej liczby frakcji mitotycznych o bardzo wysokiej czystości. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą musiały połączyć bardzo różne zestawy umiejętności, aby przeprowadzić efektywną dysocjację tkanki i inkubację, a następnie optymalne sortowanie komórek; wymagana jest dobra współpraca między osobą przygotowującą komórki a operatorem cytometrii przepływowej, a także dobre zrozumienie podstaw tego protokołu, które są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Protokół dysocjacji komórek zaprezentuje dr I. Gatun, starszy postdoc w naszym laboratorium, który znacznie udoskonalił tę metodę.BVN Tores. Nasz operator cytometrii przepływowej przeprowadzi Państwa przez optymalną konfigurację w celu wydajnego sortowania komórek. W niniejszym protokole zaprezentowano dysocjację dwóch jąder dorosłych myszy, jednak objętości można odpowiednio dostosować dla osobników młodszych lub dla większej liczby jąder.Zacznij od dodania trzech mililitrów zrównoważonego roztworu soli gaze do probówki, zawierającego 120 jednostek na mililitr kolagenazy typu jeden. Efektywna dysocjacja tkanki jest kluczowa dla prawidłowego barwienia i sortowania komórek. Dodanie odpowiedniej ilości kolagenazy jeden oraz umieszczenie probówki w pozycji poziomej podczas wytrząsania są niezbędne dla efektywnej dysocjacji tkanki. Umieść jeden enkapsulowany jądrze w probówce o pojemności 15 mililitrów.Dodaj 10 µL DNazy I do jąder i energicznie potrząśnij probówką ręcznie, aż zauważysz początek dysocjacji kanalików jawodialowych. Następnie umieść i zabezpiecz probówkę poziomo na wytrząsace rotacyjnej i inkubuj przy maksymalnej prędkości 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 °C. Po 15 minutach odwiruj próbkę przez jedną minutę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą jednorazowej pipety odlej nadsącz. Do próbki dodaj 3 mL zrównoważonego roztworu soli GBS zawierającego kolagenazę typu I oraz 10 µL DNazy I.Ponownie potrząśnij probówką kilka razy ręcznie. Agituj probówkę w płaszczyźnie poziomej z prędkością maksymalną 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza, tak jak wcześniej, następnie przelej zawartość pionowo przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odrzuć nadsącz. Następnie dodaj 2,5 mililitrów GBSS zawierającego kolagenazę.Należy nanieść 50 µL trypsyny i 10 µL dase. Następnie probówkę należy kilkakrotnie odwrócić i inkubować w mieszadle poziomym przy maksymalnej prędkości 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 °C. Po 15-minutowym mieszaniu, przy użyciu jednorazowej plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, należy delikatnie pipetować próbkę w górę i w dół przez trzy minuty.Na tym etapie nie powinny być widoczne żadne grudki. Następnie należy dodać 30 µL trypsyny, 10 µL DNAs one oraz 40 µL Hulks 3 33 42 resuspendsowanych w DMSO. Kilka razy odwrócić probówkę.Mieszaj w poziomie przy maksymalnej prędkości 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po zakończeniu mieszania próbki dodaj 400 µL płodowej surowicy cielęcej i wymieszaj, odwracając probówkę, aby inaktywować trypsynę. W celu przeprowadzenia końcowego barwienia dodaj 50 µL hoax 3 33 42 oraz 10 µL DNAs.Ponownie agituj probówkę w płaszczyźnie poziomej z prędkością maksymalną 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Próbkę dysocjowanego jądra przepuść następnie przez dwa jednorazowe filtry o oczkach 40 mikron, uprzednio zwilżone GBSS, do 50 mililitrowej probówki stożkowej. Do próbki dodaj pięć mikrolitrów roztworu jodku propidynyum i wymieszaj delikatnie, pipetując kilka razy za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.Następnie przenieś próbkę do plastikowej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów za pomocą igły 18 G. Potem zastąp igłę 18 G igłą 22 G w celu podania próbki. Na koniec przechowuj strzykawkę w lodzie i chroń ją przed światłem do momentu, aż próbka będzie gotowa do obróbki fax.W tym doświadczeniu sortowanie komórek przeprowadzono w obszarze Backin Dixon. Warunki sortowania komórek dostosowano do parametrów stosowanych wcześniej dla cytometru przepływowego wyposażonego w laser ultrafioletowy argonowy o długości fali 360 nanometrów oraz laser argonowy o długości fali 488 nanometrów. Ostatecznie ustawienia cytometru przepływowego będą musiały zostać zoptymalizowane przez operatora sortownika komórek.Ponieważ aparat Becton Dixon Aria two U nie posiada lasera UV, protokół wykrywania barwienia Hoechst został dostosowany z wykorzystaniem fioletowego lasera o długości fali 405 nanometrów. Barwnik Hoechst jest wzbudzany przez fioletowy laser 405 nanometrów, natomiast niebieski laser 488 nanometrów służy zarówno do wzbudzenia PI, jak i do detekcji rozproszonego światła w przód (forward scatter) oraz w bok (side scatter). Dodatkowo zmodyfikowano filtry do detekcji Hoechst, aby ograniczyć przedostawanie się światła czerwonego lasera, co skutkuje zwiększoną ostrością wykresów rozrzutu.Laser fioletowy jest skonfigurowany z filtrem pasmowym 450/40 nm do detekcji fałszywej emisji niebieskiej oraz filtrem pasmowym 585/42 nm do fałszywej emisji czerwonej. Filtr długoprzepustowy 502 nm jest wykorzystywany do oddzielenia fluorescencji niebieskiej od czerwonej. Tutaj pokazano różnicę wynikającą z zastosowania dwóch różnych zestawów filtrów.Filtr 5 85 42 nanometr daje bardziej zwarte populacje komórek niż filtr 6 30 30 nanometr. Dlatego operator powinien być przygotowany do przetestowania różnych kombinacji na własnym urządzeniu, aby uzyskać optymalny kompromis. Do aplikacji wykorzystuje się dyszę 100 mikron przy częstotliwości dozowania kropel wynoszącej 28 000 kropel na sekundę.Próg rejestracji zdarzeń dla próbki wynosi około 4 000 zdarzeń na sekundę przy przepływie od jednego do trzech w celu zachowania wyższej rozdzielczości. Sortuj próbkę w alikwotach o objętości około 750 µL dozowanych ze strzykawki. Podczas tych przerw pozostałą w strzykawce próbkę należy przechowywać w lodzie i chronić przed światłem. Posortowane próbki zbieraj do szklanych probówek typu borisy o wymiarach 12 × 75 mm zawierających 250 µL DMEM uzupełnionego o 10% FCS.Aby utrzymać próbkę w probówkach zbiorczych w temperaturze 4 °C, należy przez cały czas trwania sortowania korzystać z opcji kontroli temperatury. Dodatkowo należy użyć funkcji mieszania próbki z prędkością 200 RPM, aby zapobiec sedymentacji próbki podczas sortowania. Przy każdym dodaniu aalikwoty z próbki głównej ważne jest również lekkie potrząśnięcie probówkami zbiorczymi w celu zachowania integralności zebranych komórek.Tutaj przedstawiono reprezentatywne profile faktów, w których zidentyfikowano wszystkie główne etapy mejozy typu dzikiego na tym wykresie rozproszenia, gdzie zaznaczono bramkowane komórki; w jądrach dorosłych osobników obecna jest duża ilość zanieczyszczeń zawierających głównie puste membrany i ogonki plemników. Reprezentatywny wykres jodku propidyny pokazuje bardzo ograniczoną liczbę komórek dodatnich pod względem jodku propidyny obecnych w próbce. Typowy bramkujący obszar jest wskazany na tym reprezentatywnym profilu hoax 3 33 42 fax typu dzikiego.Różne populacje komórek meiotycznych, które można oczyścić za pomocą tej metody do dalszych badań, to spermatogonia, stadium preleptyczne, stadium lektyczne, zygoteny, pachyteny, diploteny oraz plemnutocyty okrągłe. Te dwa ostatnie profile pochodzą z jąder myszy SPO11-N oraz myszy typu dzikiego w wieku 13 dni. SPO11 to endonukleaza meiotyczna, która kieruje pęknięciami dwuniciowymi w miejscach gorących rekombinacji meiotycznej; jak zaobserwowano w tym przypadku, brak SPO11 prowadzi do wyraźnej niewydolności meiotycznej, ponieważ nie można wykryć żadnego stadium powyżej lektycy, zygoteny i wczesnej pachyteny.W przeciwieństwie do tego, profil 13-dniowego samca myszy typu dzikiego wykazuje wysoką koncentrację zygotycznych komórek leptynowych. Ta pierwsza fala mejozy jest raczej asynchroniczna, co zostało wyraźnie zwizualizowane. Podczas przeprowadzania tego eksperizmu z zastosowaniem tej metodologii ważne jest użycie odpowiedniej ilości DNA.Ośrodek miejski zapewniający bezproblemową sortowanie. Chociaż badacze początkowo niechętnie go stosują, dodatek DNA zmniejszy lepkość próbki i poprawi separację oraz barwienie komórek, a jednocześnie nienaruszone komórki nie zostaną uszkodzone. Metoda FOX do izolacji komórek somatycznych może być wykorzystywana w szerokim zakresie zastosowań w dalszych etapach analiz, takich jak na przykład ekstrakcja DNA/RNA w celu badania dynamiki ekspresji genów lub technika immunoprecypitacji chromatyny do opracowania różnych profili epigenetycznych.

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cytometria przepływowa Oczyszczanie komórek mejotycznych myszy

W celu oczyszczenia zygot S. cerevisiae, zmodyfikowano komórki haploidalne o przeciwnych typach matingowych tak, aby wykazywały ekspresję czerwonych lub zielonych białek fluorescencyjnych, a następnie poddano je wspólnej inkubacji w celu umożliwienia tworzenia zygot i frakcjonowania zgodnie z protokołem opartym na cytometrii przepływowej. Wysoce wzbogacona frakcja umożliwia późniejsze badania „omiczne”, odzyskanie początkowego potomstwa oraz systematyczne badanie morfogenezy zygot.

Oczyszczanie zygot S. cerevisiae metodą cytometrii przepływowej

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Opisujemy strategię sortowania plemników myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Spermatydy są podzielone na cztery wysoce czyste populacje, w tym okrągłe (etapy spermiogenezy 1-9), wczesne wydłużające się (etapy spermiogenezy 10-12), późne wydłużające się (etapy spermiogenezy 13-14) i wydłużone spermioidy (etapy spermiogenezy 15-16). Barwienie DNA, wielkość i ziarnistość są wykorzystywane jako parametry selekcji.

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Poznaj metodę oczyszczania żywych komórek mejotycznych z jąder myszy za pomocą cytometrii przepływowej FACS. Technika ta umożliwia badanie dynamiki cyklu komórkowego i ekspresji genów.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów