Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest jednoczesne i wysokiej czystości oczyszczenie szerokiego zakresu komórek mitotycznych z dorosłych jąder myszy, aby móc badać dynamiczne procesy zachodzące podczas tego wyjątkowego cyklu komórkowego. Osiąga się to poprzez wydajną dysocjację komórek jąder za pomocą serii trawień enzymatycznych kolagenazą i trypsyną w obecności dna. Pierwszym krokiem jest uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek jądra.

Zawiesinę testową barwi się fluorescencyjnym barwnikiem do żywego DNA Hulk's 3 33 42, co pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek mitotycznych na podstawie zawartości i gęstości DNA. Następnie komórki mitotyczne są analizowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) w celu identyfikacji i oczyszczenia wszystkich frakcji niezbędnych do dalszych analiz, takich jak analizy cytogenetyczne lub analiza ekspresji genów. Uzyskane wyniki wykazują efektywne oczyszczanie trudnych do pozyskania populacji komórek mitotycznych przy wysokiej czystości, co potwierdzono w kompleksowych badaniach cytogenetycznych i analizach mikromacierzy ekspresyjnych.

Główną zaletą niniejszego protokołu opartego na faktach w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie, literacja czy sedymentacja grawitacyjna, jest możliwość zebrania największej liczby frakcji mitotycznych o bardzo wysokiej czystości. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą musiały połączyć bardzo różne zestawy umiejętności, aby przeprowadzić efektywną dysocjację tkanki i inkubację, a następnie optymalne sortowanie komórek; wymagana jest dobra współpraca między osobą przygotowującą komórki a operatorem cytometrii przepływowej, a także dobre zrozumienie podstaw tego protokołu, które są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Protokół dysocjacji komórek zaprezentuje dr I. Gatun, starszy postdoc w naszym laboratorium, który znacznie udoskonalił tę metodę.

BVN Tores. Nasz operator cytometrii przepływowej przeprowadzi Państwa przez optymalną konfigurację w celu wydajnego sortowania komórek. W niniejszym protokole zaprezentowano dysocjację dwóch jąder dorosłych myszy, jednak objętości można odpowiednio dostosować dla osobników młodszych lub dla większej liczby jąder.

Zacznij od dodania trzech mililitrów zrównoważonego roztworu soli gaze do probówki, zawierającego 120 jednostek na mililitr kolagenazy typu jeden. Efektywna dysocjacja tkanki jest kluczowa dla prawidłowego barwienia i sortowania komórek. Dodanie odpowiedniej ilości kolagenazy jeden oraz umieszczenie probówki w pozycji poziomej podczas wytrząsania są niezbędne dla efektywnej dysocjacji tkanki. Umieść jeden enkapsulowany jądrze w probówce o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj 10 µL DNazy I do jąder i energicznie potrząśnij probówką ręcznie, aż zauważysz początek dysocjacji kanalików jawodialowych. Następnie umieść i zabezpiecz probówkę poziomo na wytrząsace rotacyjnej i inkubuj przy maksymalnej prędkości 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 °C. Po 15 minutach odwiruj próbkę przez jedną minutę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą jednorazowej pipety odlej nadsącz. Do próbki dodaj 3 mL zrównoważonego roztworu soli GBS zawierającego kolagenazę typu I oraz 10 µL DNazy I.

Ponownie potrząśnij probówką kilka razy ręcznie. Agituj probówkę w płaszczyźnie poziomej z prędkością maksymalną 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza, tak jak wcześniej, następnie przelej zawartość pionowo przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i odrzuć nadsącz. Następnie dodaj 2,5 mililitrów GBSS zawierającego kolagenazę.

Należy nanieść 50 µL trypsyny i 10 µL dase. Następnie probówkę należy kilkakrotnie odwrócić i inkubować w mieszadle poziomym przy maksymalnej prędkości 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 °C. Po 15-minutowym mieszaniu, przy użyciu jednorazowej plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem, należy delikatnie pipetować próbkę w górę i w dół przez trzy minuty.

Na tym etapie nie powinny być widoczne żadne grudki. Następnie należy dodać 30 µL trypsyny, 10 µL DNAs one oraz 40 µL Hulks 3 33 42 resuspendsowanych w DMSO. Kilka razy odwrócić probówkę.

Mieszaj w poziomie przy maksymalnej prędkości 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Po zakończeniu mieszania próbki dodaj 400 µL płodowej surowicy cielęcej i wymieszaj, odwracając probówkę, aby inaktywować trypsynę. W celu przeprowadzenia końcowego barwienia dodaj 50 µL hoax 3 33 42 oraz 10 µL DNAs.

Ponownie agituj probówkę w płaszczyźnie poziomej z prędkością maksymalną 120 RPM przez 15 minut w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Próbkę dysocjowanego jądra przepuść następnie przez dwa jednorazowe filtry o oczkach 40 mikron, uprzednio zwilżone GBSS, do 50 mililitrowej probówki stożkowej. Do próbki dodaj pięć mikrolitrów roztworu jodku propidynyum i wymieszaj delikatnie, pipetując kilka razy za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.

Następnie przenieś próbkę do plastikowej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów za pomocą igły 18 G. Potem zastąp igłę 18 G igłą 22 G w celu podania próbki. Na koniec przechowuj strzykawkę w lodzie i chroń ją przed światłem do momentu, aż próbka będzie gotowa do obróbki fax.

W tym doświadczeniu sortowanie komórek przeprowadzono w obszarze Backin Dixon. Warunki sortowania komórek dostosowano do parametrów stosowanych wcześniej dla cytometru przepływowego wyposażonego w laser ultrafioletowy argonowy o długości fali 360 nanometrów oraz laser argonowy o długości fali 488 nanometrów. Ostatecznie ustawienia cytometru przepływowego będą musiały zostać zoptymalizowane przez operatora sortownika komórek.

Ponieważ aparat Becton Dixon Aria two U nie posiada lasera UV, protokół wykrywania barwienia Hoechst został dostosowany z wykorzystaniem fioletowego lasera o długości fali 405 nanometrów. Barwnik Hoechst jest wzbudzany przez fioletowy laser 405 nanometrów, natomiast niebieski laser 488 nanometrów służy zarówno do wzbudzenia PI, jak i do detekcji rozproszonego światła w przód (forward scatter) oraz w bok (side scatter). Dodatkowo zmodyfikowano filtry do detekcji Hoechst, aby ograniczyć przedostawanie się światła czerwonego lasera, co skutkuje zwiększoną ostrością wykresów rozrzutu.

Laser fioletowy jest skonfigurowany z filtrem pasmowym 450/40 nm do detekcji fałszywej emisji niebieskiej oraz filtrem pasmowym 585/42 nm do fałszywej emisji czerwonej. Filtr długoprzepustowy 502 nm jest wykorzystywany do oddzielenia fluorescencji niebieskiej od czerwonej. Tutaj pokazano różnicę wynikającą z zastosowania dwóch różnych zestawów filtrów.

Filtr 5 85 42 nanometr daje bardziej zwarte populacje komórek niż filtr 6 30 30 nanometr. Dlatego operator powinien być przygotowany do przetestowania różnych kombinacji na własnym urządzeniu, aby uzyskać optymalny kompromis. Do aplikacji wykorzystuje się dyszę 100 mikron przy częstotliwości dozowania kropel wynoszącej 28 000 kropel na sekundę.

Próg rejestracji zdarzeń dla próbki wynosi około 4 000 zdarzeń na sekundę przy przepływie od jednego do trzech w celu zachowania wyższej rozdzielczości. Sortuj próbkę w alikwotach o objętości około 750 µL dozowanych ze strzykawki. Podczas tych przerw pozostałą w strzykawce próbkę należy przechowywać w lodzie i chronić przed światłem. Posortowane próbki zbieraj do szklanych probówek typu borisy o wymiarach 12 × 75 mm zawierających 250 µL DMEM uzupełnionego o 10% FCS.

Aby utrzymać próbkę w probówkach zbiorczych w temperaturze 4 °C, należy przez cały czas trwania sortowania korzystać z opcji kontroli temperatury. Dodatkowo należy użyć funkcji mieszania próbki z prędkością 200 RPM, aby zapobiec sedymentacji próbki podczas sortowania. Przy każdym dodaniu aalikwoty z próbki głównej ważne jest również lekkie potrząśnięcie probówkami zbiorczymi w celu zachowania integralności zebranych komórek.

Tutaj przedstawiono reprezentatywne profile faktów, w których zidentyfikowano wszystkie główne etapy mejozy typu dzikiego na tym wykresie rozproszenia, gdzie zaznaczono bramkowane komórki; w jądrach dorosłych osobników obecna jest duża ilość zanieczyszczeń zawierających głównie puste membrany i ogonki plemników. Reprezentatywny wykres jodku propidyny pokazuje bardzo ograniczoną liczbę komórek dodatnich pod względem jodku propidyny obecnych w próbce. Typowy bramkujący obszar jest wskazany na tym reprezentatywnym profilu hoax 3 33 42 fax typu dzikiego.

Różne populacje komórek meiotycznych, które można oczyścić za pomocą tej metody do dalszych badań, to spermatogonia, stadium preleptyczne, stadium lektyczne, zygoteny, pachyteny, diploteny oraz plemnutocyty okrągłe. Te dwa ostatnie profile pochodzą z jąder myszy SPO11-N oraz myszy typu dzikiego w wieku 13 dni. SPO11 to endonukleaza meiotyczna, która kieruje pęknięciami dwuniciowymi w miejscach gorących rekombinacji meiotycznej; jak zaobserwowano w tym przypadku, brak SPO11 prowadzi do wyraźnej niewydolności meiotycznej, ponieważ nie można wykryć żadnego stadium powyżej lektycy, zygoteny i wczesnej pachyteny.

W przeciwieństwie do tego, profil 13-dniowego samca myszy typu dzikiego wykazuje wysoką koncentrację zygotycznych komórek leptynowych. Ta pierwsza fala mejozy jest raczej asynchroniczna, co zostało wyraźnie zwizualizowane. Podczas przeprowadzania tego eksperizmu z zastosowaniem tej metodologii ważne jest użycie odpowiedniej ilości DNA.

Ośrodek miejski zapewniający bezproblemową sortowanie. Chociaż badacze początkowo niechętnie go stosują, dodatek DNA zmniejszy lepkość próbki i poprawi separację oraz barwienie komórek, a jednocześnie nienaruszone komórki nie zostaną uszkodzone. Metoda FOX do izolacji komórek somatycznych może być wykorzystywana w szerokim zakresie zastosowań w dalszych etapach analiz, takich jak na przykład ekstrakcja DNA/RNA w celu badania dynamiki ekspresji genów lub technika immunoprecypitacji chromatyny do opracowania różnych profili epigenetycznych.