Name: Konkurencyjne testy naprowadzające do badania migracji limfocytów T tropowych jelit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę konkurencyjnych testów naprowadzających do badania migracji limfocytów T tropowych jelit w mysim modelu. Technika umożliwia porównanie zdolności migracyjnych różnych podpopulacji komórek T w jednym organizmie gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EJV jest wspierany stypendium z The Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM jest wspierany grantami z CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) oraz NIH Director s New Innovator Award.

1. Generowanie ex vivo limfocytów T ukierunkowanych na jelita oraz kontrolnych limfocytów T (patrz Rysunek 1)
<ol>
	<li>Wyizolować splenocyty poprzez rozcieranie jednej śledziony pobranej od myszy typu dzikiego. Zawiesinę komórkową resuspender w PBS i wirować przez 5' przy 400 x g. Usunąć nadsącz i poddać erytrocyty lizie, resuspender pellet komórkowy w 4 ml buforu lizującego ACK na 2-3 minuty. Następnie dodać 5 ml PBS. Wirować przez 5' przy 400 x g i usunąć nadsącz.</li>
	<li>Resuspender całkowitą liczbę splenocytów w stężeniu 1 x 106/mL w pożywce IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-merkaptoetanolu + penicyliny/streptomycyny (pełna pożywka IMDM). Podzielić komórki na dwie grupy, z czego jedna zostanie uzupełniona o RA (lub syntetyczne agoniści RAR, takie jak Am80 lub Am580) do stężenia końcowego 100-200 nM 3. Limfocyty T aktywowane w obecności RA lub agonistów RAR będą wykazywać nadekspresję a4b7 oraz CCR9 i przekształcą się w limfocyty T o tropizmie jelitowym, natomiast limfocyty T aktywowane bez RA będą stanowić grupę kontrolną.</li>
	<li>Do każdego dołka płytki 24-dołkowej, uprzednio pokrytej przeciwciałami anty-CD3 (10 mg/ml) i anty-CD28 (10 mg/ml), dodać 1,5-2,0 mL zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 37°C w 5% CO2 (w celu pokrycia płytki dodać 500 ml/dołek anty-CD3 oraz anty-CD28 w PBS i inkubować przez 2 godziny w 37˚C, a następnie przemyć dwukrotnie 2 ml PBS).</li>
	<li>Aby uniknąć nadmiernej stymulacji limfocytów T, po 2-3 dniach przenieść zawiesiny komórkowe do nowej, niepokrytej płytki 24-dołkowej. Inkubować przez kolejne 2-3 dni. W zależności od gęstości komórek i proliferacji pożywka może zakwasić się (zmienić kolor na żółty), w takim przypadku może być konieczne zastąpienie połowy pożywki świeżą pełną pożywką IMDM. Zebrać komórki po 4-5 dniach (licząc od dnia 0).</li>
	<li>Typowa końcowa wydajność wynosi 1-2 x 106 efektorowych limfocytów T na dołek. W związku z tym, aby uzyskać 10-20 x 106 limfocytów T na każdą warunek, należy wysiać minimum 9-12 dołków limfocytów T o tropizmie jelitowym oraz 9-12 dołków limfocytów T kontrolnych.</li>
</ol>
2. Analiza receptorów homingu jelitowego na aktywowanych limfocytach T
Po 4-5 dniach hodowli powinniśmy zaobserwować wysoką ekspresję receptorów homingu jelitowego a4b7 oraz CCR9 na limfocytach T aktywowanych w obecności RA lub agonistów RAR, podczas gdy limfocyty T z grupy kontrolnej powinny wykazywać bardzo niski poziom tych receptorów 4.
Analiza cytometrii przepływowej (FACS).
<ol>
	<li>Należy zebrać od 0,2 do 0,5 x106 komórek i wirować przez 5 min przy 300 g w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) oraz anti-CD8-PercP przez 15 min w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji wirować przez 5 min przy 300 g w temperaturze 4°C. Komórki należy przemyć, resuspender w buforze do barwienia i analizować za pomocą FACS.</li>
</ol>
3. Znakowanie limfocytów T markerami komórkowymi CFSE i CMTMR
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy utrzymać wszystkie roztwory w temperaturze 37°C. Komórki T tropiczne do jelit (a4b7HighCCR9High) oraz kontrolne komórki T (a4b7Low/Neg CCR9Low/Neg) należy przemyć dwukrotnie PBS w celu usunięcia surowicy. Stężenie komórek T należy dostosować do poziomu 10-15 x 106/mL w PBS.</li>
	<li>Do komórek T tropicznych do jelit i kontrolnych komórek T należy dodać fluorofory CFSE (estery sukcynimidylowe karboksyfluoresceiny) lub CMTMR (chlorometylo-benzoilo-amino-tetrametylorodaminę) do końcowych stężeń odpowiednio 5 mM i 10 mM, delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować przez 20 min w 37°C. Zaleca się zamianę etykietowania w tym samym lub osobnym eksperymencie, aby wykluczyć potencjalny wpływ wewnętrzny fluoroforów na migrację komórek T.</li>
	<li>Po inkubacji proces należy zatrzymać, dodając 1 objętość FBS, a następnie inkubować przez 1-5 min w temperaturze pokojowej. Roztwór należy rozcieńczyć 10-krotnie w ciepłym PBS i odwirować przez 5 min przy 300 g. Próbkę należy przemyć dwukrotnie PBS i resuspendować w pełnej pożywce IMDM.</li>
	<li>W idealnych warunkach 10-20 x 106 komórek z każdej populacji T należy zmieszać w stosunku 1:1, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 min. Na koniec komórki należy resuspendować w 200-250 mL ciepłego PBS i wstrzyknąć do żyły ogonowej.</li>
	<li>Aby obliczyć dokładny stosunek wprowadzonych komórek (idealnie bliski 1), należy odłożyć 5-10 mL wstrzykiwanej zawiesiny komórek, rozcieńczyć ją 300 mL PBS i przeanalizować metodą FACS.</li>
</ol>
4. Analiza homingu limfocytów T
Chociaż myszy można analizować w różnych punktach czasowych (od 1 h do kilku dni po iniekcji limfocytów T), homing limfocytów T tropicznych do jelit jest najlepiej udokumentowany między 12 a 24 h po iniekcji. Dłuższe odstępy czasu zwiększają potencjalny wpływ innych zmiennych oddziałujących na końcową liczbę lub stosunki komórek, takich jak apoptoza limfocytów T oraz ich opuszczanie tkanki. Po eutanazji myszy zawiesiny komórkowe z kilku tkanek należy wyizolować bezzwłocznie, aby ograniczyć śmierć komórek, co mogłoby wpłynąć na końcową wydajność i wyniki. Tkaniami podlegającymi analizie są jelito cienkie, jelito grube, śledziona, węzły chłonne, kępki Peyera, wątroba, płuca oraz krew. Jeśli wstrzyknięte limfocyty T są rzeczywistymi limfocytami T tropicznymi do jelit, powinny one migrować do błony śluzowej jelita cienkiego średnio 5-10 razy efektywniej (lub bardziej) w porównaniu z kontrolnymi limfocytami T. Jednak w innych tkankach, takich jak krew i śledziona, nie powinna występować preferencyjna migracja limfocytów T. Izolacja limfocytów z blaszki właściwej jelit oraz z przedziału wewnątrznabłonkowego została opisana wcześniej 5.
<ol>
	<li>Barwienie FACS: Próbki są resuspenderowane w zależności od liczby zebranych komórek, do gęstości nieprzekraczającej 3.0 x 106 komórek/ml. Jeśli w charakterze biorców zastosowano myszy kongeniczne CD45.1+ lub Thy1.1+, komórki barwi się odpowiednim markerem kongenicznym (np. CD45.2 lub Thy1.2) w połączeniu z markerem linii (np. TCRbchain, CD4, CD8, CD45.1+/CD45.2+).</li>
	<li>Podczas analizy FACS komórki są bramkowane na marker kongeniczny (np. CD45.1), a następnie na specyficzne markery linii (np. CD4/CD8) i analizowane pod kątem stosunku komórek pozytywnych dla CMTMR i CFSE.</li>
	<li>Dane są zazwyczaj wyrażane jako indeks homingu (Homing Index, HI), który oblicza się jako stosunek CFSE/CMTMR (lub CMTMR/CFSE) w każdej tkance podzielony przez odpowiadający mu stosunek wejściowy (patrz poniżej). Jeśli stosunek wejściowy jest bardzo bliski 1, to stosunki tkankowe będą równoważne HI.</li>
</ol>
HI = CFSEtissue / CMTMRtissue : CFSEinput / CMTMRinput
Krew powinna zostać również poddana analizie w celu ustalenia, czy obie populacje limfocytów T są reprezentowane w krążeniu w równym stopniu, czy też jedna z populacji limfocytów T jest zmniejszona w stosunku do drugiej (np. wskutek preferencyjnego zatrzymania w płucach/wątrobie lub obniżonej żywotności). Może to wystąpić przy porównywaniu naiwnych lub spoczynkowych komórek pamięci T z niedawno aktywowanymi efektorowymi limfocytami T, ponieważ te ostatnie mogą być w większym stopniu zatrzymywane w płucach. Jeśli HI we krwi różni się znacząco od 1, można znormalizować HI w tkankach względem HI we krwi. Krew można pobrać poprzez punkcję serca u myszy znieczulonych (awertynem lub izofluranem przed eutanazją); przed użyciem do barwienia FACS krew powinna zostać dwukrotnie poddana lizie w buforze ACK.
Normalizacja krwi = HItkanka/ HIkrew
5. Reprezentatywne wyniki
Myszy biorców (Thy1.1+) uśmiercono 18h po iniekcji komórek. Przygotowano zawiesiny komórkowe ze śledziony, obwodowych węzłów chłonnych (PLN), krezkowych węzłów chłonnych (MLN) oraz blaszki właściwej (LP) jelita cienkiego. Następnie komórki barwiono pod kątem Thy1.2 i CD8, a następnie analizowano metodą FACS, wyznaczając bramkę dla żywych komórek Thy1.2+CD8+; ostatecznie przeanalizowano stosunek komórek CMTMR+ (limfocyty T tropistyczne do jelit) do komórek CFSE+ (kontrolne limfocyty T), podzielony przez stosunek wejściowy. Wyniki można przedstawić tak, jak pokazano na Ryc. 2, gdzie widać, że limfocyty T tropistyczne do jelit oraz kontrolne limfocyty T migrowały w równym stopniu do śledziony (HI bliskie 1, zaznaczone czerwoną linią). Z kolei limfocyty T tropistyczne do jelit migrowały do LP około 10 razy efektywniej w porównaniu z kontrolnymi limfocytami T.
<img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Proces migracji limfocytów T; tropizm jelitowy vs brak tropizmu jelitowego; schemat; sortowanie komórek; badanie immunologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający generowanie i znakowanie limfocytów T tropistycznych do jelit oraz nietropistycznych do jelit. Limfocyty T są izolowane od myszy typu dzikiego i aktywowane przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 w obecności lub w nieobecności 100-200 nM all-Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. kwas retinowy (RA). Po 4–5 dniach limfocyty T traktowane RA wykazują ekspresję receptorów homingu do jelit CCR9 oraz $\alpha$4$\beta$7. Następnie limfocyty T tropiczne do jelit oraz kontrolne są różnicowo znakowane CFSE lub CMTMR, przemywane, mieszane w stosunku 1:1 i wstrzykiwane biorczej myszy do żyły ogonowej. Część znakowanych komórek wykorzystuje się do określenia początkowego stosunku CFSE/CMTMR (powinien być on bliski 1).
<img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej przedstawiająca rozkład w tkankach, stosunek CFSE/CMTMR, histogram wyników HI." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykład analizy homingu. Myszy analizowano 12-18 h po wstrzyknięciu limfocytów T, a następnie uzyskano zawiesiny pojedynczych komórek z wybranych organów. Komórki barwiono przeciwciałami anty-Thy1.2 (marker kongeniczny) oraz anty-CD8, a następnie za pomocą FACS analizowano stosunek komórek CMTMR+ do CFSE+ wśród limfocytów T Thy1.2+CD8+ w każdej tkance. Stosunki CMTMR/CFSE w tkankach znormalizowano następnie względem stosunku CMTMR/CFSE w materiale wyjściowym (Input), aby uzyskać indeksy homingu (HI). W tym przykładzie komórki CMTMR+ są komórkami tropnymi do jelit, a komórki CFSE+ stanowią kontrolne efektorowe limfocyty T.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Mimo że eksperymenty z homingiem dostarczają bardzo cennych informacji na temat migracji całkowitych populacji komórek w danej tkance, należy pamiętać, że analizy te nie badają bezpośrednio adhezji do śródbłonka, a zatem nie pozwalają rozróżnić, w których etapach wielostopniowej kaskady adhezyjnej (tethering/toczenie, aktywacja lub przyleganie) działa dany receptor homingu. Złotym standardem w określaniu specyficznej roli receptorów homingu w kaskadzie adhezyjnej jest mikroskopia wewnątrzżyciowa (IVM), w której bezpośred...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Zwierzęta: C57BL/6&lt;/strong&gt;Myszy są powszechnie wykorzystywane do izolacji limfocytów T. Ponadto, szczepy kongeniczne CD45.1 i Thy1.1 są dostępne w Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Pożywki hodowlane&lt;/strong&gt;: &lt;silny&gt;IMDM&lt;/strong&gt; (Iscove&amp;rsquo;zmodyfikowane podłoże Dulbecco&amp;rsquo;pożywka Medium + L-glutamina + Hepes) oraz 10% &lt;silny&gt;inaktywowane termicznie FBS &lt;/strong&gt;(płodowa surowica bydlęca, niska zawartość endotoksyn, Gibco)&amp;#174;, Invitrogen, Carlsbad, CA) uzupełnione o 100 J/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0,5 mg/ml fungizone/amfoterycyny B (Gibco) oraz 50 mM $\beta$-merkaptoetanolu&amp;#8211;etanol</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;bufor do lizy erytrocytów ACK&lt;/strong&gt;(RBC, 10 mM KHCO3)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 150 mM NH4Cl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), doprowadzić do pH 7,2-7,4 i przechowywać w temperaturze pokojowej).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;PBS &lt;/strong&gt;(bufor solny fosforanowy, Hyclone, Waltham, MA).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Pożywki do cytometrii przepływowej (FACS)&lt;/strong&gt;(PBS lub IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Podczas barwienia z użyciem chimer Selectin-Fc należy stosować medium z 2 mM Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; należy stosować we wszystkich etapach (w tym podczas akwizycji FACS). W tym przypadku zaleca się stosowanie pożywki IMDM.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Znakowanie limfocytów T i transfer adopcyjny: CFSE&lt;/strong&gt;(diacetylofluoresceina karboksylowa, ester sukcynimidy), &lt;silny&gt;CMTMR&lt;/strong&gt; ((5-(i-6)-(((4-chlorometylo)benzoylo)amino) tetrametylorodamina) od Molecular Probes&amp;#174;, Invitrogen, Carlsbad, CA). Roztwory stokowe 1000x należy przygotować w DMSO (5 mM &lt;silny&gt;CFSE&lt;/strong&gt;, 20 mM &lt;silny&gt;CMTMR&lt;/strong&gt;) i przechowywano w temperaturze -20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Poliklonalna aktywacja limfocytów T&lt;/strong&gt;płytki 24-dołkowe lub 96-dołkowe &lt;silny&gt;(&lt;/strong&gt;przeznaczone do hodowli tkankowej, polistyrenowe, z płaskim dnem i pokrywką, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze 37&amp;#x00B0;C z 50 ml PBS, odpowiednio zawierając przeciwciała anty-CD3 oraz anty-CD28 (po 10 mg/ml każdego). Następnie płytki hodowlane płucze się dwukrotnie PBS i niezwłocznie wykorzystuje do hodowli limfocytów T. Alternatywnie, do aktywacji limfocytów T zamiast przeciwciał związanych z płytką można zastosować Dynabeads pokryte przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Barwienie do cytometrii przepływowej (FACS): &lt;/strong&gt;Aktywacja poliklonalna: &lt;silny&gt;CD3&lt;/strong&gt; (1452C11), &lt;silny&gt;CD28&lt;/strong&gt; (37.51). przeciwciało monoklonalne (mAb) linii komórkowej: &lt;silny&gt;CD4&lt;/strong&gt; (L3T4), &lt;silny&gt;CD8a&lt;/strong&gt; (Ly-2), &lt;silny&gt;Thy1.2&lt;/strong&gt; (CD90.2/53-1.2), &lt;silny&gt;CD45.2&lt;/strong&gt; (104). Receptory kierujące do jelit: oczyszczone &lt;silny&gt;CCR9&lt;/strong&gt; (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), &lt;silny&gt;a4b7&lt;/strong&gt;(LPAM-1/DATK3), &lt;silny&gt;kontrolka izotypowa&lt;/strong&gt; (IgG2a, k). Receptory homingu do skóry: &lt;silny&gt;P-selectyna-Fc&lt;/strong&gt; (oczyszczone białko fuzyjne P-selektyny mysiej z IgG, BD Pharmingen, San Jose, CA), &lt;silny&gt;E-selektyna-Fc&lt;/strong&gt; (rekombinowana chimera mysiej E-selektyny/Fc, R)&amp;R&D Systems, Minneapolis, MN) oraz odpowiadający mu odczynnik wtórny &lt;silny&gt;fragment F(ab')2 kozie&amp;rsquo;)2 anty-ludzkie IgG R-PE&lt;/strong&gt; (Invitrogen, Carlsbad, CA).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Wszystkie-&lt;em&gt;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&lt;/em&gt; kwas retinowy&lt;/strong&gt;(Sigma, St. Louis, MO) resuspensuje się w bezwodnym etanolu lub DMSO, używając żółtej żarówki lub pośredniego źródła światła podczas przygotowania. Alikwoty należy przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -80&amp;#x00B0;C oraz przez cały czas chronione przed światłem. Syntetyczne agoniści RAR: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).</td></tr></tbody></table>

konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów t tropujących do jelit

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Aby pełnić swoje funkcje, limfocyty muszą opuścić krew i migrować do różnych tkanek w organizmie. Adhezja limfocytów do komórek śródbłonka i ich ekstrawasacja do tkanek to wieloetapowy proces kontrolowany przez różne cząsteczki adhezyjne (receptory homingu) wykazujące ekspresję na limfocytach oraz ich odpowiadające im ligandy (adresyny) obecne na komórkach śródbłonka 1 2. Chociaż funkcję tych receptorów adhezyjnych można częściowo badać ex vivo, ostatecznym testem ich znaczenia fizjologicznego jest ocena ich roli podczas adhezji i migracji limfocytów in vivo. W tym celu stosuje się dwie komplementarne strategie: mikroskopię intravitalną (IVM) oraz eksperymenty z homingiem. Choć IVM była niezbędna do zdefiniowania dokładnego wkładu konkretnych receptorów adhezyjnych w kaskadę adhezji w czasie rzeczywistym i w różnych tkankach, technika ta jest czasochłonna i pracochłonna, często wymaga opracowania zaawansowanych technik chirurgicznych, poprzedzenia analizy izolacją homogenicznych populacji komórek i pozwala na badanie tylko jednej tkanki/organu w danym czasie. Z kolei konkurencyjne eksperymenty z homingiem umożliwiają bezpośrednie i jednoczesne porównanie migracji dwóch (lub więcej) subpopulacji komórek u tej samej myszy, a także pozwalają na analizę wielu tkanek i dużej liczby komórek w ramach jednego eksperymentu.
W niniejszym opracowaniu opisujemy klasyczny protokół konkurencyjnego homingu, stosowany w celu określenia przewagi lub braku przewagi danego typu komórek w procesie homingu do konkretnych tkanek w porównaniu z kontrolną populacją komórek. Do zilustrowania właściwości migracyjnych wybraliśmy limfocyty T tropiące do jelit oraz limfocyty T nietropiące do jelit, ponieważ błona śluzowa jelit stanowi największą powierzchnię ciała w kontakcie z środowiskiem zewnętrznym i jest ponadto tkanką pozachłonniczą o najlepiej określonych wymaganiach migracyjnych. Co więcej, w niedawnych badaniach ustalono, że metabolit witaminy A, kwas all-trans-retinowy (RA), jest głównym mechanizmem molekularnym odpowiedzialnym za indukcję specyficznych dla jelit receptorów adhezyjnych (integryny a4b7 oraz receptora chemokinowego CCR9) na limfocytach. Dzięki temu możemy łatwo generować duże liczby limfocytów tropiących i nietropiących do jelit ex vivo, aktywując limfocyty T odpowiednio w obecności lub w nieobecności RA, które następnie mogą zostać wykorzystane w opisanych tutaj eksperymentach z konkurencyjnym homingiem.

Eksperymenty z konkurencyjnym homingiem pozwalają na bezpośrednią ocenę właściwości migracyjnych dwóch różnych populacji komórek u jednej myszy. W niniejszym materiale ilustrujemy tę procedurę, porównując migrację limfocytów T o tropizmie jelitowym i nietropowym generowanych ex vivo.

Konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów T tropujących do jelit

Aby pełnić swoją funkcję, limfocyty muszą opuścić krew i migrować do różnych tkanek organizmu. Adhezja limfocytów do śródbłonka...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie tkankowo specyficznych zdolności migracyjnych dwóch lub więcej podzbiorów komórek u tego samego biorcy mysiego, co umożliwia analizę wielu tkanek i komórek w ramach jednego eksperymentu. Przedstawiamy tutaj metodę porównywania zdolności migracyjnych wygenerowanych in vitro limfocytów T o tropizmie jelitowym oraz limfocytów T kontrolnych u myszy biorcy typu dzikiego. Metoda ta może być wykorzystana na przykład do określenia zdolności limfocytów T o tropizmie jelitowym do migracji do krezkowych węzłów chłonnych jelit, obwodowych węzłów chłonnych oraz śledziony.W porównaniu do kontrolnych limfocytów T, najpierw in vitro należy wygenerować efektorowe limfocyty T tropowe do jelit oraz kontrolne limfocyty T. Następnie limfocyty T eksperymentalne i kontrolne należy oznakować różnymi barwnikami i zmieszać w stosunku jeden do jednego. Następnie mieszaninę komórek, z wyjątkiem niewielkiej ilości Eloqua służącej do potwierdzenia stosunku wejściowego, wstrzykuje się myszy biorcy.Na koniec, 18 godzin po transferze adopcyjnym, mysz zostaje uśpiona, a wybrane organy są analizowane pod kątem obecności tropicznych dla jelit oraz kontrolnych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfer adopcyjny pojedynczej populacji komórek, jest fakt, że kombinacja różnych subtypów jest wstrzykiwana do tych samych myszy biorców, co znacznie redukuje zmienność związaną z wstrzykiwaniem dożylnym lub stosowaniem różnych myszy biorców. Zastosowanie tej techniki rozszerza się na terapię chorób związanych z masywną infiltracją leukocytów, takich jak nieswoiste zapalne choroby jelit.Na przykład pozwala to określić, ile cząsteczek jest wymaganych podczas normalnej, a także podczas aran migracji limfocytów do jelit. Ponadto procedura ta umożliwia ocenę skuteczności leków zaprojektowanych w celu zablokowania ruchu leukocytów. Każdy dołek płytki 24-dołkowej wypełnij 500 µL PBS zawierającego 10 mg/mL przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28. Inkubuj płytkę przez dwie godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2, aby dołki zostały pokryte przeciwciałami.Uśmierć mysz typu dzikiego i wypreparuj śledzionę, umieszczając ją w probówce 50 ml z pożywką. Wyizoluj komórki śledziony, umieszczając narząd pomiędzy dwoma szkiełkami przedmiotowymi i rozcierając go nad szalką Petriego. Resuspenduj komórki w PBS, przenieś zawiesinę komórkową pipetą do nowej stożkowej probówki 50 ml i wiruj przez pięć minut.Przy 400 G w temperaturze pokojowej odwiruj próbkę i poddaj erytrocyty lizie, zawieszając pellet komórkowy w czterech mililitrach buforu do lizy przez dwie do trzech minut. Przerwij lizę, dodając pięć mililitrów PBS, ponownie odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut przy 400 G w temperaturze pokojowej i odlej nadsącz. Zawieś otrzymany pellet w stężeniu 1 × 10⁶ komórek na mililitr w zimnym medium kompletnym.Równo wymieszać medium Coves modified delcos lub IMDM, podzielić otrzymaną zawiesinę komórek do dwóch osobnych probówek, uzupełniając jedną z nich kwasem wszechtrans-retinowym lub RA do stężenia końcowego od 100 do 200 nM. Chronić probówkę przed bezpośrednim światłem, aby zapobiec degradacji kwasu wszechtrans-retinowego. Wyjąć płytkę 24-dołkową z inkubatora i dwukrotnie wypłukać każdy dołek 2 mL PBS.Dodaj od 1,5 do dwóch mililitrów zawiesiny komórkowej uzupełnionej o RA do połowy płytki 24-dołkowej. Następnie dodaj taką samą ilość komórek kontrolnych do każdego dołka w drugiej połowie płytki 24-dołkowej i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Po dwóch do trzech dniach przenieś zawiesiny komórkowe do nowej, niepowlekanej płytki 24-dołkowej.Aby uniknąć nadmiernej stymulacji limfocytów T, inkubuj komórki przez dodatkowe dwa do trzech dni. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty z powodu gęstości komórek i/lub ich proliferacji, dodaj 500 µL świeżego IMDM do każdej studni, aby osiągnąć końcową objętość 1 mL na studnię. W celu zbioru komórek, pobierz nadsącz w czwartym lub piątym dniu, przyjmując dzień wysiania komórek jako dzień zero.Typowe końcowe wydajności wynoszą od 1 do 2 × 10⁶ efektorowych limfocytów T na studzienkę. Zatem, aby uzyskać od 10 do 20 × 10⁶ limfocytów T na grupę, należy wysiać minimum od dziewięciu do 12 studzienek dla każdego z typów limfocytów T: tropowych do jelit oraz kontrolnych. Aby sprawdzić poziomy ekspresji α4, β7 oraz CCR9 na ra.Aktywowane i kontrolowane limfocyty T zbiera się w ilości od 0,2 do 0,5 × 10⁶ świeżo wyizolowanych komórek eksperymentalnych i kontrolnych do probówek typu Falcon o pojemności 4 ml i wiruje. Probówki wiruje się przez 5 minut przy 300 ×g w temperaturze 4 °C. Odprowadza się nadsącz i resuspenderuje komórki w 100 µL buforu barwiącego, następnie inkubuje z przeciwciałami anty-CD4 FITC, anty-α4β7 PE, anty-CCR9 APC i anty-CD8 PerCP przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.Po inkubacji przemyj komórki w PBS przez pięć minut przy 300 ×g w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i ponownie zawieś komórki w buforze do barwienia, a następnie poddaj analizie metodą cytometrii przepływowej. Na początku tego etapu podgrzej butelkę z IMDM oraz butelkę z PBS do 37 °C do późniejszego wykorzystania w protokole barwienia.Po potwierdzeniu fenotypów homingu limfocytów T w dwóch kulturach komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w poprzednim kroku, odwiruj świeżo zebrane populacje limfocytów T: jelitowo-tropowe (α4β7-high, CCR9-high) oraz kontrolne (α4β7-low/negative, CCR9-low/negative) z prędkością 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć surowicę, a potem dostosuj stężenie limfocytów T w każdej grupie do poziomu 10–15 × 10⁶ komórek/ml. Do PBS dodaj barwniki CFSE lub CMTMR do limfocytów T jelitowo-tropowych lub kontrolnych.W tym miejscu do populacji komórek kontrolnych dodaje się CFSE, a do komórek T Tropic z jelit C-M-T-M-R, odpowiednio do końcowych stężęć 5 mM i 10 mM. Następnie delikatnie mieszamy komórki w wirówce typu vortex przez 5 sekund i inkubujemy probówki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej. Po zakończeniu inkubacji przerywamy barwienie, dodając 5 ml FPS, i inkubujemy przez 1 do 5 minut w temperaturze pokojowej.Rozcieńczyć 10-krotnie w ciepłym PBS i odwirować przez pięć minut przy 300 Gs w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant, przemyć komórki dwukrotnie PBS i resuspender w pełnej pożywce IMDM. Optymalnie należy zmieszać od 10 do 20 razy 10^6 komórek z każdej populacji limfocytów T w probówkach typu fax o pojemności czterech mililitrów w stosunku jeden do jednego.Aby obliczyć dokładny stosunek wejściowy, należy pobrać od 5 do 10 µL zawiesiny komórkowej przeznaczonej do wstrzyknięcia, którą określa się mianem inputu, i przechowywać ją w temperaturze 4 °C. Następnie należy odwirować mieszaninę komórek do wstrzyknięcia z prędkością 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Komórki do wstrzyknięcia należy resuspendować w 250 do 300 µL ogrzanego PBS, a następnie pobrać zawiesinę komórkową do wstrzyknięcia do strzykawki insulinowej o pojemności 1 CC z igłą 28 G.Wstrzyknąć 250 µL mieszaniny komórek do żyły ogonowej. Na koniec przeanalizować komórki wejściowe za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić odsetek komórek pozytywnych pod kątem CFSE i C-M-T-M-R, które zostały wcześniej wstrzyknięte. Wartość ta będzie stanowić stosunek wejściowy wykorzystany w dalszych etapach.W końcowym obliczeniu indeksu homingu zawieszamy próbki komórek z tkanek do analizy homingu limfocytów T w zagęszczeniu nieprzekraczającym 3×10⁶ komórek/mL. Jeśli w tym materiale wideo jako biorców wykorzystano myszy kongeniczne, zastosowano myszy CD45.1+. Podczas analizy cytometrycznej, z zastosowaniem odpowiedniego markera kongenicznego w połączeniu z markerem linii, należy wyznaczyć bramkę dla komórek na wybranym markerze kongenicznym, a następnie na specyficznym markerze linii CD8 i przeanalizować stosunki między komórkami pozytywnymi dla CMTMR a komórkami pozytywnymi dla CFSE.Następnie dane są wyrażone jako indeks homingu lub hi, który oblicza się jako stosunek dwóch różnych barwników w każdej tkance podzielony przez odpowiadający im stosunek wejściowy. Stosunek wejściowy to stosunek komórek dodatnich dla CFSE do komórek dodatnich dla CMTM TMR w strzykawce przed wtryskiem, obliczony z aliquoty 5 do 10 µL zawiesiny komórkowej, która została odstawiona i przeanalizowana w tym celu za pomocą cytometrii przepływowej. Jeśli stosunek wejściowy jest bardzo bliski jedności, stosunki w tkankach będą równoważne wartości hi.Jeśli HI w tkankach i we krwi znacznie różnią się od siebie, HI w analizowanych tkankach można znormalizować względem HI we krwi, obliczając stosunek HI w tkankach do HI w zawiesinach komórkowych przygotowanych z śledziony, obwodowych węzłów chłonnych (PLN), krezkowych węzłów chłonnych (MLN) lub blaszki właściwej (LP) jelita cienkiego 18 godzin po wstrzyknięciu. Przeanalizowano ekspresję C-M-T-M-R i CFSE na bramkowanych komórkach CD8+ CD45.1+. Aktywowane komórki T wykazujące ekspresję α4β7 i CCR9 oraz będące C-M-T-M-R+ migrowały do śledziony w takiej samej liczbie jak kontrolne komórki CFSE+, ale wykazały wyraźny wzrost homingu do jelit i drenażowych tkanek chłonnych. Obliczenie HI dla każdej tkanki dodatkowo potwierdziło, że gut-tropiczne i kontrolne komórki T migrowały w równym stopniu do śledziony, natomiast w przeciwieństwie do nich, gut-tropiczne komórki T migrowały około 10 razy wydajniej do LP w porównaniu z kontrolnymi komórkami T po opanowaniu procedury.Zamiast wyrównywania barwnika można zastosować myszy kongeniczne, aby ocenić zdolność migracyjną dodatkowych typów komórek, takich jak komórki dendrytyczne lub makrofagi. Ponieważ typy komórek te mają tendencję do utraty barwnika po wstrzyknięciu do myszy biorcy, użycie zwierząt kongenicznych pozwala na lepsze śledzenie komórek przez znacznie dłuższe okresy po transferze adopcyjnym.

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Konkurencyjne badania homeingowe w celu zbadania migracji komórek T tropujących jelita

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do organów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który może być wykorzystany do analizy migracji limfocytów T in vitro.

Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Poznaj metodę konkurencyjnych testów naprowadzających do badania migracji limfocytów T tropowych jelit w mysim modelu. Technika umożliwia porównanie zdolności migracyjnych różnych podpopulacji komórek T w jednym organizmie gospodarza.

Konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów T tropujących do jelit

Przeglądaj więcej filmów