Name: Całościowa analiza immunohistochemiczna naczyń naczyniowych skóry kończyn embrionalnych: modelowy system do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę całościowej immunohistochemii do analizy sieci naczyniowej w skórze kończyn zarodkowych myszy. Technika ta umożliwia szczegółowe obrazowanie morfogenezy naczyń krwionośnych i limfatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy K. Gill za pomoc w hodowli i pielęgnacji myszy oraz za zarządzanie laboratorium. Dziękujemy również członkom laboratorium Mukoyamy za pomoc techniczną. Finansowanie zostało zapewnione przez Intramural Research Program National Institutes of Health.

1. Pobieranie skóry kończyn zarodka myszy (E13.5~E17.5)
<ol>
 <li>Uśmierć zapłodnione samice zgodnie z zatwierdzoną procedurą. Zgodnie z naszym zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt, samice są uśmiercane poprzez ekspozycję na CO2, a następnie poddawane zwichnięciu szyi w celu potwierdzenia zgonu. Połóż zwierzę na chłonnym ręczniku papierowym i dokładnie nasącz je 70% EtOH/H2O z butelki z dozownikiem.</li>
 <li>Wypreparuj macicę w całości i umieść ją w szalce Petriego 100 x 15 mm zawierającej lodowaty zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby wypłukać krew.</li>
 <li>Oddziel i wypreparuj zarodek. Usuń bardzo cienką błonę owodni z zarodka.</li>
 <li>(Opcjonalnie) Wypreparuj pojedynczy zarodek w szalce Petriego 35 x 10 mm, jeśli każdy zarodek wymaga genotypowania. Wypreparowany ogon przenosi się do probówki PCR 0,2 ml w celu genotypowania.</li>
 <li>Odetnij kończyny przednie zarodka i przenieś je pęsetą pierścieniową do płytki 24-dołkowej zawierającej 2 ml lodowatego, świeżego 4% Paraformaldehydu (PFA) w buforze fosforanowym (PBS).</li>
 <li>Utrwal kończyny przednie przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze 4°C przez noc.</li>
 <li>Następnego dnia usuń PFA i przemyj trzy razy przez 5 min w 2 ml PBS przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przenieś kończyny przednie do 100% metanolu (MeOH) i przechowuj je w zamrażarce do enzymów w temperaturze -20°C (zamrażarka z krytyczną kontrolą temperatury i bez funkcji automatycznego rozmrażania). Przeciwciała pierwszorzędowe wymienione w Tabeli 1 działają po traktowaniu 100% MeOH.</li>
 <li>Zdejmij skórę z kończyny przedniej za pomocą precyzyjnej pęsety. Skóra kończyny po odwodnieniu powinna łatwo oddzielać się od kończyny. Najpierw połóż kończynę stroną brzuszną (stroną dłoniową) do góry. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, przetnij skórę tak, jak pokazano w filmie. Następnie wypreparuj obszar wokół całej kończyny, delikatnie zdejmując skórę bezyżniejszego uszkadzania tkanki.</li>
</ol>
2. Barwienie immunohistochemiczne całych preparatów skóry kończyn
<ol>
 <li>Rehydratyzuj skóry kończyn w 5ml polipropylenowej probówce z okrągłym dnem, inkubując je w gradacyjnej serii MeOH/PBT (PBS + 0,2%Triton X-100) (75%, 50%, 25%) przez 5 min w każdym etapie. Należy pamiętać, aby wymiana roztworów odbywała się ostrożnie, by uniknąć uszkodzenia skór kończyn.</li>
 <li>Przemyj dwa razy przez 5 min w PBT przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zablokuj skóry kończyn, używając albo buforu blokującego 10% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 (dla przeciwciał wtórnych kozich), albo buforu blokującego 10% surowicy osła/PBS+0,2%TX100 (dla przeciwciał wtórnych osła), przez 2 godziny przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do probówki do mikrowirówki 2ml zawierającej 800μl przeciwciał pierwszorzędowych (w odpowiednim rozcieńczeniu, zgodnie z listą w tabelach) w buforze blokującym (10% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 10% surowicy osła/PBS+0,2%TX100). Inkubuj skóry kończyn przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w 4°C przez noc. Należy pamiętać, że można jednocześnie stosować wiele przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od różnych gatunków (np. monoklonalne przeciwciało szczurze + poliklonalne przeciwciało królicze).</li>
 <li>Następnego dnia umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do 5ml polipropylenowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100).</li>
 <li>Przemyj pięć razy przez 15 min przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do probówki do mikrowirówki 2ml zawierającej 800μl przeciwciał wtórnych w buforze blokującym (10% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 10% surowicy osła/PBS+0,2%TX100). Zazwyczaj stosujemy przeciwciała wtórne firmy Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, rozcieńczenia 1:300) lub Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, rozcieńczenie 1:250). Przefiltruj roztwór przeciwciał wtórnych za pomocą filtrów strzykawkowych z membraną PVDF 0,22μm, aby usunąć zagregowane cząsteczki przeciwciał wtórnych. Inkubuj skóry kończyn w ciemności lub owinięte folią aluminiową przez 1 godzinę przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że można jednocześnie stosować różne koniugaty fluorescencyjne przeciwciał wtórnych pochodzących od różnych gatunków.</li>
 <li>Umieść skóry kończyn na szalce Petriego 35 x 10 mm i przenieś je za pomocą pęsety pierścieniowej do 5ml polipropylenowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100). Przemyj pięć razy przez 15 min w ciemności lub owinięte folią aluminiową przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>(Opcja barwienia przeciwjądrowego) Inkubuj skóry kończyn w 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100) z To-Pro-3 (Invitrogen T3605, rozcieńczenie 1:3000) w ciemności lub owinięte folią aluminiową przez 10 min przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj trzy razy przez 5 min w 4ml buforu piorącego (2% surowicy koziej/PBS+0,2%TX100 lub 2% surowicy osła/PBS+0,2%TX100) w ciemności lub owinięte folią aluminiową przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu Nutator w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że dla To-pro-3 obserwuje się silne i specyficzne barwienie jąder w określonej emisji (pobudzenie HeNe 633 nm).</li>
</ol>
3. Montowanie preparatów skóry kończyn na szkiełku
<ol>
 <li>Umieścić skóry kończyn na szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Za pomocą precyzyjnej pęsety pod stereomikroskopem z niskim oświetleniem, aby uniknąć intensywnego fotoblaknięcia, usunąć z wewnętrznej warstwy skór pył, kryształki oraz włókna.</li>
 <li>Przenieść skóry kończyn na przylepne szkiełko mikroskopowe za pomocą kleszczyków pierścieniowych. Umieścić skóry na szkiełku wewnętrzną warstwą skierowaną do góry (tj. w stronę szkiełka nakrywkowego). Ostrożnie rozpłaszczyć skóry precyzyjną pęsetą i usunąć resztki buforu płuczącego za pomocą chusteczki Kimwipe.</li>
 <li>Zamontować w medium montażowym typu anti-fade, dbając o brak pęcherzyków powietrza. Stosujemy szkiełka nakrywkowe o wymiarach 25"x25". Utwardzić na płaskiej powierzchni w ciemności (np. próbki zamontowane przy użyciu odczynnika ProLong Gold pozostawia się na noc w ciemności w temperaturze pokojowej przed obserwacją). Do długoterminowego przechowywania należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
4. Mikroskopia konfokalna
<ol>
 <li>Skonfiguruj odpowiednie lasery dla fluoroforów. Używamy konfokalnego mikroskopu Leica TCS SP5 z trzema źródłami laserowymi, w tym Argon 488nm (dla Alexa Fluor 488 i GFP), DPSS 561nm (dla Alexa Fluor 568 i Cy3) oraz HeNe 633nm (dla Alexa Fluor 633, Cy5 i To-Pro-3).</li>
 <li>Użyj narzędzia skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć lub ograniczyć przesłuchy (crosstalk), przy których wszystkie barwniki w próbkach barwionych podwójnie lub potrójnie byłyby wzbudzane jednocześnie. W trybie skanowania sekwencyjnego obrazy będą rejestrowane w kolejności następującej po sobie.</li>
 <li>Bardziej ogólne informacje na temat barwników fluorescencyjnych i laserów do wzbudzania można znaleźć w publikacji „Confocal Microscopy for Biologists” autorstwa Hibbsa (2004).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna z potrójnym znakowaniem całych preparatów skóry przedniej kończyny myszy w stadium E15.5 z użyciem przeciwciał przeciwko pan-endotelialnemu markerowi komórek PECAM-1 (Rycina 1A-C, D niebieski), markerowi neurofilamentów 2H3 (Rycina 1A zielony) oraz markerowi komórek mięśni gładkich αSMA (Rycina 1A, B czerwony) ujawniła charakterystyczny wzór rozgałęzień tętnic αSMA+, przebiegających równolegle do obwodowych nerwów 2H3+ w skórze kończyny. Poza rozgałęzianiem naczyń krwionośnych, ten model unaczynienia skóry kończyny jest wykorzystywany do badania wzorców rozgałęziania naczyń limfatycznych przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom endotelialnym komórek limfatycznych LYVE-1 (Rycina 1D, E czerwony) oraz Neuropilinie 2 (NRP2) (Rycina 1D, F zielony).
<img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Układ nerwów, naczyń krwionośnych i limfatycznych; mikroskopia immunofluorescencyjna; NRP2, PECAM-1." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. (A-C) Tętnice przebiegają równolegle do nerwów obwodowych w skórze kończyny zarodka. Przedstawiono konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną z potrójnym znakowaniem całego preparatu przy użyciu przeciwciał przeciwko panendotelialnemu markerowi PECAM-1 (A-C, niebieski), markerowi neurofilamentów 2H3 (A, zielony) oraz markerowi komórek mięśni gładkich αSMA (A i B, czerwony). W stadium E15.5 nerwy obwodowe 2H3+ (otwarte strzałki) towarzyszą tętnicom (groty strzałek), które są pokryte komórkami mięśni gładkich αSMA+ . (D-F) Układ naczyń limfatycznych w skórze kończyny zarodka. Przedstawiono konfokalną mikroskopię immunofluorescencyjną z potrójnym znakowaniem przy użyciu przeciwciał przeciwko panendotelialnemu markerowi PECAM-1 (D, niebieski), markerowi limfatycznych komórek śródbłonka LYVE-1 (D i E, czerwony) oraz Neuropilinie 2 (NRP2) (D i F, zielony). Naczynia limfatyczne są wizualizowane zarówno za pomocą LYVE-1, jak i NRP2, podczas gdy LYVE-1 jest również ekspresjonowany przez podzbiór makrofagów (otwarte groty strzałek). Pasek skali: 100μm.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Układ naczyniowy jest kluczowy dla rozwoju organów podczas embriogenezy, a także dla utrzymania funkcji narządów i funkcji rozrodczych u osobników dorosłych, ponieważ dostarcza on organom niezbędny tlen i składniki odżywcze. Prawidłowa sieć naczyniowa powstaje w wyniku złożonych i wieloetapowych procesów angiogenezy, podczas których istniejąca sieć kapilarna jest reorganizowana w wysoce rozgałęzione struktury hierarchiczne. Chociaż liczne prace wykazały, że w procesach tych zaangażowany jest szereg cząsteczek, nie było j...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Przeciwciała&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Marker panendotelialny&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;obramowanie tabeli=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Nr katalogowy &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;PECAM-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chomik armeński (samiec)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chemicon&lt;/td&gt; &lt;td&gt;MAB1398Z&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:100&lt;sup&gt;#1&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;PECAM-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Szczur (samiec)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;BD&lt;/td&gt; &lt;td&gt;553369&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:300&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;VEGFR2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Szczur (samiec)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;eBioscience&lt;/td&gt; &lt;td&gt;14-5821-82&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CD34&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Szczur (samiec)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;eBioscience&lt;/td&gt; &lt;td&gt;13-0341&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:300&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Kolagen IV&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AbD Serotec&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2150-1470&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:300&lt;sup&gt;#2&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Marker komórek śródbłonka tętniczego&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Katalog nr &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Neuropilina 1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Alex Kolodkin&amp;rsquo;laboratorium s&lt;sup&gt;#3&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:3000&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Unc5H2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Koza (P) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;R&amp;amp;D&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AF1006&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Marker komórek śródbłonka żylnego&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunki&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Katalog nr &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;EphB4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Kozia (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;R&amp;amp;D&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AF446&lt;/td&gt; &lt;td&gt;roztwór 1:100&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Marker komórek śródbłonka limfatycznego&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Numer katalogowy &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;LYVE-1&lt;sup&gt;#4&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Abcam&lt;/td&gt; &lt;td&gt;ab14917&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;LYVE-1&lt;sup&gt;#4&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Szczur (samiec) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;MBL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;D225-3&lt;/td&gt; &lt;td&gt;roztwór 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Prox-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chemicon&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AB5475&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:1000&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Prox-1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Koza (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;R&amp;amp;D&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AF2727&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:50&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Neuropilina-2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sygnalizacja komórkowa&lt;/td&gt; &lt;td&gt;3366&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:100&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Podoplanina&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chomik syryjski (samiec)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bank Hybrydomów&lt;/td&gt; &lt;td&gt;8.1.1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Marker komórek mięśni gładkich/perycytów&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunki&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Katalog nr &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;alpha;SMA-Cy3&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz (M)&lt;sup&gt;#5&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sigma&lt;/td&gt; &lt;td&gt;c-6198&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:500&lt;sup&gt;#6&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;NG2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chemicon&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AB5320&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;SM22&amp;alpha;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Abcam&lt;/td&gt; &lt;td&gt;ab14106&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciała przeciwko&lt;em&gt;GFP&lt;/em&gt; reporter&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;obramowanie tabeli=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Katalog nr &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GFP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Invitrogen&lt;/td&gt; &lt;td&gt;A11122&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:300&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GFP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Szczur (samiec) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Nacalai Tesque&lt;/td&gt; &lt;td&gt;04404-84&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:1000&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;GFP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Kurczę (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chemicon&lt;/td&gt; &lt;td&gt;P42212&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:300&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciała przeciwko &lt;em&gt;LacZ&lt;/em&gt; reporter&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Nr katalogowy &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;#946;-gal&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;MP Biomedical&lt;/td&gt; &lt;td&gt;55976&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:5000&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;#946;-gal&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Koza (P) &lt;/td&gt; &lt;td&gt;AbD Serotec&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4600-1409&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:500&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;#946;-gal&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Kurczę (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Abcam&lt;/td&gt; &lt;td&gt;ab9361&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciała przeciwko aksonom obwodowym&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciało&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Gatunek&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Nr katalogowy &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Warunki pracy&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;2H3&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz (M)&lt;sup&gt;#7&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Bank Hybridomów&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2H3&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:200&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tuj1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Mysz (M)&lt;sup&gt;#8&lt;/sup&gt; &lt;/td&gt; &lt;td&gt;Covance&lt;/td&gt; &lt;td&gt;MMS-435P&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:500&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;peryferyna&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Chemicon&lt;/td&gt; &lt;td&gt;AB1530&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:1000&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;strong&gt;Przeciwciała przeciwko migrującym komórkom Schwanna&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;BFABP&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Królik (P)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;The Thomas M&amp;#252;komórka&amp;rsquo;laboratorium&lt;sup&gt;#9&lt;/sup&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;rozcieńczenie 1:3000&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;Analiza immunohistochemiczna całego preparatu (whole-mount) w celu obrazowania całego układu naczyniowego jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów komórkowych morfogenezy rozgałęziania. Opracowaliśmy model naczyń krwionośnych skóry kończyny do badania rozwoju naczyniowego, w którym istniejący uprzednio prymitywny splot kapilarny przekształca się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć naczyniową. Konfokalna mikroskopia całego preparatu z wielokrotnym znakowaniem umożliwia precyzyjne obrazowanie nienaruszonych naczyń krwionośnych oraz ich komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, pericytów i komórek mięśni gładkich, przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych. Postępy w badaniach nad tym modelem naczyń skóry kończyny, w połączeniu z badaniami genetycznymi, pozwoliły na lepsze zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju i wzorcowania naczyń. Model naczyń skóry kończyny był wykorzystywany do badania roli nerwów obwodowych w tworzeniu matrycy przestrzennej dla różnicowania i wzorcowania tętnic. Niniejszy artykuł wideo opisuje prosty i niezawodny protokół barwienia nienaruszonych naczyń krwionośnych za pomocą przeciwciał specyficznych dla naczyń oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, który ma zastosowanie w przypadku unaczynionych organów embrionalnych, w których możliwe jest śledzenie procesu rozwoju naczyniowego.&quot;&gt;(P): przeciwciało poliklonalne, (M): przeciwciało monoklonalne&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#1: W качестве przeciwciała wtórnego należy zastosować przeciwciało kozie anty-chochoł syryjski-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#2: Przeciwciało przeciwko kolagenowi IV może być stosowane do wykrywania naczyń krwionośnych po &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; hybrydyzacja.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#3: Przeciwciało Neuropilin1 zostało uprzejmie udostępnione przez Alexa Kolodkina&amp;rsquo;laboratorium na Uniwersytecie Johns Hopkins. Przeciwciało owcze przeciwko ludzkiej neuropilinie 1 jest dostępne w R&amp;amp;D (AF3870), choć jeszcze go nie przetestowaliśmy.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Analiza immunohistochemiczna całych preparatów (whole-mount) służąca do obrazowania całego układu naczyniowego jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów komórkowych morfogenezy rozgałęzień. Opracowaliśmy model unaczynienia skóry kończyny do badania rozwoju naczyniowego, w którym istniejący wcześniej prymitywny splot kapilarny przekształca się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć naczyniową. Konfokalna mikroskopia całych preparatów z wielokrotny labeling umożliwia precyzyjne obrazowanie nienaruszonych naczyń krwionośnych, a także ich komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, perycytów i komórek mięśni gładkich, przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych. Postępy w badaniach nad tym modelem unaczynienia skóry kończyny, w połączeniu ze studiami genetycznymi, pozwoliły na lepsze zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju i wzorca naczyń. Model unaczynienia skóry kończyny został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób nerwy obwodowe stanowią szablon przestrzenny dla różnicowania i wzorca tworzenia się tętnic. Niniejszy artykuł wideo opisuje prosty i niezawodny protokół barwienia nienaruszonych naczyń krwionośnych przy użyciu przeciwciał specyficznych dla naczyń oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, który ma zastosowanie w przypadku unaczynionych organów zarodkowych, w których możliwe jest śledzenie procesu rozwoju naczyniowego.&quot;&gt;#4: Przeciwciała LYVE-1 wykrywają również podzbiór makrofagów w skórze zarodkowej.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Analiza immunohistochemiczna całego preparatu (whole-mount) w celu obrazowania całego układu naczyniowego jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów komórkowych morfogenezy rozgałęźniętej. Opracowaliśmy model unaczynienia skóry kończyny do badania rozwoju naczyniowego, w którym istniejący wcześniej prymitywny splot kapilarny przekształca się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć naczyniową. Konfokalna mikroskopia całego preparatu z wielokrotnym znakowaniem pozwala na precyzyjne obrazowanie nienaruszonych naczyń krwionośnych oraz ich komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, perycytów i komórek mięśni gładkich, przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych. Postępy w badaniach nad tym modelem unaczynienia skóry kończyny, w połączeniu z badaniami genetycznymi, poprawiły zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju i wzorcowania naczyń. Model unaczynienia skóry kończyny był wykorzystywany do badania, w jaki sposób nerwy obwodowe stanowią przestrzenną matrycę dla różnicowania i wzorcowania tętnic. Niniejszy artykuł wideo opisuje prosty i niezawodny protokół barwienia nienaruszonych naczyń krwionośnych przy użyciu przeciwciał specyficznych dla naczyń oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, który ma zastosowanie w przypadku unaczynionych organów embrionalnych, w których możliwe jest śledzenie procesu rozwoju naczyniowego.&quot;&gt;#5: Przeciwciało anty-&amp;alpha;Przeciwciało przeciwko SMA jest mysim monoklonalnym przeciwciałem IgG2a.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#6: Przeciwciało sprzężone z Cy3 &amp;alpha;Przeciwciało SMA inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej wraz z przeciwciałami wtórnymi do pozostałych przeciwciał pierwszorzędowych.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#7: Przeciwciało 2H3 to monoklonalne przeciwciało mysie z klasy IgG1 skierowane przeciwko neurofilamentom.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#8: Przeciwciało Tuj1 to mysia monoklonalna przeciwciało IgG2a przeciwko neuronowej beta-tubulinie klasy III.&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;#9: Przeciwciało BFABP (białko wiążące kwasy tłuszczowe specyficzne dla mózgu) zostało uprzejmie udostępnione przez Thomasa M&amp;#252;ller&amp;rsquo;laboratorium w Max-Delbr&amp;#252;ck-Centrum Medycyny Molekularnej.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu (whole-mount) w celu obrazowania całego układu naczyniowego jest kluczowa dla zrozumienia komórkowych mechanizmów morfogenezy rozgałęziania. Opracowaliśmy model unaczynienia skóry kończyny do badania rozwoju naczyniowego, w którym istniejący wcześniej prymitywny splot kapilarny przekształca się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć naczyniową. Konfokalna mikroskopia całego preparatu z wielokrotnym znakowaniem umożliwia precyzyjne obrazowanie nienaruszonych naczyń krwionośnych oraz ich komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, perycytów i komórek mięśni gładkich, przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych. Postępy w badaniach nad tym modelem unaczynienia skóry kończyny, w połączeniu z badaniami genetycznymi, pozwoliły na lepsze zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju i wzorowania naczyń. Model unaczynienia skóry kończyny został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób nerwy obwodowe stanowią przestrzenną matrycę dla różnicowania i wzorowania tętnic. Niniejszy artykuł wideo opisuje prosty i niezawodny protokół barwienia nienaruszonych naczyń krwionośnych za pomocą przeciwciał specyficznych dla naczyń oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, który ma zastosowanie w przypadku unaczynionych organów zarodkowych, w których możliwe jest śledzenie procesu rozwoju naczyniowego.

Przedstawiamy metodę immunohistochemii całego preparatu oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej z wielokrotnym znakowaniem w celu analizy tworzenia złożonej sieci naczyniowej w skórze kończyny zarodka myszy.

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Analiza immunohistochemiczna całych preparatów (whole-mount) służąca do obrazowania całego układu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia komórkowych mechanizmów morfogenezy rozgałęziającej. Opracowaliśmy model naczyń skórnych kończyny do badania rozwoju naczyniowego, w którym istniejący wcześniej prymitywny splot kapilarny przekształca się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć naczyniową. Konfokalna mikroskopia całych preparatów z wielokrotnym znakowaniem umożliwia precyzyjne obrazowanie nienaruszonych naczyń krwionośnych, a także ich komponentów komórkowych, w tym komórek śródbłonka, perycytów i komórek mięśni gładkich, przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych. Postępy w badaniu tego modelu naczyń skórnych kończyny, w połączeniu z badaniami genetycznymi, pozwoliły na lepsze zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju i wzorca naczyń. Model naczyń skórnych kończyny był wykorzystywany do badania, w jaki sposób nerwy obwodowe stanowią matrycę przestrzenną dla różnicowania i tworzenia wzorca tętnic. Niniejszy artykuł wideo opisuje prosty i niezawodny protokół barwienia nienaruszonych naczyń krwionośnych za pomocą przeciwciał specyficznych dla naczyń oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, który ma zastosowanie w przypadku unaczynionych organów embrionalnych, w których możliwe jest śledzenie procesu rozwoju naczyniowego.

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie pełnej immunohistochemicznej analizy preparatu (whole-mount) w celu obrazowania całego układu naczyniowego w rozwijającej się skórze kończyn. Osiąga się to poprzez odcięcie najpierw czterech kończyn z embrionu, utrwalenie ich w 4% paraformaldehydzie w PBS, a następnie odwodnienie w 100% metanolu. Drugim krokiem jest użycie precyzyjnej pęsety do oddzielenia skóry u podstawy kończyny.Należy prowadzić się wzdłuż niebieskich przerywanych linii i oddzielić skórę w naczyniu zawierającym 100% methanol. Usunąć skórę z kończyny. Następnie na skórze kończyny wykonuje się barwienie immunohistochemiczne z użyciem swoistych dla naczyń przeciwciał pierwszorzędowych oraz fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych.W końcu, konfokalna mikroskopia całego preparatu z wielokrotnym znakowaniem umożliwi wysokiej jakości obrazowanie całego układu naczyniowego skóry kończyn. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak analiza histologiczna przekrojów, jest to, że immunohistochemiczna analiza całego preparatu naczyń skóry kończyn pozwala nie tylko na obrazowanie całego układu naczyniowego, w tym jego komponentów komórkowych, ale także na badanie procesów różnicowania, wzorca rozmieszczenia komórek naczyń krwionośnych oraz rozgałęziania naczyń limfatycznych. Procedurę demonstruję wraz z doktorantem z mojego laboratorium. Skóry kończyn embrionalnych pobierano od ciężarnych samic myszy.Po wyjęciu i przemyciu macicy, pracując pod mikroskopem stereotypowym, należy wyodrębnić i wypreparować zarodki. Po wypreparowaniu zarodków kolejnym krokiem jest usunięcie z nich czterech kończyn (LIMS) za pomocą precyzyjnej pęsety. Odetnij cztery kończyny w obrębie barku, a następnie za pomocą kleszczyków pierścieniowych przenieś je do płytki 24-dołkowej zawierającej lód.W zimnym, świeżym 4% roztworze Paraformaldehydu w PBS umieść po cztery kończyny na dołek w dwóch mililitrach 4% PFA. Utwal kończyny przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku rotacyjnym w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia usuń PFA z każdego dołka i dodaj dwa mililitry PBS.Przemywaj preparaty przez pięć minut przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku typu mutator w temperaturze pokojowej. Powtórz to przemywanie dwukrotnie, tak aby łącznie wykonać trzy cykle płukania. Następnie przenieś cztery kończyny do polipropilenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml zawierającej 100% metanolu; przechowuj w temperaturze -20 °C w zamrażarce laboratoryjnej z precyzyjną kontrolą temperatury i bez funkcji automatycznego rozmrażania. Po całonocnym przechowywaniu w temperaturze -20 °C skórę można oddzielić od kończyny.Jest to jeden z najbardziej krytycznych aspektów tej procedury, ponieważ sukces późniejszego barwienia i obrazowania zależy od tego, czy skóra nie zostanie uszkodzona. Skóra kończyny łatwo oddziela się od kończyny po odwodnieniu w ten sposób, co pozwala na jej usunięcie z czterech kończyn. Najpierw należy położyć kończynę stroną brzuszną do góry.Następnie, używając precyzyjnej pęsety, wykonaj nacięcie skóry w pobliżu podstawy kończyny w linii prostej w kierunku łapy. Następnie wykonaj nacięcia wokół całej kończyny, zdejmując skórę podczas obracania kończyny. Po zdjęciu skóry.Cztery kończyny przeznaczone do całego barwienia immunohistochemicznego skóry kończyn należy przygotować wcześniej. Przygotuj trzy probówki o pojemności 50 ml z metanolem w PBT o stężeniach 75%, 50% i 25% do rehydratacji. Skórę, a konkretnie skórę kończyn, rehydratuje się poprzez inkubację w stopniowej serii roztworów metanolu, przechodząc od najwyższego do najniższego stężenia metanolu, po pięć minut w każdym z nich.Aby rozpocząć, przenieś skórę kończyny do pięciomililitrowej polipropylenowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 75% methanol w PBT. Po pięciu minutach na mieszalniku rotacyjnym ostrożnie odessaj 75% methanol i napełnij probówkę 50% methanol i PBT. Odczekaj pięć minut.Zastąp 50% methanol 25% methanol i PBT. Po zakończeniu ostatniej inkubacji ostrożnie odessij 25% methanol PBT i uzupełnij PBT.Przemywaj skóry kończyn przez pięć minut, delikatnie mieszając na mieszalniku mutator w temperaturze pokojowej. Powtórz to płukanie raz. Należy uważać, aby nie uszkodzić skór kończyn podczas wymiany roztworów.Po nawodnieniu skóry kończyn należy zablokować ją odpowiednim buforem blokującym. Inkubować przez dwie godziny przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku rotacyjnym w temperaturze pokojowej. Po dwóch godzinach umieścić skórę kończyn na szalce Petriego o wymiarach 35 × 10 mm. Następnie za pomocą pęsety pierścieniowej przenieść skórę do probówki wirówkowej o pojemności 2 mL zawierającej 800 µL przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w odpowiednim buforze blokującym.W tym kroku można jednocześnie zastosować kilka przeciwciał pierwszorzędowych pochodzących od różnych gatunków. Inkubować skóry kończyn przy delikatnym mieszaniu na mieszalniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc; następnego dnia umieścić skóry kończyn na szalce Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów. Przenieść skóry do pięciomililitrowej polipropylenowej probówki z okrągłym dnem zawierającej cztery litry odpowiedniego buforu piorącego.Przemyj pięć razy przez 15 minut każdego etapu, delikatnie mieszając na mieszalniku rotacyjnym w temperaturze pokojowej. Podczas każdego płukania ostrożnie wymieniaj zużyty bufor na świeży. Przygotuj przeciwciała wtórne, aby usunąć zagregowane cząsteczki przeciwciał wtórnych.Użyj filtra strzykawkowego z membraną PVDF 0,22 µm, aby przefiltrować roztwór przeciwciał wtórnych do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Następnie odwiruj przefiltrowaną próbkę z prędkością 15 000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć cząsteczki i pęcherzyki powietrza. Zbierz przefiltrowany roztwór przeciwciał do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.Po wykonaniu pięciu płukań umieść skóry kończyn na szalce Petriego o wymiarach 35 by 10 milimetrów, a następnie przenieś je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch litrów zawierającej 800 microliters przeciwciał wtórnych w buforze blokującym. Na tym etapie można jednocześnie zastosować różne koniugaty fluorescencyjne przeciwciał wtórnych pochodzących z różnych gatunków. Inkubuj skóry kończyn w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na mieszalniku typu mutator.Po godzinnej inkubacji umieść skóry kończyn na płytce Petriego o wymiarach 35 by 10 milimetrów, a następnie przenieś je do polipropylenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów, zawierającej cztery mililitry odpowiedniego buforu do płukania. Płucz pięciokrotnie przez 15 minut każdorazowo, w ciemności, przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku Tator w temperaturze pokojowej, w celu obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Skóry kończyn muszą zostać zamontowane na szkiełku po przeprowadzeniu barwienia immunohistochemicznego.Aby rozpocząć tę procedurę, umieść zabarwione skóry kończyn na szalce Petriego o wymiarach 35 by 10 milimetrów, pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy niskim natężeniu oświetlenia. Aby uniknąć nadmiernego fotowybielania, użyj precyzyjnej pęsety do usunięcia kryształków kurzu i włókien z wewnętrznej warstwy skór. Przenieś skóry kończyn na przylepne szkiełko mikroskopowe.Umieść skóry na szkiełku przedmiotowym warstwą wewnętrzną skierowaną ku górze, w stronę szkiełka nakrywnego. Następnie ostrożnie wygładź skóry za pomocą precyzyjnej pęsety. Nadmiar buforu płuczącego usuń za pomocą chusteczki Kim wipe.Dodaj medium montażowe Antifade do preparatów skóry i nałóż na nie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 25 by 25. Dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, utwardź preparaty na płaskiej powierzchni w ciemności w temperaturze pokojowej w celu ich długoterminowego przechowywania. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsius.Wzorzec rozmieszczenia nerwów i naczyń krwionośnych w skórze kończyny myszy w stadium E 15.5 przedstawiają reprezentatywne wyniki konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej z potrójnym znakowaniem całego preparatu; immunofluorescencja panendotelialnego markera pcam one jest niebieska. Marker neurofilamentów two H three jest zielony, a marker komórek mięśni gładkich alpha SMA jest czerwony. Obrazy te ujawniły charakterystyczny wzorzec rozgałęzień tętnic wykazujących ekspresję alpha SMA, wskazany białymi grotami strzałek, które przebiegają wzdłuż obwodowych nerwów two H three, wskazanych pustymi strzałkami, oprócz rozgałęzień naczyń krwionośnych.Ten model unaczynienia skóry kończyny może również ujawnić wzorce rozgałęzień naczyń limfatycznych przy użyciu markera komórek śródbłonka limfatycznego LYVE-1 pokazanego na czerwono oraz neuropiliny-2 pokazanej na zielono; naczynia limfatyczne są wizualizowane zarówno za pomocą LYVE-1, jak i NRP-2, podczas gdy LYVE-1 jest również eksprymowane przez podgrupę makrofagów wskazaną pustymi grotami strzałek. Technika ta otwiera przed badaczami w dziedzinie biologii naczyniowej drogę do zgłębiania złożonych wzorców oraz procesów różnicowania unaczynienia podczas rozwoju tkanek, ich regeneracji oraz w stanach chorobowych.

whole-mount-immunohistochemical-analysis-for-embryonic-limb-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza immunohistochemiczna tkanka całopłaszczyznowa naczyń skóry kończyn zarodkowych: system modelowy do badania rozgałęzionej morfogenezy naczyń u zarodków

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Przedstawiamy protokół analizy naczyń wieńcowych w całych embrionalnych sercach myszy do E15.5, przy użyciu standardowych metod barwienia immunologicznego, a następnie klirensu optycznego i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację naczyń krwionośnych w całym sercu bez konieczności czasochłonnej analizy odcinków seryjnych.

Analiza naczyń wieńcowych w oczyszczonych sercach embrionalnych

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Tutaj opisujemy metodę obrazowania w całości w całej skórze ucha dorosłej myszy, która pozwala nam na wizualizację rozgałęzionej morfogenezy i wzoru nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, a także rozmieszczenia komórek odpornościowych.

Mikroskopia konfokalna z pełnym mocowaniem dla skóry ucha osoby dorosłej: modelowy system do badania morfogenezy rozgałęzień nerwowo-naczyniowych i dystrybucji komórek odpornościowych

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Poznaj metodę całościowej immunohistochemii do analizy sieci naczyniowej w skórze kończyn zarodkowych myszy. Technika ta umożliwia szczegółowe obrazowanie morfogenezy naczyń krwionośnych i limfatycznych.

Całościowa analiza immunohistochemiczna naczyń naczyniowych skóry kończyn embrionalnych: modelowy system do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku (Wideo) | JoVE Journal

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Przeglądaj więcej filmów