Name: Badanie neuronalnych podstaw adaptacyjnych zachowań lokomotorycznych u owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę rejestracji aktywności mięśniowej u owadów na śliskiej powierzchni w celu badania neuronalnych mechanizmów adaptacyjnych zachowań lokomotorycznych. Technika EMG umożliwia analizę czasowania mięśni i kinematyczki chodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Michaelowi Dübbertowi, Oliverowi Hoffmannowi, Hansowi Scharsteinowi, Janowi Sydowowi i Anne Wosnitzy za doskonałą pomoc techniczną. Badanie to zostało sfinansowane z grantu DFG Bu 857/8,10 przyznanego A.B.

1. Powierzchnia do chodzenia
Czarna powierzchnia chodni składa się z dwóch niklowanych płyt mosiężnych, trwale połączonych obok siebie i odizolowanych elektrycznie za pomocą paska dwuskładnikowego kleju epoksydowego (UHU plus, UHU GmbH, Niemcy) o szerokości 2mm, znajdującego się bezpośrednio pod osią podłużną zwierzęcia. Tworzą one całkowitą powierzchnię o wymiarach 13,5x15,5cm (Rycina 1). Rozdzielenie półpłaszczyzn dla lewej i prawej nogi umożliwia niezależne monitorowanie kontaktu tarsalnego dla pojedynczej nogi po każdej stronie.
<ol>
<li>Płytkę smaruje się mieszaniną gliceryny i wody w stosunku 95 części gliceryny do 5 części nasyconego roztworu NaCl, aby zapewnić śliskość i przewodność elektryczną; lepkość wynosi około 430cStokes (Shankar and Kumar, 1994).</li>
<li>Mieszaninę nanosi się bezpośrednio na powierzchnię i rozprowadza za pomocą miękkiej chusteczki higienicznej, aby zapewnić całkowitą grubość 0,1-0,2mm.</li>
</ol>
2. Konfiguracja stymulacji optycznej
<ol>
<li>Epizody chodzenia są wywoływane przy użyciu dwóch projektorów, zgodnie z opisem Scharsteina (1989), w celu wyświetlenia pasiastego wzoru na dwóch okrągłych ekranach z matowego szkła (średnica 130mm, ekrany Marata, Linos Photonics, Göttingen, Niemcy) umieszczonych w odległości ok. 70mm od oczu, pod kątem 45° po lewej i prawej stronie z przodu płyty (Rys.1). Długość fali pasiastego wzoru pozostaje stała na poziomie λ=21°. Częstotliwość kontrastu ruchomych bodźców może być zmieniana między 0.35, 0.72, 1.07 a 1.49Hz. Ponieważ reakcja zwierząt zależy wyłącznie od częstotliwości kontrastu ω/λ (ω = prędkość kątowa, λ = długość fali wzoru), pod warunkiem że kontrast wzoru jest wystarczająco wysoki (Fermi i Reichhardt, 1963), nie zmienialiśmy λ w trakcie eksperymentów. Luminancja jasnych pasów po stronie zwierzęcia wynosi około 15cd/m2, a kontrast 0.8. Oko złożone patyczaka (Carausius morosus) posiada 24 ommatidia w osi grzbietowo-brzusznej (Friza, 1928) i nieco więcej w osi rostro-kaudalnej. Ponieważ kąt dywergencji oka patyczaka wynosi średnio 6.2° (Jander i Volk-Henrichs, 1970), długość fali naszego wzoru była około 4 razy większa niż kąt ommatidiów. Eksperymenty są przygotowane w zaciemnionej klatce Faradaya i przeprowadzane w zaciemnionym pomieszczeniu w temperaturze 20-22°C.</li>
<li>Chodzenie do przodu jest indukowane przez progresywny wzór na obu ekranach, w którym pasy na każdym ekranie poruszają się na zewnątrz, lub przez pojedynczą czarną wiązkę na białym tle umieszczoną pomiędzy ekranami.</li>
<li>Skręcanie jest indukowane przez pasy poruszające się w tym samym kierunku na obu ekranach. Nie stwierdzono korelacji między prędkością poruszających się pasów a kątem skrętu. Po ustawieniu luminancji pasiastego wzoru w celu wywołania chodzenia, zazwyczaj nie wymaga ona dalszej regulacji, jednak może być ona dostosowywana dla różnych zwierząt w zależności od potrzeb poprzez zmianę napięcia lamp halogenowych w projektorach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierzęcia doświadczalnego
<ol>
<li>Dorosłe samice patyków (Carausius morosus) są przyklejane (cement dentystyczny, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Niemcy) stroną brzuszną do cienkiego patyczka z balsy (3x5x100mm, SzxWxD), który jest włożony do mosiężnej rurki posiadającej wiele złączy. Zwierzę jest przytrzymywane przez około minutę, aż klej przynajmniej częściowo stwardnieje.</li>
<li>Głowa i odnóża wystają z przodu i z boków kołka, aby umożliwić im swobodny ruch. Obszart coxae wszystkich nóg, jak również większa część odwłoka, muszą pozostać wolne od kleju.</li>
<li>Głowa, klatka piersiowa owada oraz dystalne końce każdego uda i goleni są znakowane pigmentami fluorescencyjnymi (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Niemcy) zmieszanymi z cementem dentystycznym w celu późniejszego śledzenia wideo.</li>
</ol>
4. Umieszczenie elektrod EMG
Aktywność mięśniową różnych mięśni kończyn, takich jak w tym przykładzie mięsień protraktor i retraktor coxae, które znajdują się w klatce piersiowej i odpowiadają za protrakcję (ruch do przodu) oraz retrakcję (ruch do tyłu) kończyny, rejestruje się za pomocą elektrod EMG implantowanych w klatce piersiowej. Wszystkie zapisy EMG są wzmacniane różnicowo. Sygnał został wzmocniony 100-krotnie we wzmacniaczu wstępnym (warsztat elektroniki, Instytut Zoologii, Kolonia), przefiltrowany filtrem pasmowym (100Hz-2000Hz), ponownie wzmocniony (10-krotnie) i wprowadzony za pomocą przetwornika AD do programu spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK).
<ol>
<li>Elektrody wykonuje się z powlekanych miedzianych drutów (Elektrisola, Eckernhagen, Niemcy; średnica zewnętrzna 47μm). Aby przygotować jedną elektrodę, dwa druty smaruje się najpierw klejem, a następnie dwa lepkie druty skręca się ze sobą</li>
<li>Na jednym końcu skręcone końce drutów przylutowuje się do miniwtyczki. Na drugim końcu druty przycina się, aby uzyskać czyste końce bez izolacji do wprowadzenia do organizmu zwierzęcia. </li>
<li>Elektrody EMG wpina się do małego złącza znajdującego się na końcu mosiężnej rurki.</li>
<li>Do wykonania małych otworów w kutykuli używa się cienkiej szpilki</li>
<li>Przycięte końce elektrody rozdziela się i wprowadza do mięśnia w odstępie około 1mm od siebie, co w naszym doświadczeniu zapewnia korzystny stosunek sygnału do szumu. Należy uważać, aby nie wprowadzać elektrod zbyt głęboko w mięsień, aby uniknąć jego uszkodzenia. Rysunek 2 przedstawia rozmieszczenie elektrod w klatce piersiowej zwierzęcia. Rysunek 3 przedstawia zwierzę z wprowadzonymi drutami elektrod.</li>
<li>Do stabilizacji drutów używamy małej kropli kleju histoakrylowego (3M Vetbond, St.Paul, MN, USA). </li>
<li>Przewód uziemiający wprowadza się do jamy brzusznej.</li>
</ol>
5. Rejestracja kontaktu stępu
Kontakt nadgarstkowy jest zawsze rejestrowany wraz z zapisami EMG. Ponieważ śliska powierzchnia jest podzielona na dwie połowy, jednocześnie można zarejestrować maksymalnie dwa przeciwstawne kontakty nadgarstkowe. W tym celu noga służy jako „przełącznik” zamykający obwód między płytką a wzmacniaczem. Prąd może być doprowadzony do płytek oddzielnie poprzez dwa gniazda u podstawy każdej płytki. Za pomocą generatora impulsów (Model MS501, warsztat elektroniczny, Instytut Zoologii, Kolonia) możemy wygenerować dwa sygnały prostokątne o amplitudach 2-4mV z przesunięciem fazowym o 90°. Sygnały te są tłumione o 60dB (/1000) i przyłożone do dwóch połówek śliskiej powierzchni. W tym eksperymencie wykorzystujemy tylko jeden z dwóch sygnałów. Jest on jednocześnie podawany do wzmacniacza lock-in jako sygnał referencyjny. 2-fazowy wzmacniacz lock-in (warsztat elektroniczny, Instytut Zoologii, Kolonia) selektywnie wzmacnia tylko sygnały o tej samej częstotliwości i fazie co dostarczony sygnał referencyjny. Drugi kanał wykrywa wyłącznie sygnał przesunięty w fazie o 90°. Sygnały szumów o częstotliwościach innych niż częstotliwość referencyjna są odrzucane i nie wpływają na pomiar. Sygnał wyjściowy wzmacniacza jest podawany do przetwornika AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) i digitalizowany za pomocą programu Spike2. Między momentem dotknięcia a oderwaniem nadgarstka od śliskiej powierzchni prąd płynie z płytki przez nadgarstek i golень do miedzianego drutu (patrz poniżej: 5.3-5.8). Wybrany wzmacniacz posiada wysoką rezystancję wejściową (1MΩ), a napięcie sygnału jest bardzo małe, aby uniknąć wpływu na zachowanie chodu zwierzęcia. Natężenie prądu przepływającego przez nadgarstek i golень wynosi od 2 do 4nA. Czas przejścia sygnału podczas dotknięcia, pomiędzy wejściem w lubrykant a kontaktem z powierzchnią, wynosi mniej niż 1ms. Przejście sygnału kontaktu podczas odrywania jest mniej strome i bardziej opóźnione. Wynika to z opóźnionego zerwania filmu lubrykantu z nadgarstka wskutek efektu podciągania kapilarnego oraz z ruchu nogi bez pełnego oderwania w fazie przenoszenia.
<ol>
<li>Mosiężną rurkę z patyczkiem z balsy, do którego przyklejone jest zwierzę, umieszcza się w mikromanipulatorze, aby umożliwić regulację wysokości zwierzęcia w zakresie od 7 do 12mm nad śliską powierzchnią, co odpowiada wysokości podczas swobodnego chodzenia.</li>
<li>W celu pomiaru przepływu prądu w każdym momencie, gdy tarsus owada monitorowanej nogi styka się z podłożem, drut (średnica 47μm) tnie się na kawałki o długości około 15cm.</li>
<li>Izolację miedzianego drutu usuwa się poprzez wypalenie go alkoholem.</li>
<li>Z jednego końca drutu tworzy się pętlę, którą nasuwa się na tarsus zwierzęcia.</li>
<li>Pętlę zawiązuje się na dystalnym końcu goleni, aby zapewnić dobry kontakt między zwierzęciem a drutem.</li>
<li>Następnie drut mocuje się na tułowiu zwierzęcia kroplą kleju dwuskładnikowego (ProTempII, patrz wyżej) i podłącza do wzmacniacza różnicowego za pomocą zacisku typu krokodylk.</li>
<li>Aby poprawić przewodność drutu na jego końcach, w miejscach styku nakłada się kroplę kremu do elektrod (Marquette Hellige, Freiburg, Niemcy).</li>
<li>Następnie na monitorze sprawdza się siłę sygnału. Ze względu na właściwości filtra dolnoprzepustowego wzmacniacza lock-in (stała czasowa 10ms) oraz stopniowe odrywanie i dotykanie podłoża przez tarsus, sygnał nie jest idealnym sygnałem prostokątnym. Należy zatem ustawić odpowiednie progi blisko punktu przejścia, aby określić dokładny czas kontaktu tarsusu, a następnie ręcznie sprawdzić każde zdarzenie określone przez oprogramowanie do digitalizacji. Na podstawie kontaktu tarsusu zdefiniowaliśmy czas, w którym tarsus danej nogi znajdował się na ziemi, jako fazę podporową (stance), a czas, w którym znajdował się w powietrzu, jako fazę przenoszenia (swing phase).</li>
<li>Sygnał wyzwalający dla kamery jest rejestrowany jednocześnie ze śladem EMG i sygnałem kontaktu tarsusu, co pozwala na precyzyjną korelację zachowania i zarejestrowanych śladów klatka po klatce.</li>
</ol>
6. Optyczna rejestracja ruchów kończyn do analizy cyfrowej
Częstotliwość kroków patamorfid na śliskich powierzchniach może osiągać 3-4Hz (Graham and Cruse, 1981).
<ol>
<li>Przed nagraniem sekwencji chodu za zwierzęciem, pod kątem 45°, umieszcza się lustro, aby zapewnić dodatkowy monitor wizualny dla momentu kontaktu stopy z podłożem. Kamera jest wyzwalana zewnętrznie, a obrazy są przesyłane do komputera PC poprzez interfejs FireWire.</li>
<li>Sekwencje chodu rejestrujemy z góry za pomocą szybkiej kamery wideo (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Niemcy) przy 100fps, aby cyfrowo analizować ruchy kończyn i korelować je z aktywnością EMG oraz kontaktem nadgarstkowym.</li>
<li>Podczas nagrywania sekwencji chodu zwierzę jest oświetlane niebieskimi matrycami LED (30-50V DC, luminancja 24cd, Electronics Workshop, Instytut Zoologii Uniwersytetu w Kolonii), których natężenie jest dostosowane tak, aby oświetlić znaczniki fluorescencyjne. Zgodnie z literaturą (Schlegtendal, 1934), patykowce nie posiadają widzenia barwnego i nie zaobserwowaliśmy negatywnego wpływu oświetlenia światłem UV na reakcję zwrotną. Żółty filtr przed obiektywem kamery tłumi krótką falę światła aktywacyjnego i zapewnia wyższy kontrast nagrań wideo.</li>
<li>Pliki wideo można analizować za pomocą oprogramowania do śledzenia ruchu (WINanalyze, wersja 1.9, Mikromak service, Berlin, Niemcy).</li>
</ol>
7. Rejestracja sekwencji chodu
<ol>
<li>W ramach kontroli w pierwszej kolejności rejestruje się sekwencję chodu zwierzęcia nienaruszonego.</li>
<li>Ustawia się prędkość prążkowanego wzoru, a następnie niemal jednocześnie uruchamia wzór oraz nagrywanie wideo.</li>
<li>Jeśli zwierzę nie zacznie poruszać się spontanicznie, można je pobudzić, dotykając pędzelkiem odwłoka (Bässler and Wegener, 1983) lub kierując strumień powietrza na czułki. W takim przypadku zwierzęta dotknięte po lewej stronie odwłoka mają tendencję do skręcania w lewo i na odwrót. Prążkowany wzór pozostaje w ruchu, dopóki zwierzę nie przestanie chodzić lub aż do momentu zakończenia 3 minut ciągłego nagrywania.</li>
<li>Aby sprawdzić, w jakim stopniu aktywność mięśniowa w jednej nodze zależy od sygnałów sensorycznych z nóg sąsiednich, indukuje się u zwierzęcia autotomię nóg. Miejsce autotomii zamyka się naturalnie w ciągu kilku sekund. Przykład zwierzęcia z autotomizowanymi nogami przednimi i tylnymi przedstawiono na Rysunku 3.</li>
<li>Na przykład w przypadku eksperymentów ze zwierzętami posiadającymi tylko jedną nogę środkową, indukujemy autotomię nóg przedpiersiowych i zawisłopiersiowych poprzez uciśnięcie bliższej części uda pęsetą (Schmidt and Grund, 2003) lub odcinamy nogi na poziomie poziomego stawu biodrowego po wcześniejszym zarejestrowaniu chodu zwierzęcia nienaruszonego. Następnie zwierzęciu zapewnia się minimum 30 min czasu na regenerację.</li>
<li>Następnie rejestrujemy nowe sekwencje chodu w sposób opisany wcześniej. W przypadku preparatów zredukowanych często konieczne jest indukowanie chodu za pomocą pociągnięć pędzelka.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig1.jpg" alt="Układ eksperymentalny dla badania ekspozycji na światło z EMG, wzmacniaczem lock-in, schemat blokowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ eksperymentalny; A: fotografia patyczaka unieruchomionego nad śliską powierzchnią, znakowanego pigmentami fluorescencyjnymi w celu śledzenia ruchu odnóży oraz z podłączonymi elektrodami do rejestracji EMG i pomiaru kontaktu tarsalnego. B: schemat połączeń dla dwukanałowej rejestracji kontaktu tarsalnego odnóży podczas chodzenia po śliskiej powierzchni.
<img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig2.jpg" alt="Schemat anatomii nogi owada, pokazujący mięsień retraktora, protraktora, stronę grzbietową, brzuszną, skala 5mm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Pozycje rozmieszczenia elektrod EMG w mięśniach protraktora i retraktora w klatce piersiowej środkowej nogi patyczaka. ML: środkowa noga; FL: przednia noga
<img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig3.jpg" alt="Układ do elektromiografii na nodze owada; elektrody EMG w mięśniach prostowniku i zginacza do badań." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Patyczak z umieszczonymi przewodami EMG w mięśniach prostowniku i zginacza środkowej nogi; przednie i tylne nogi zostały usunięte, aby zbadać wpływ obecności sąsiednich nóg na kinematykę i aktywność mięśniową nóg środkowych w uproszczonym preparacie.
<img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig4.jpg" alt="Schemat elektromiografii (EMG) przedstawiający fazy kroków i stany obwodu podczas analizy ruchu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykładowy zapis aktywności EMG mięśnia retraktora wraz z sygnałem referencyjnym kontaktu stopniowego w środkowej nodze wewnętrznej podczas skrętu. Na początku zapisu (pierwsza niebieska ramka) retractor jest aktywny podczas fazy podporowej, gdy noga ma kontakt z podłożem („obwód zamknięty”), co wskazuje na wykonywanie kroków do przodu; po krótkiej zmianie (druga niebieska ramka) retractor jest aktywny podczas fazy przenoszenia, gdy noga znajduje się w powietrzu („obwód otwarty”, trzecia niebieska ramka), co świadczy o wystąpieniu kroków skierowanych do tyłu.
<img src="/files/ftp_upload/2629/2629fig5.jpg" alt="Analiza sygnału w oknie oprogramowania; wykres przebiegu; przetwarzanie danych akustycznych; wzorzec fali dźwiękowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Zrzut ekranu z zapisu aktywności mięśnia prostownika (górna ścieżka) i mięśnia cofającego (środkowa ścieżka) oraz jednocześnie zarejestrowanego sygnału kontaktu nadgarstka (dolna ścieżka). Zwróć uwagę na naprzemienną aktywność w ścieżkach EMG, która odpowiada aktywności obu mięśni w cyklu kroku: aktywności prostownika tuż przed i podczas fazy przenoszenia, gdy sygnał kontaktu nadgarstka wskazuje utratę kontaktu z podłożem, oraz aktywności mięśnia cofającego po i podczas kontaktu nadgarstka z podłożem, gdy noga znajduje się w fazie podporu. Wstawka przedstawia odpowiadający temu zapisowi plik wideo, służący do weryfikacji zachowania zwierzęcia.

<ol><li>Bässler, U., Wegener, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+output+of+the+denervated+thoracic+ventral+nerve+cord+in+the+stick+insect+Carausius+morosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor output of the denervated thoracic ventral nerve cord in the stick insect Carausius morosus.</a> J. Exp. Biol. 105, 127-147 (1983).</li>
<li>Böhm, H., Messai, E., Heinzel, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+command+fibres+in+free-ranging+crayfish%2C+Orconectes+limosus+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Activity of command fibres in free-ranging crayfish, Orconectes limosus Raf.</a> Naturwissenschaften. 84, 408-410 (1997).</li>
<li>Büschges, A., Gruhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+feedback+in+walking%3A+from+joint+control+to+locomotor+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory feedback in walking: from joint control to locomotor pattern.</a> Adv.Insect Physiology. 34, 194-234 (2008).</li>
<li>Büschges, A., Akay, T., JP, G. abriel, Schmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+network+action+for+locomotion%3A+insights+from+studying+insect+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Organizing network action for locomotion: insights from studying insect walking.</a> Brain Res Rev. 57, 162-171 (2008).</li>
<li>Camhi, J. M., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+a+complex+movement%3A+fixed+and+variable+components+of+the+cockroach+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Organization of a complex movement: fixed and variable components of the cockroach escape behavior.</a> J Comp Physiol A. 163, 317-328 (1988).</li>
<li>Camhi, J. M., Nolen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+escape+system+of+cockroaches+during+walking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Properties of the escape system of cockroaches during walking.</a> J Comp Physiol A. 142, 339-346 (1981).</li>
<li>Clarac, F., Libersat, F., Pflüger, H. J., Rathmayer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+pattern+analysis+in+the+shore+crab+%28Carcinus+maenas%29+walking+freely+in+water+and+on+land%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor pattern analysis in the shore crab (Carcinus maenas) walking freely in water and on land.</a> J Exp Biol. 133, 395-414 (1987).</li>
<li>Duch, C., Pflüger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+patterns+for+horizontal+and+upside+down+walking+and+vertical+climbing+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor patterns for horizontal and upside down walking and vertical climbing in the locust.</a> J Exp Biol. 198, 1963-1976 (1995).</li>
<li>Fermi, G., Reichhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optomotorische+Reaktionen+der+Fliege+Musca+domestica.+Abh%C3%A4ngigkeit+der+Reaktion+von+der+Wellenl%C3%A4nge%2C+der+Geschwindigkeit%2C+dem+Kontrast+und+der+mittleren+Leuchtdichte+bewegter+periodischer+Muster%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Optomotorische Reaktionen der Fliege Musca domestica. Abhängigkeit der Reaktion von der Wellenlänge, der Geschwindigkeit, dem Kontrast und der mittleren Leuchtdichte bewegter periodischer Muster.</a> Kybernetik. 2, 15-28 (1963).</li>
<li>Fischer, H., Kautz, H., Kutsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radiotelemetric+2-channel+unit+for+transmission+of+muscle+potentials+during+free+flight+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A radiotelemetric 2-channel unit for transmission of muscle potentials during free flight of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> J Neurosci Methods. 64, 39-45 (1996).</li>
<li>Friza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Frage+der+F%C3%A4rbung+und+Zeichnung+des+facettierten+Insektenauges%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschr.+f.+vergl.+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Zur Frage der Färbung und Zeichnung des facettierten Insektenauges.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 8, 289-336 (1928).</li>
<li>Götz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+optomotor+reactions+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Bibl.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Principles of optomotor reactions in insects.</a> Bibl. Ophthalmol. 82, 251-2559 (1972).</li>
<li>Gruhn, M., Rathmayer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+electrode+design+for+both+chronic+in+vivo+nerve+recording+and+axon+stimulation+in+freely+behaving+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An implantable electrode design for both chronic in vivo nerve recording and axon stimulation in freely behaving crayfish.</a> J Neurosci Methods. 118, 33-40 (2002).</li>
<li>Gruhn, M., Hoffmann, O., Dübbert, M., Scharstein, H., Büschges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+stick+insect+walking%3A+a+modified+slippery+surface+setup+with+optomotor+stimulation+and+electrical+monitoring+of+tarsal+contact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Tethered stick insect walking: a modified slippery surface setup with optomotor stimulation and electrical monitoring of tarsal contact.</a> J Neurosci Methods. 158, 195-206 (2006).</li>
<li>Gruhn, M., Zehl, L., Büschges, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straight+walking+and+turning+on+a+slippery+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Straight walking and turning on a slippery surface.</a> J Exp Biol. 212, 194-209 Forthcoming.</li>
<li>Gruhn, M., Uckermann, G. von, Westmark, S., Wosnitza, A., Büschges, A., Borgmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stepping+velocity+in+the+stick+insect+Carausius+morosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Control of stepping velocity in the stick insect Carausius morosus.</a> J Neurophysiol. 102, 1180-1192 Forthcoming.</li>
<li>Hama, N., Tsuchida, Y., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+context-dependent+modulation+of+descending+statocyst+pathways+during+free+walking%2C+as+revealed+by+optical+telemetry+in+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Behavioral context-dependent modulation of descending statocyst pathways during free walking, as revealed by optical telemetry in crayfish.</a> J Exp Biol. 210, 2199-2211 (2007).</li>
<li>Hassenstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+die+Wahrnehmung+der+Bewegung+von+Figuren+und+unregelm%C3%A4%CE%B2igen+Helligkeitsmustern+%28nach+verhaltensphysiologischen+Untersuchungen+an+dem+R%C3%BCsselk%C3%A4fer+Chlorophanus+viridis%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschr.+f.+vergl.+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Über die Wahrnehmung der Bewegung von Figuren und unregelmäβigen Helligkeitsmustern (nach verhaltensphysiologischen Untersuchungen an dem Rüsselkäfer Chlorophanus viridis.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 40, 556-592 (1958).</li>
<li>Jander, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Untersuchungen+zum+Mechanismus+und+zur+zentralnerv%C3%B6sen+Steuerung+des+Kurvenlaufs+bei+Stabheuschrecken+%28Carausius+morosus%29+%5B%5D%22">Untersuchungen zum Mechanismus und zur zentralnervösen Steuerung des Kurvenlaufs bei Stabheuschrecken (Carausius morosus) [dissertation]</a>. , Universität Köln. Köln. (1982).</li>
<li>Jander, R., Volk-Henrichs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+strauch-spezifische+Perzeptorsystem+der+Stabheuschrecke+%28Carausius+morosus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschr.+f.+vergl.+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Das strauch-spezifische Perzeptorsystem der Stabheuschrecke (Carausius morosus).</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 70, 425-447 (1970).</li>
<li>Kirschfeld, K. The resolution of lens and compound eyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirschfeld%2C+K+%22Neural+Principles+in+Vision%22">Neural Principles in Vision</a>. Zettler, F., Weiler, R. , Springer Verlag. Berlin. 354-370 (1976).</li>
<li>Kutsch, W., Schwarz, G., Fischer, H., Kautz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+transmission+of+muscle+potentials+during+free+flight+of+a+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Wireless transmission of muscle potentials during free flight of a locust.</a> J Exp Biol. 185, 367-373 (1993).</li>
<li>A universal projector for optomotor stimulation. Scharstein, H. 17th Göttingen Neurobiology Conference, Göttingen, Germany, , (1985).</li>
<li>Schlegtendal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrag+zum+Farbensinn+der+Arthropoden%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschr.+f.+vergl.+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Beitrag zum Farbensinn der Arthropoden.</a> Zeitschr. f. vergl. Physiologie. 20, 573-581 Forthcoming.</li>
<li>Schmidt, J., Grund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+activity+in+a+motor+axon+induced+by+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Rhythmic activity in a motor axon induced by axotomy.</a> Neuroreport. 14, 1267-1271 (2003).</li>
<li>Shankar, P. N., Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Determination+of+the+Kinematic+Viscosity+of+Glycerol-Water+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Mathematical+and+Physical+Sci%22%5BJournal%5D)">Experimental Determination of the Kinematic Viscosity of Glycerol-Water Mixtures.</a> Proc. Mathematical and Physical Sci. 444, 573-581 (1994).</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach+I.+Kinematics+and+electromyograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach I. Kinematics and electromyograms.</a> J Neurophysiol. 83, 3323-3336 Forthcoming.</li>
<li>Tryba, A. K., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Joint+coordination+during+walking+and+foothold+searching+in+the+Blaberus+cockroach.+II.+Extensor+motor+neuron+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multi-Joint coordination during walking and foothold searching in the Blaberus cockroach. II. Extensor motor neuron pattern.</a> J Neurophysiol. 83, 3337-3350 Forthcoming.</li>
<li>Tsuchida, Y., Hama, N., Takahata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+telemetry+system+for+underwater+recording+of+electromyogram+and+neuronal+activity+from+non-tethered+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optical telemetry system for underwater recording of electromyogram and neuronal activity from non-tethered crayfish.</a> J Neurosci Methods. 137, 103-109 (2004).</li>
<li>Wang, H., Ando, N., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+control+of+free+flight+maneuvers+in+a+hawkmoth%2C+Agrius+convolvuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Active control of free flight maneuvers in a hawkmoth, Agrius convolvuli.</a> J Exp Biol. 211, 423-432 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisaliśmy układ, który umożliwia optycznie indukowane generowanie zachowań skręcania i w dużym stopniu pozwala na oddzielenie neuronalnie generowanej aktywności chodu od pasywnych efektów wywołanych mechanicznym przemieszczeniem pozostałych kończyn chodzących na podłożu. Z drugiej strony, wciąż możliwy jest potencjalny przepływ informacji między nogami poprzez układ nerwowy w odniesieniu do sił reakcji podłoża lub kontaktu trzonka, co pozwala eksperymentatorowi badać wpływ takich informacji w uproszczonym preparacie. Głównymi zaletami układu z zastosowaniem śliskiej powierzchni jest fakt, że zwierzęta wykazują bardzo wysoką tendencję do chodzenia, a w przeciwieństwie do chodzenia lub stawiania kroków na kołowrotku, zwierzę może wykonywać ruchy fazy przenoszenia i podparcia we wszystkich kierunkach naturalnego chodu. Dodatkowo stopnie swobody wszystkich nóg pozwalają zwierzęciu na chodzenie po łuku, niezależnie od tego, czy jest to preparat nienaruszony, czy częściowo naruszony. Ponieważ nogi nie mogą być pasywnie poruszane jedynie przez ruch zwierzęcia do przodu lub ruch podłoża pod nim, każdy ruch odzwierciedla wyjście motoryczne danej kończyny (Cruse, 1976; Graham and Wendler, 1981). Układ ten jest wysoce odpowiedni do badania neuronalnych podstaw zachowań adaptacyjnych, takich jak skręcanie czy chodzenie do przodu w przeciwieństwie do chodzenia do tyłu, ponieważ można w nim połączyć rejestrację elektrofizjologiczną aktywności motorycznej z analizą kinematyki ruchu kończyn.
Wykorzystaliśmy odpowiedź optomotoryczną patyczaka do wywołania chodu. Reakcje zwierząt na obracający się wzór pasowy wykazały ich gotowość do wykonywania chodu po łuku podczas bycia przywiązanym nad śliską powierzchnią. Co dla nas najbardziej zaskakujące, pojedyncze odnóża w preparatach jednonóż jakościowo wykazują taki sam wzorzec ruchu, jak w nienaruszonym organizmie. Mamy zatem podstawy sądzić, że kontrola chodu po łuku może funkcjonować w dużej mierze bez koordynującego dopływu sygnałów sensorycznych z sąsiednich odnóży. W dalszych eksperymentach istotne będzie sprawdzenie, czy aktywność neuronów ruchowych usuniętych odnóży jest również wpływana przez wzorzec optomotoryczny. Układ ten można łatwo zmodyfikować, aby umożliwić badanie innych zadań, takich jak chód prosto naprzód i do tyłu, poprzez umieszczenie pojedynczego pasa przed zwierzęciem lub delikatne pociąganie za czułki.
Precyzyjny pomiar kontaktu z podłożem pozwala na korelację aktywności mięśniowej z pozycją kończyny. Wysoka rozdzielczość czasowa tego sygnału kontaktu elektrycznego wynosi poniżej 1ms i dostarcza nowych informacji na temat czasu przejścia z fazy przenoszenia do fazy podporu. Rozdzielczość jest gorsza w przypadku przejścia z fazy podporu do fazy przenoszenia ze względu na opóźnienie w ścinaniu przewodzącego środka smarnego oraz brak konieczności całkowitego oderwania stopy podczas protrakcji na śliskiej powierzchni. Niemniej jednak, wiedza na temat precyzyjnego przejścia z fazy przenoszenia do fazy podporu jest szczególnie użytecznym pierwszym krokiem, jeśli chcemy zrozumieć mechanizmy kontrolujące czas aktywacji mięśni oraz skoordynowaną aktywność mięśni kończyn w różnych kontekstach behawioralnych (zob. również: Büschges et al., 2008; Büschges &amp; Gruhn 2008).
Jako przykład wykorzystaliśmy mięsień retraktora i protraktora coxae nogi środkowej, precyzyjnie korelując jego aktywność z przejściem z fazy przenoszenia do fazy podparcia, jednocześnie monitorując kontekst behawioralny, w jakim noga była używana. W tym celu wywołaliśmy chód i stale rejestrowaliśmy aktywność mięśniową. Dana noga może być nogą wewnętrzną lub zewnętrzną, w zależności od kierunku skrętu. W przypadku kroczącej nogi środkowej, pełniącej w sensie funkcjonalnym rolę nogi wewnętrznej, można zaobserwować, że zarówno mięśnie retraktora, jak i protraktora mogą działać jako funkcjonalne mięśnie fazy podparcia, ponieważ noga okresowo wykonuje kroki do tyłu oprócz kroków skierowanych do przodu (patrz Ryc.4).
Elektromiogramy (EMG) z obu mięśni zostały poddane rektyfikacji i normalizacji względem czasu kontaktu z podłożem (touch-down), a następnie obliczono latencję pierwszych impulsów mięśniowych. Co ciekawe, latencje obu mięśni w stosunku do momentu oderwania (lift-off) i kontaktu z podłożem zależą od funkcji mięśnia jako odpowiednio mięśnia fazy przeniesienia lub fazy podparcia (patrz Rys. 4), a nie od samego mięśnia, i wykazują jedynie niewielkie zmiany w czasie rozpoczęcia aktywności. Większość wyjaśnień dotyczących zmiany stanu z fazy przeniesienia na fazę podparcia zakłada, że sygnały sensoryczne z kontaktu tarsów inicjują rozpoczęcie fazy podparcia. Dzięki zmodyfikowanej aparaturze można teraz odpowiedzieć na interesujące pytanie, w jaki sposób powstają krótkie latencje między kontaktem z podłożem a aktywacją mięśni u patyczaka oraz od jakich informacji sensorycznych one zależą.
Podsumowując, prezentujemy układ z poślizgową powierzchnią, który pozwala nam w sposób niezawodny wywołać chód prosty i zakrętowy u nieruchomych patyczaków. Kinematykę, aktywność mięśni oraz czas kontaktu i oderwania tarsów od podłoża można monitorować i korelować jednocześnie w dwóch różnych kontekstach behawioralnych. Stanowi to doskonałe narzędzie do szczegółowego badania związku między aktywnością mięśni a kontekstem behawioralnym dla pojedynczej kończyny, jak również w całym organizmie, a także do analizy mechanizmów leżących u podstaw tych zjawisk.

<table><tbody><tr><td>dwuskładnikowy klej epoksydowy</td><td>UHU plus, UHU GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ekrany szklane (średnica 130 mm)</td><td>Linos Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cement stomatologiczny</td><td>ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, Niemcy</td><td>Nr ID 3M: 70-2011-0358-0 Numer katalogowy: 46430</td><td>Dostępny za pośrednictwem 3M (&lt;a href=&quot;http://www.3m.com/">http://www.3m.com/&lt;/a&gt;) lub dostawców sprzętu stomatologicznego</td></tr><tr><td>pigmenty fluorescencyjne</td><td>Dr. Kremer Farbm&amp;uuml;hle, Aichstetten, Niemcy</td><td>Nr kat.: np. 56200 Pigment Fluorescencyjny Żółty Złoty, 56350 Pigment Fluorescencyjny Czerwony Płomienny</td><td>&lt;a href=&quot;http://kremer-pigmente.de/en">http://kremer-pigmente.de/en&lt;/a&gt; lub &lt;a href=&quot;http://www.kremerpigments.com/">http://www.kremerpigments.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>klej histoakrylowy</td><td>3M</td><td></td><td>dostawca: WPI</td></tr><tr><td>izolowany drut miedziany</td><td>Elektrisola Eckernhagen</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.elektrisola.com/">http://www.elektrisola.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>pasta elektrodowa</td><td>Marquette Hellige, Fryburg, Niemcy</td><td></td><td>Produkt został wycofany z produkcji, sugerujemy na przykład: &lt;a href=&quot;http://www.grasstechnologies.com">www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>generator impulsów</td><td>Model MS501, warsztat elektroniczny, Instytut Zoologii, Kolonia, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wzmacniacz lock-in</td><td>Instytut Zoologii</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przetwornik AD</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przedwzmacniacz</td><td>Instytut Zoologii</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szybka kamera wideo</td><td>Allied Vision Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>macierze LED UV</td><td>Instytut Zoologii</td><td></td><td>30-50 V DC, warsztat elektroniczny&lt;br/&gt;
&amp;#955; 390-395 nm&lt;br/&gt;Jasność 24 cd</td></tr><tr><td>oprogramowanie do digitalizacji Spike2</td><td>Vers. 5.05, CED, Cambridge, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do śledzenia ruchu</td><td>Mikromak service, Berlin, Niemcy</td><td>WINanalyze, Vers. 1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Badając neuronowe podstawy zachowania chodu, często napotyka się problem polegający na trudności w oddzieleniu wygenerowanego przez neurony wyjścia krokowego od tych ruchów kończyn, które wynikają z sił pasywnych i interakcji z innymi nogami poprzez wspólny kontakt z podłożem. Jeśli chcemy zrozumieć, która część danego ruchu jest wynikiem wyjścia motorycznego układu nerwowego, analiza kinematyczna ruchów krokowych musi zatem zostać uzupełniona o elektrofizjologiczne rejestracje aktywności motorycznej. Rejestracja aktywności neuronalnej lub mięśniowej u zwierzęcia w trakcie zachowania jest często ograniczona przez sprzęt elektrofizjologiczny, który może krępować zwierzę i ograniczać jego zdolność do poruszania się z jak największą liczbą stopni swobody. Można tego uniknąć stosując elektrody implantowalne i pozwalając zwierzęciu na poruszanie się na długiej smyczy (np. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pflüger, 1995; Böhm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) lub przesyłając dane za pomocą urządzeń telemetrycznych (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Obie te eleganckie metody, z powodzeniem stosowane u większych stawonogów, często okazują się trudne do zastosowania u mniejszych owadów chodzących, które albo łatwo zaplątują się w długą smycz, albo są ograniczane przez wagę urządzenia telemetrycznego i jego baterii. Ponadto we wszystkich tych przypadkach nadal niemożliwe jest odróżnienie czystych neuronowych podstaw lokomocji od efektów wywołanych przez sprzężenie mechaniczne między nogami kroczącymi poprzez podłoże. Jednym z rozwiązań tego problemu jest przeprowadzenie eksperymentów na zwierzęciu unieruchomionym, które może swobodnie maszerować w miejscu i jest lokalnie zawieszone, na przykład nad śliską powierzchnią, co skutecznie eliminuje większość mechaniki kontaktu z podłożem. Metoda ta była wykorzystywana do badania reakcji ucieczkowych (Camhi i Nolen, 1981; Camhi i Levy, 1988), obracania się (Tryba i Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), chodu wstecznego (Graham i Epstein, 1985) lub zmian prędkości (Gruhn et al., 2009b) i pozwala ona badaczowi na łatwe łączenie fizjologii wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej z analizami kinematycznymi (Gruhn et al., 2006).
Wykorzystujemy układ z poślizgową powierzchnią, aby zbadać czas aktywacji mięśni nóg u poruszającej się patykowej w odniesieniu do momentu kontaktu z podłożem i oderwania nogi w różnych paradygmatach behawioralnych, takich jak chodzenie na wprost i po łuku, w preparatach nienaruszonych oraz zredukowanych.

Opisujemy metodę rejestracji aktywności motorycznej, zsynchronizowaną z elektrycznie rejestrowanym sygnałem kontaktu stopowego u uwięzionego owada chodzącego po śliskiej powierzchni. Metoda ta jest wykorzystywana do badania neuronalnych podstaw adaptacyjnego zachowania przy zredukowanym wpływie oddziaływań mechanicznych między odnóżami a podłożem.

Badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Podczas badania neuronalnych podstaw zachowania związanych z chodzeniem często pojawia się problem polegający na trudności w oddzieleniu generowanego przez neurony wyjścia w formie kroków od tych...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza fizjologii mięśni nóg, a konkretnie ich czasu reakcji i kinematyki u uwięzionego owada w różnych sytuacjach podczas chodzenia. Do badania wykorzystano patyczaka *raus miosis*, ponieważ jest on stosunkowo dużym owadem i posiada wyraźnie rozdzielone zwoje segmentowe.W pierwszej kolejności zwierzę zostaje uwiązane i oznakowane w celu fluorescencyjnego śledzenia wideo. Następnie elektrody EMG umieszcza się w mięśniach protraktora i retraktora. Kolejnym etapem jest przygotowanie uwiązanego owada do rejestracji kontaktu tarsalnego na śliskiej powierzchni.Ostatnim krokiem procedury jest jednoczesny pomiar aktywności mięśni kończyn oraz kontaktu tarsalnego podczas różnych sytuacji związanych z chodzeniem. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany w czasie aktywacji mięśni. W zależności od kontekstu behawioralnego kończyna jest wykorzystywana w główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak badanie.Chodzenie na kulach trekkingowych sprawia, że sprzężenie mechaniczne poprzez podłoże zostaje usunięte. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące kontroli motorycznej, takie jak stopień, w jakim pojedyncza kończyna przyczynia się do chodu u zwierzęcia czteronogiego. Implikacje tej techniki otwierają pole do badań nad adaptacyjnym zachowaniem lokomocyjnym, ponieważ możemy teraz badać zmiany prędkości chodu oraz kierunku chodu na poziomie pojedynczej kończyny, co dowodzi użyteczności tej konfiguracji.Peter Boha, technik w moim laboratorium, dwie mocno połączone mosiężne płytki pokryte niklem, odizolowane od siebie dwumilimetrowym paskiem dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, są wykorzystywane do przygotowania śliskiej powierzchni do chodzenia dla zwierzęcia; każdą połowę płytki należy osobno nasmarować elektrycznie przewodzącą mieszaniną gliceryny i soli fizjologicznej za pomocą kawałka miękkiej chusteczki. Po prawidłowym nałożeniu roztwór powinien mieć grubość od 0,1 do 0,2 mm i tworzyć powierzchnię o lepkości kinematycznej wynoszącej około 430 centistokesów.Dwa okrągłe ekrany z mątowego szkła są rozmieszczone przed płytą w taki sposób, aby podczas eksperymentu znajdowały się w odległości 70 milimetrów od oczu zwierzęcia. Gdy na ekrany te zostanie wyświetlony ruchomy wzór w pasy, zwierzę zacznie iść do przodu. Chód jest indukowany przez progresywny wzór na obu ekranach z pasami poruszającymi się na zewnątrz lub przez pojedynczą czarną wiązkę na białym tle umieszczoną między ekranami, co może wywołać dłuższe sekwencje chodu prostoliniowego.Jeśli oba progresywne wzory pasków poruszają się w tym samym kierunku, indukowany jest skręt. Po zmontowaniu zestawu doświadczalnego zwierzę można przygotować do eksperymentu za pomocą uwięzi z cementu dentystycznego, mocując dorosłą samicę patyczaka stroną brzuszną do cienkiego patyczka bolsa, który jest przymocowany do mosiężnej rurki z gniazdem. Głowa i odnóża wystają z przodu i z boków uchwytu, aby umożliwić ich swobodny ruch.Następnie pigmenty fluorescencyjne zmieszane z cementem stomatologicznym są wykorzystywane do oznakowania głowy, klatki piersiowej oraz dystalnych części kości udowej i piszczelowej każdej nogi w celu późniejszego śledzenia wideo. Aktywność mięśniowa zwierzęcia jest rejestrowana za pomocą elektrod EMG wszczepionych do klatki piersiowej.Sygnał jest wzmacniany 100-krotnie we wzmacniaczu przedwstępnym, a następnie wzmacniany 10-krotnie i filtrowany w zakresie od 100 hertz do 2000 hertz przed konwersją na sygnał cyfrowy. Elektrody wykonuje się z dwóch powlekanych miedzianych drutów posmarowanych klejem, które następnie skręca się ze sobą; jeden koniec skręconego drutu przylutowuje się do miniwtyczki, a na drugim końcu, przy użyciu miniaturowego wybijaka, wykonuje się małe otwory w kutykuli, przez które zostanie przeprowadzona elektroda. W celu uzyskania kontaktu z mięśniami, miniwtyczkę na jednym końcu drutu umieszcza się w gnieździe przymocowanym do mosiężnej rurki, do której przywiązane jest zwierzę.Wprowadź odcięty koniec elektrody przez otwór znajdujący się tuż pod kutykulą do mięśnia w taki sposób, aby dwa przewody każdej elektrody zostały umieszczone w oddzielnych otworach w odległości około jednego milimetra od siebie. W celu unieruchomienia przewodów stosujemy małą kroplę histoakrylowego kleju. Do odwłoka wprowadza się jeszcze jeden przewód, który będzie pełnił funkcję elektrody referencyjnej, aby zrozumieć zależność między kinematyką chodu owada a fizjologią mięśni.Kontakt kostek podczas chodzenia jest mierzony w trakcie rejestracji EMG; należy wypalić alkoholem izolację na końcu 15 centymetrowego odcinka miedzianego drutu, aby umożliwić pomiar przepływu prądu przez kostkę. Następnie na jednym końcu drutu formuje się pętlę, którą nasuwa się na kostkę zwierzęcia i zaciska na dystalnym końcu kości piszczelowej. Drut zostaje następnie przymocowany do klatki piersiowej zwierzęcia kroplą cementu dentystycznego, a pręt w mosiężnej rurce, do której przyklejono zwierzę, zostaje podłączony do mikromanipulatora.Aby umożliwić regulację wysokości zwierzęcia w zakresie od 7 do 12 mm ponad śliską powierzchnią, co odpowiada wysokości owada podczas swobodnego poruszania się przez zacisk krokodylkowy, drugi koniec przewodu podłączamy do różnicowego wzmacniacza lock-in. W celu poprawy przewodnictwa przewodu na jego końcach w miejscach styku nakładamy kroplę kremu elektrodowego. Obwód zamyka się poprzez połączenie płyty ze wzmacniaczem za pomocą wtyczek u podstawy płyty.Generator impulsów tworzy sygnał, który jest przykładany do obu połówek płytki za pomocą tych wtyczek. Jeden z przewodów z płytki jest podłączony do wzmacniacza i służy jako sygnał referencyjny. Gdy zwierzę znajduje się już w odpowiedniej pozycji, a przewody są podłączone, jego noga staje się przełącznikiem i prąd przepływa przez nadgarstek, zamykając obwód między płytką a wzmacniaczem.Powoduje to powstanie sygnału z czasem wyprzedzenia krótszym niż jedna milisekunda w momencie kontaktu oraz sygnału opóźnionego podczas odrywania. Siłę sygnału sprawdza się poprzez poruszanie tarsusem w górę i w dół. Następnie przewody EMG są podłączane do wzmacniaczy.Sygnał wyzwalający dla kamery jest rejestrowany jednocześnie z kontaktem tarsalnym i zapisem EMG, aby umożliwić klatkową korelację przebiegów. Obecnie można zarejestrować sekwencję chodu z aniamłem w pozycji wyjściowej i wszystkimi podłączonymi elementami. Wzorzec wizualny i nagrywanie wideo są uruchamiane jednocześnie w celu stworzenia zapisu wizualnego ruchu jako kontroli.Używając wysokoszybkościowej kamery wideo rejestrującej 100 klatek na sekundę, nagraj ruch odnóży z góry oraz poprzez lustro umieszczone pod kątem 45 stopni za zwierzęciem. Jeśli zwierzę nie rozpocznie spontanicznie lokomocji, można je stymulować pędzelkiem w okolicy brzucha lub dmuchawką w okolicy czułków. Śledzenie markerów fluorescencyjnych na zwierzęciu można usprawnić, oświetlając je matrycą niebieskich diod LED i mocując żółty filtr do obiektywu kamery.Tłumi to krótkie fale światła aktywacyjnego i zwiększa kontrast wideo. Najpierw nagraj sekwencję chodu nieuszkodzonego zwierzęcia w celu uzyskania kontroli. Zmiana bodźców wzrokowych zmienia kierunek lokomocji.W razie potrzeby należy amputować odnóża, chwytając udro poprzez uciśnięcie je pęsetą, a następnie pozostawić zwierzę na 30 minut w celu regeneracji. Teraz można ocenić rolę fizjologiczną brakujących odnóży. Kropki na tym obrazie wskazują położenie elektrod w mięśniach protraktora i retraktora środkowej nogi.W tym preparacie EMG usunięto przednie i tylne odnóża, aby zbadać wpływ sąsiednich odnóży na kinematykę i aktywność mięśniową odnóży środkowych. Przedstawione dane na tym zapisie z organizmu wykonującego skręt: górny ślad pokazuje zapis kontaktu stóp (tarsów), natomiast dolny ślad przedstawia sygnał EMG z mięśnia retraktora.Podczas kroków do przodu na początku zapisu retraktor jest aktywny w fazie podparcia, gdy noga ma kontakt z podłożem. Po krótkiej zmianie noga wykonuje kroki do tyłu, a retraktor jest aktywny w fazie przenoszenia, gdy noga znajduje się w powietrzu. Poniżej znajduje się pełny widok wszystkich zebranych danych podczas chodzenia zwierzęcia, a powyżej zapis EMG z mięśnia protraktora.W centrum znajduje się zapis EMG z mięśni retraktora, a poniżej sygnał kontaktu tarsalnego. Na wstawce widoczne są rzeczywiste ruchy zwierzęcia zarejestrowane przez kamerę wysokich prędkości. Naprzemienna aktywność w zapisach EMG odpowiada aktywności dwóch mięśni w cyklu kroków.Mięsień protraktor jest aktywny tuż przed i podczas fazy przeniesienia, natomiast retraktor jest aktywny po kontakcie z podłożem i podczas fazy podporu. Po opanowaniu techniki, przygotowanie może zająć mniej niż 90 minut, a dane mogą być pozyskiwane przez kilka godzin po przeprowadzeniu tej procedury. Po jej opracowaniu możliwe jest zastosowanie innych metod, takich jak analiza kinematyczna lub rejestracje z pojedynczych komórek, u niemal nienaruszonego, zachowującego naturalne reakcje zwierzęcia.Technika ta pomogła badaczom z dziedziny kontroli motorycznej w odpowiedzi na pytania dotyczące tego, w jaki sposób pojedyncze wyrostki generują elastyczne i adaptacyjne wzorce lokomocyjne.

studying-the-neural-basis-of-adaptive-locomotor-behavior-in-insects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie podstawy neuronalnej adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

Prezentujemy nowatorską procedurę chirurgiczną polegającą na wszczepieniu elektrod w Manduca sexta podczas jej wczesnych stadiów metamorficznych. Technika ta pozwala na mechanicznie stabilne i elektrycznie niezawodne sprzężenie z tkanką nerwowo-mięśniową w celu badania dynamiki neurofizjologii lotu. Prezentujemy również nowatorską platformę lewitacji magnetycznej do badań ziewania owadów na uwięzi.

Wczesna technologia wprowadzania metamorficznego do monitorowania zachowania owadów w locie

Wcześniej opracowaliśmy technikę wszczepiania drutów tetrodowych do centralnego kompleksu mózgów karaluchów, która pozwala nam monitorować aktywność w poszczególnych jednostkach karaluchów na uwięzi. Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną wersję tej techniki, która pozwala nam również rejestrować aktywność mózgu u swobodnie poruszających się owadów.

Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną technikę mikroskopową, która pozwala uzyskać wysokiej jakości cyfrowe wideo z fenotypami dorosłych i larw zmutowanych Drosophila z perspektywy bocznej.

Akwizycja wysokiej jakości cyfrowego wideo larw Drosophila i zachowań dorosłych z perspektywy bocznej

Zdolność do lokalizacji źródła zapachu jest niezbędna do przetrwania owadów i oczekuje się, że będzie miała zastosowanie do sztucznego śledzenia zapachów. Robot sterowany przez owady jest napędzany przez prawdziwą jedwabną i umożliwia nam ocenę zdolności owadów do śledzenia zapachów za pomocą platformy robotycznej.

Robot sterowany przez owady: mobilna platforma robota do oceny zdolności owadów do śledzenia zapachów

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten protokół opisuje test behawioralny do rejestrowania zachowań związanych z wyszukiwaniem wywołanym cukrem za pomocą Drosophila melanogaster. Test może być wykorzystany do badania zachowań związanych z karmieniem i żerowaniem, a także leżących u ich podstaw mechanizmów neuronalnych.

Śledzenie lokalnych zachowań związanych z poszukiwaniami wywołanymi cukrem u Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Badanie to analizuje wpływ wieku na lokomocję u C. elegans poprzez pomiar największego wykładnika Lyapunova (LLE). Wraz z wiekiem C. elegans wykazują wzrost i późniejszy spadek kontroli motorycznej. Wyniki pokazują szczyt LLE po pięciu dniach, a następnie spadek wraz z wiekiem robaków.

Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova

Poznaj metodę rejestracji aktywności mięśniowej u owadów na śliskiej powierzchni w celu badania neuronalnych mechanizmów adaptacyjnych zachowań lokomotorycznych. Technika EMG umożliwia analizę czasowania mięśni i kinematyczki chodu.

Badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Przeglądaj więcej filmów