Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji BMP w komórkach hodowli tkankowych. Białka BMP wiążą się z receptorami na powierzchni komórki i fosforylują trzy efektory smad: smad one, smad five oraz SMAD eight. Tworzą one kompleksy z smad four i przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie regulują transkrypcję.

W niniejszym doświadczeniu wykorzystujemy metodę PLA do wizualizacji kompleksów tworzących się między endogennymi efektorami SMA a białkiem smad four w komórkach hodowli tkankowej, z pobudzeniem BMP lub bez niego. Procedura rozpoczyna się od równoległego zastosowania dwóch przeciwciał pierwszorzędowych, z których jedno rozpoznaje wszystkie trzy fosforylowane efektory smma, a drugie rozpoznaje smad four. Przeciwciała drugorzędowe, zwane sondami PLA, z których każda posiada przyłączoną unikalną krótką nić DNA, wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi w miejscach, gdzie sondy PLA znajdują się w bliskim sąsiedztwie. Nicie DNA wchodzą w interakcję po późniejszym dodaniu dwóch oligonukleotydów DNA tworzących koło.

Zostają one połączone poprzez ligację enzymatyczną, tworząc pierścień, który po reakcji amplifikacji ulega powieleniu w procesie izotermicznej amplifikacji kołowej (rolling circle replication). Hybrydyzacja znakowanych, komplementarnych sond oligonukleotydowych pozwala uwydatnić fluorescencyjne punkty produktu związane z amplifikacją każdego kolistego produktu DNA, które są łatwo widoczne.

Podczas obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym kropki odpowiadają kompleksom efektora, seds i smad four, co oznacza aktywną sygnalizację BMP w komórce. Głównymi zaletami PLA w porównaniu z istniejącymi metodami jest łatwość użycia, wysoka czułość oraz brak tła, a także możliwość wykorzystania tej metody do ilościowego określenia aktywnej sygnalizacji BMP in situ. Szlak BMP jest niezbędny dla rozwoju wielu organów i tkanek oraz dla procesów obejmujących proliferację i różnicowanie komórek macierzystych.

Metoda PLA może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące dynamiki sygnalizacji BMP, jej poziomów oraz lokalizacji subkomórkowej, ale może służyć również do celów diagnostycznych. Ponieważ szlak ten leży u podłoża wielu chorób, BLA można wykorzystać do badania innych komponentów przekazywania sygnału w szlaku BMP lub innych szlakach, a także dostosować do pracy na przekrojach tkanek lub całych embrionach. Aby rozpocząć test przybliżonej ligacji in situ, należy przygotować hodowle komórkowe; komórki Neuro two A hoduje się w pożywce GMEM uzupełnionej o 10% FBS, 1x nieessentialne aminokwasy, 1x pirowinian oraz 1x L-glutaminę.

Rozdziel komórki za pomocą trypsyny i wysiej od 15 000 do 20 000 komórek na dołek. W 16-dołkowym szkiełku do komór inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% carbon dioxide przez 24 godziny. Po 24 godzinach.

Wymień pożywkę hodowlaną na uzupełnione, beztłuszczowe pożywienie GMEM i inkubuj próbki kontrolne przez kolejne dwie do trzech godzin. Trzy studzienki z komórkami utrzymuj w normalnych warunkach hodowli po drugiej inkubacji. Zahamuj szlak BMP, traktując komórki dwumikromolarną darsamorfiną, lub indukuj sygnalizację, traktując komórki BMP 4 przez 10 do 60 minut.

Po stymulacji komórek odessać pożywkę z dołków i delikatnie przemyć komórki roztworem PBS, aby uniknąć ich odklejenia. Nie pipetować PBS bezpośrednio na komórki. Następnie odessać PBS i usunąć komory, pozostawiając silikon wokół dołków.

Do dołków dodać 50 µL świeżo przygotowanego i przefiltrowanego 4% paraformaldehydu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wytrząsania. Po utrwaleniu przemyć komórki buforem PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem w naczyniu typu copin. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy przemycia.

Następnie przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 0,5% Triton X 100 w PBS w naczyniu typu Copin i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie przemyj komórki 0,05% tween 20 i TBS trzykrotnie, po 5 minut na każde płukanie, z mieszaniem w naczyniu typu Copin. Rozpocznij procedurę blokowania, lekko uderzając w preparat, aby usunąć ostatnią porcję roztworu do płukania.

Należy uważać, aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek. Do każdej studzienki z roztworem blokującym należy dodać jedną kroplę DUO link. Inkubować komórki w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze 37°C w podgrzewanej komorze wilgotnościowej, wykonanej z pustego pudełka na końcówki do pipet z wodą destylowaną.

Aby przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych, należy rozcieńczyć przeciwciała anty-phospho smad 1 5 8 oraz anty-SMAD four one w stosunku 1:100 w rozcieńczalniku DuoLink Two Antibody Diluent. Każde przeciwciało należy zastosować pojedynczo oraz w kombinacjach. Następnie należy opukać preparat, aby usunąć z niego roztwór blokujący, a do odpowiednich dołków dodać po 40 µL roztworów przeciwciał. Można dołączyć kontrolę negatywną z samym rozcieńczalnikiem.

Wykonaj ten krok szybko, aby komórki nie wyschły. Następnie inkubuj preparaty w temperaturze 37°C w uprzednio podgrzanej komorze wilgotnej przez jedną godzinę. Podczas inkubacji rozcieńcz dwie sondy PLA w rozcieńczalniku.

Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodaj 8 µL każdej sondy oraz 24 µL rozcieńczalnika, aby sondy zostały rozcieńczone w roztworze w stosunku 1:5. Po jednogodzinnej inkubacji odlej roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyj preparaty dwukrotnie buforem Duo link to Wash Buffer a przez 5 minut każdego mycia w temperaturze pokojowej, wytrząsając je w naczyniu do sprzęgania. Po zakończeniu płukania odlej pozostały bufor myjący A z preparatów i dodaj do każdego z nich 40 µL roztworu sond PLA.

Następnie inkubuj preparaty na szkiełkach w temperaturze 37 °C w uprzednio podgrzanej, nawilżonej komorze. Przez jedną godzinę przygotuj odpowiednią objętość mieszaniny ligacyjnej z zapasu duo link ligation stock. W tym celu najpierw wymieszaj zapas duo link ligation stock w wortexie, a następnie rozcieńcz go do stężenia 1x w wodzie wysokiej czystości.

Należy pamiętać, że enzym ligaza jest dodawany do tego roztworu w stosunku 1:40, a na każdą studniczkę wymagane jest 40 µL mieszaniny. Po inkubacji należy usunąć roztwór sond PLA z szkiełek i przemyć je dwukrotnie buforem do mycia (Wash Buffer). Podczas ostatniego mycia, które trwa pięć minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu w naczyniu do sprzęgania, należy wyjąć Duo link Ligase z bloku chłodzącego, a następnie dodać go do roztworu ligacji do końcowego rozcieńczenia 1:40 i wymieszać na vortexie.

Następnie odsącz końcową objętość Buforu do Płukania A z prowadnic i dodaj 40 µL produktu ligacji. Wymieszaj z enzymem w każdej studni. Inkubuj prowadnice w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut.

W temperaturze 37°C rozmrozić zapas do amplifikacji DUO link i przygotować etap amplifikacji podczas inkubacji, rozcieńczając zapas do amplifikacji DUO Link w wodzie o wysokiej czystości do stężenia 1x. Odczynniki należy przechowywać w ciemności, ponieważ są one wrażliwe na światło. Po zakończeniu etapu ligacji odlać roztwór i przemyć preparaty dwukrotnie Buforem do Mycia A przez dwie minuty każdy, w temperaturze pokojowej, z wytrząsaniem w naczyniu do sprzęgania; podczas ostatniego mycia dodać polimerazę duo link do roztworu amplifikacyjnego do końcowego rozcieńczenia 1:280 i wymieszać za pomocą wortexa. Po odlaniu buforu do mycia dodać 40 µL mieszaniny amplifikacyjnej do każdej studni i inkubować preparaty w ciemnej, wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37°C.

Po zakończeniu inkubacji podczas amplifikacji, zlej roztwór polimerazy z szkiełek i przemyj je dwukrotnie w buforze do mycia Wash buffer B przez 10 minut każdego mycia, umieszczając je w naczyniu do sprzęgania; podczas tego kroku należy chronić szkiełka przed światłem, ponieważ odczynniki są światłoczułe. Po dwóch myciach zanurz szkiełka w 0,1-krotnym stężeniu buforu do mycia Wash buffer B. Następnie całkowicie usuń silikon z szkiełka 16-dołkowego, a potem dodaj około 40 µL roztworu duo.

Nanieś medium montażowe za pomocą pipety na szkiełko nakrywkowe i ostrożnie połóż je na próbkach, lekko dociskając, aby pod szkiełkiem nie pozostały pęcherzyki powietrza; utrwal i zabezpiecz szkiełko nakrywkowe na preparacie za pomocą laku do paznokci, odczekując co najmniej 15 minut przed obrazowaniem. Są to obrazy konfokalne komórek, które były traktowane 2 µM dorsomorfiny, inhibitora szlaku BMP, lub traktowane 25 ng/mL BMP4 przez 60 minut.

Do detekcji aktywnych kompleksów smad wykorzystano przeciwciała przeciwko Phospho Smad 1 58 oraz Smad four, które widoczne są jako czerwone punkty. Jądra komórkowe zostały zabarwione na niebiesko przy użyciu dpi. Sygnały PLA przeliczono za pomocą oprogramowania DUO link image tool, a średnią liczbę punktów w jądrze na jedną komórkę przedstawiono na wykresie.

Brak barwienia w przypadku zastosowania każdego z przeciwciał pierwszorzędowych osobno wskazuje na brak niespecyficznego wiązania sond PLA i następującego po nim ligowania oligonukleotydów. Podobnie, żadnych sygnałów punktowych nie wykryto w innym kontrolnym punkcie negatywnym z pominięciem obu przeciwciał pierwszorzędowych. W analizie immunoblottingu SDS-PAGE komórek neuro 2A wykazano obecność fosforylowanych białek SMAD 1 5 8 w komórkach niepoddanych działaniu czynnika oraz w komórkach traktowanych BMP.

Niemniej jednak poziomy phospho smad są wyraźnie obniżone w komórkach traktowanych morfiną grzbietową. Przeciwciało przeciwko PCNA służy jako kontrola ładowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu postępowania zgodnie z opisanymi krokami oraz konfiguracją, którą sugerujemy, aby uzyskać wyniki w czasie krótszym niż sześć godzin od utrwalenia komórek.

Podsumowując, kolejne etapy obejmują inkubację z przeciwciałem blokującym, inkubację z sondami PLA, ligację z amplifikacją, montowanie oraz obrazowanie.