Wykrywanie sygnalizacyjnych kompleksów efektorowych za BMP4 za pomocą PLA in situ, testu ligacji zbliżeniowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja i ilościowe określenie sygnalizacji BMP w komórkach hodowli tkankowej. BMP wiążą się z receptorami na powierzchni komórki i PHOSPHOLATE trzy, efektory smad, smad jeden, smad pięć i SMAD osiem. Tworzą one kompleksy z smad four i przemieszczają się do jądra, gdzie organizują transkrypcję.

Tutaj używamy PLA do wizualizacji kompleksów tworzących się między endogennymi efektorami SMA i smad four w komórkach hodowli tkankowej ze stymulacją BMP lub bez. Zaczyna się to od równoległego użycia dwóch przeciwciał pierwszorzędowych, z których jedno rozpoznaje wszystkie trzy efektory fosforylowane, SMMA, a drugie z nich rozpoznaje smad cztery przeciwciała drugorzędowe zwane sondami PLA, z których każde ma dołączoną unikalną krótką nić DNA, wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi, w których sondy PLA znajdują się w bliskiej odległości. Nici DNA oddziałują poprzez późniejsze dodanie dwóch oligonukleotydów DNA tworzących koło.

Są one połączone ze sobą przez ligację enzymatyczną i tworzą okrąg, który ulega amplifikacji poprzez replikację w toczeniu koła po reakcji amplifikacji. Hybrydyzacja znakowanych komplementarnych sond oligonukleotydowych uwydatnia fluorescencyjne plamy produktu związane z amplifikacją każdego okrągłego sondy. Produkty DNA są dobrze widoczne.

Oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym plamki odpowiadają kompleksom między efektorem, sedami i smad cztery, które oznaczają aktywną sygnalizację BMP w komórce. Główną zaletą PLA w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest łatwy w użyciu, bardzo czuły i bez tła, a także może być używany do ilościowego określania aktywnej sygnalizacji BMP in situ. Szlak BMP jest niezbędny do rozwoju wielu narządów i tkanek oraz do procesów, w tym proliferacji i różnicowania komórek macierzystych.

PLA może być używany do rozwiązywania kluczowych pytań dotyczących dynamiki, poziomów i lokalizacji subkomórkowej BMP, ale może być również używany do diagnozy. Ponieważ szlak ten leży u podstaw wielu chorób, BLA może być używany do badania innych składników transakcji sygnałowych BMP lub innych szlaków i może być dostosowany do pracy na skrawkach tkanek lub całych zarodkach. Aby rozpocząć test ligacji zbliżeniowej in situ, przygotuj hodowle komórkowe, dwie komórki A Neuro są hodowane w GMEM uzupełnione 10% FBS, jeden raz aminokwasy endogenne, jeden raz pirogronian i raz L glutamina.

Podziel komórki za pomocą trypsyny i płytki od 15 000 do 20 000 komórek na dołek. W 16-dołkowym szkiełku inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Po 24 godzinach.

Zastąp pożywkę hodowlaną uzupełnioną surowicą wolną od GMEM i inkubuj przez kolejne dwie do trzech godzin w celu kontroli. Przechowywać trzy studzienki z komórkami w normalnej hodowli i warunkach po drugiej inkubacji. Zahamuj szlak BMP, traktując komórki dwiema mikromolowymi morfinami grzbietowymi lub indukuj sygnalizację, traktując komórki BMP cztery przez 10 do 60 minut.

Po stymulacji komórek odessać pożywkę z dołków i delikatnie umyć komórki PBS, aby uniknąć oderwania komórek. Nie pipetować PBS bezpośrednio na ogniwa. Następnie odessać PBS i usunąć komory, ale pozostawić krzem wokół studzienek.

Dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego i przefiltrowanego 4% para formaldehydu do studzienek i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Po utrwaleniu myć komórki PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem w słoiku z kopiną. Powtórz pranie dwa razy, w sumie trzy prania.

Następnie przepuścić komórki za pomocą 0,5% Triton X 100 w PBS w słoiku copin i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie umyj komórki 0,05% tween 20 i TB S3 razy przez pięć minut na pranie z mieszaniem w słoiku sprzęgającym. Zainicjuj procedurę blokowania, dotykając suwaka, aby usunąć końcowy roztwór myjący.

Uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek. Dodaj jedną kroplę DUO link do roztworu blokującego do każdego. Dobrze inkubować komórki w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza we wstępnie nagrzanej wilgotnej komorze składającej się z pustego pudełka z końcówką pipety z wodą destylowaną.

Aby przygotować pierwszorzędowe roztwory przeciwciał, rozcieńczyć anty phospho smad 1, 5, 8 i anty SMAD od czterech jeden do 100 w duecie połącz dwa rozcieńczalniki przeciwciał. Stosować każde przeciwciało osobno lub w połączeniu. Teraz dotknij szkiełka, aby usunąć roztwór blokujący ze szkiełka i dodaj 40 mikrolitrów roztworów przeciwciał do odpowiednich studzienek i kontroli ujemnej Można dołączyć tylko z rozcieńczalnikiem.

Wykonaj ten krok szybko, aby komórki nie wyschły. Teraz inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nagrzanej, wilgotnej komorze przez godzinę. Podczas inkubacji rozcieńczyć dwie sondy PLA w rozcieńczalniku.

Do każdej reakcji wymieszać osiem mikrolitrów każdej sondy i 24 mikrolitry rozcieńczalnika, tak aby sondy rozcieńczyć od jednego do pięciu w roztworze. Po godzinnej inkubacji stuknąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełka dwukrotnie za pomocą Duo link do buforu do płukania przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem w słoiku sprzęgającym. Po zakończeniu płukania strzepnij pozostały bufor A do płukania ze szkiełek i dodaj do każdego z nich 40 mikrolitrów roztworu sondy PLA.

Cóż, teraz inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nagrzanej wilgotnej komorze. Przez godzinę duet łączy się z zapasem podwiązki i przygotowuje objętość do mieszanki do podwiązywania. Najpierw wirując łącznik duetu z podwiązaniem i rozcieńczając go do jednego razu w wodzie o wysokiej czystości.

Weź pod uwagę, że enzym ligazy dodaje się od jednego do 40 w tym roztworze i potrzeba 40 mikrolitrów mieszanki na studzienkę. Po inkubacji strząsnąć roztwór sondy PLA ze szkiełek i umyć je dwukrotnie buforem do mycia. A przez pięć minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem w słoiku sprzęgającym podczas ostatniego prania, wyjąć Duo link Ligase z bloku zamrażającego, a następnie dodać go do roztworu ligacji do końcowego rozcieńczenia od jednego do 40 i Vortex.

Teraz strzepnąć ostatnią objętość buforu A do płukania ze szkiełek i dodać 40 mikrolitrów podwiązania. Wymieszaj z enzymem do każdego podczas l. Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut.

W temperaturze 37 stopni Celsjusza rozmrozić materiał do amplifikacji DUO link i przygotować się do etapu amplifikacji podczas inkubacji, rozcieńczając materiał do amplifikacji DUO Link w wodzie o wysokiej czystości do jednego raza Trzymaj odczynniki z dala od światła, ponieważ są wrażliwe na światło. Po zakończeniu etapu podwiązywania strzepnąć roztwór i przemyć szkiełka dwukrotnie buforem A przez dwie minuty w temperaturze pokojowej z mieszaniem w słoiku sprzęgającym podczas ostatniego płukania, dodać polimerazę duo link do roztworu amplifikacyjnego do końcowego rozcieńczenia 1:2,80 i odwirować. Po strząśnięciu buforu płuczącego dodać 40 mikrolitrów amplifikacji zmieszanej do każdej studzienki i inkubować szkiełka w ciemnej, wstępnie nagrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zakończeniu inkubacji amplifikacji stuknąć roztwór polimerazy ze szkiełek i umyć je w buforze B dwa razy przez 10 minut na przemycie z roślinnością w słoiku sprzęgającym, trzymając szkiełka z dala od światła podczas tego etapu, ponieważ odczynniki są wrażliwe na światło. Postępuj zgodnie z dwoma praniami, zanurzając 0,1 razy w buforze do płukania B. Teraz całkowicie usuń silikon z 16. Cóż, przesuń następnie przy około 40 mikrolitrach duetu.

Połączyć z podłożem montażowym za pomocą dappy do szkiełka nakrywkowego i delikatnie umieścić je na próbkach, lekko dociskając, aby pod szkiełkiem nakrywkowym nie było pęcherzyków powietrza, przymocować i uszczelnić szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą lakieru do paznokci, odczekawszy co najmniej 15 minut przed obrazowaniem. Są to konfokalne obrazy komórek, które były traktowane morfiną dwumikromolową grzbietową, inhibitorem szlaku BMP lub traktowane 25 nanogramami na mililitr. BMP cztery przez 60 minut.

Przeciwciała przeciwko Phospho Smad 1, 58 i Smad four zostały użyte do wykrycia aktywnych kompleksów smad i są one postrzegane jako czerwone plamki. Jądro komórki podtrzymywane na niebiesko przez dpi. Sygnały PLA zliczono za pomocą oprogramowania DUO link image tool, a średnia liczba plamek w jądrze na komórkę jest przedstawiona na wykresie.

Nie obserwuje się barwienia, gdy którekolwiek z pierwotnych przeciwciał jest używane samodzielnie, co wskazuje, że nie ma tła sond PLA i późniejszej ligacji oligonukleotydów. Podobnie, nie wykrywa się żadnych plam w innej kontroli ujemnej emitującej oba przeciwciała pierwszorzędowe. W neuro dwóch komórkach A strona SDS immuno blotting ujawnia SMAD 1, 5, 8 związane z fosfo w komórkach nieleczonych i leczonych BMP.

Jednak poziomy fosfo smad są znacznie obniżone w komórkach leczonych morfiną grzbietową. Przeciwciało przeciwko PCNA zapewnia kontrolę obciążenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak postępować zgodnie z krokami i konfiguracją, którą sugerujemy, aby uzyskać wyniki w mniej niż sześć godzin po utrwaleniu komórek.

Podsumowując, kroki obejmują blokowanie inkubacji przeciwciał pierwotnych, inkubację prób PLA, amplifikację ligacji, montaż obrazowania.