Name: Wykrywanie sygnalizacyjnych kompleksów efektorowych za BMP4 za pomocą PLA in situ, testu ligacji zbliżeniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Poznaj metodę PLA do wizualizacji i ilościowego oznaczania sygnalizacji BMP4 w komórkach Neuro 2A. Technika ta umożliwia wykrywanie aktywnych kompleksów efektorowych in situ z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te są finansowane z grantów MRC i BBSRC. Dziękujemy Agacie Ziebie i Katerinie Pardalis z laboratorium Ulfa Landegrena na Uniwersytecie w Uppsali za pomoc w przygotowaniu techniki oraz za pomocne rady. Dziękujemy firmie Olink Bioscience za pomoc techniczną i prezentację.

1. Wysiewanie komórek i traktowanie BMP
<ol>
 <li>Hodować komórki Neuro2a w pożywce GMEM uzupełnionej o 10% FBS, 1x nieessentialne aminokwasy (NEAM), 1x pirogronian sodu i 1x L-glutaminę. Przeszczepić komórki z użyciem trypsyny (0.05%-EDTA) i wysiać 15.000-20.000 komórek na dołek w 16-dołkowym szkiełku z komorami. 
 
 Hodować komórki HEK293T lub Cos7 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS, 1x L-glutaminę oraz 1x penicylinę/streptomycynę. Sterylizować szkiełka z polizyną poprzez zanurzenie ich w 70% etanolu, a następnie za pomocą pisaka Immedge wyznaczyć dołki o powierzchni 1 cm2. Przeszczepić komórki z użyciem trypsyny (0.05%-EDTA) i wysiać 20.000-25.000 komórek na dołek w 50 μl pożywki.</li>
 <li>Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.</li>
 <li>Po 24 h zastąpić pożywkę bezsurowiczą GMEM (uzupełnioną o 0.1% albuminy, 1x NEAM, 1x pirogronian sodu i 1x L-glutaminę) dla komórek Neuro2a lub bezsurowiczą DMEM (uzupełnioną o L-glutaminę i 1x penicylinę/streptomycynę) dla komórek HEK293T/Cos7 i inkubować komórki przez 2-3 h. Trzy dołki z komórkami pozostawić w standardowych warunkach hodowli (tj. 10% FBS), aby służyły jako kontrole.</li>
 <li>Potraktować komórki dorsomorfinią (inhibitor szlaku BMP, 2 μM) lub BMP4 (25 ng/ml) przez wymagany czas (np. od 10 min do 1 h) 5.</li>
</ol>
2. Fiksacja i permeabilizacja
<ol>
 <li>Przygotować utrwalacz, 4% PFA. Odważyć 4 g PFA, aby przygotować 4% roztwór w 100 ml PBS. Podgrzewać roztwór w temperaturze 50°C do momentu, aż stanie się przejrzysty. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia. Należy używać świeżego utrwalacza (przechowywanego nie dłużej niż 2 dni).</li>
 <li>Odssać medium z dołków i przemyć 1xPBS. Nie pipetować roztworów bezpośrednio na komórki, ponieważ może to spowodować ich odklejenie. Przed przejściem do kolejnego kroku, w przypadku stosowania szkiełek z komorami, należy usunąć komory, pozostawiając silikon wokół dołków.</li>
 <li>Dodać 50 μl 4% PFA i inkubować przez 10 min w temperaturze RT, bez mieszania.</li>
 <li>Przemyć komórki w PBS (3 x 5 min) w naczyniu Coplina z mieszaniem w temperaturze RT.</li>
 <li>Potraktować komórki roztworem 0,5% Triton X-100 w PBS przez 10 min bez mieszania w temperaturze RT.</li>
 <li>Przemyć komórki roztworem 0,05% Tween 20 w TBS (TBS-T) (3 x 5 min) w naczyniu Coplina z mieszaniem w temperaturze RT.</li>
</ol>
3. Blokowanie
<ol>
 <li>Odlej TBS-T. Dodaj jedną kroplę roztworu blokującego Duolink II Blocking Solution (1x) do każdej studzienki.</li>
 <li>Inkubuj szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 h w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
4. Przeciwciała pierwszorzędowe
<ol>
 <li>Wymieszać i rozcieńczyć przeciwciało a-P-Smad1/5/8 (królicze poliklonalne) w stosunku 1:100 oraz przeciwciało a-Smad4 (mysie monoklonalne) w stosunku 1:100 w rozcieńczalniku do przeciwciał Duolink II Antibody Diluent (1x). Przygotować również osobne roztwory a-P-Smad1/5/8 i a-Smad4 w tych samych stężeniach do wykorzystania w kontrolach.</li>
 <li>Odssać roztwór blokujący z preparatów. Usunąć jak najwięcej roztworu blokującego, dbając jednocześnie o to, aby komórki nie wyschły przed dodaniem przeciwciał. Do dołków dodać po 40 μl roztworów przeciwciał. W jednym dołku dodać wyłącznie Antibody Diluent jako dodatkową kontrolę negatywną.</li>
</ol>
5. Sondy PLA
<ol>
 <li>Rozcieńczyć dwie sondy PLA (Duolink II anti-Mouse MINUS oraz Duolink II anti-Rabbit PLUS) w stosunku 1:5 w Antibody Diluent.</li>
 <li>Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych z prowadnic. Prowadnice płukać 2 razy po 5 min za pomocą 1x Duolink II Wash Buffer A w słoiku Coplina przy mieszaniu w RT.</li>
 <li>Usunąć Wash Buffer A z prowadnic i dodać roztwór sond PLA (40 μl/dołek). Inkubować prowadnice w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 h w 37°C.</li>
</ol>
6. Ligacja
<ol>
 <li>Wymieszać roztwór Duolink II Ligation stock (5x) za pomocą vortexa, rozcieńczyć w stosunku 1:5 w wodzie wysokiej czystości i wymieszać. Obliczając objętość wody, należy uwzględnić objętość ligazy, która zostanie dodana w końcowym rozcieńczeniu 1:40 bezpośrednio przed dodaniem mieszaniny do dołków.</li>
 <li>Odlać roztwór sond PLA z szkiełek. Płukać szkiełka w 1x Wash Buffer A dwukrotnie przez 5 min każde w naczyniu Coplina z wytrząsaniem w RT.</li>
 <li>Wyjąć ligazę z zamrażarki, używając bloku chłodzącego (-20°C). Dodać ligazę do roztworu ligacji (przygotowanego w punkcie 6.1) w rozcieńczeniu 1:40 i wymieszać za pomocą vortexa.</li>
 <li>Odlać Wash Buffer A ze szkiełek i dodać do każdego dołka roztwór ligacji z ligazą (40 μl/dołek). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 min w 37°C.</li>
</ol>
7. Amplifikacja
Uwaga: Odczynniki światłoczułe. Przechowywać preparaty w warunkach chroniących przed światłem.
<ol>
 <li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy Duolink II Amplification (5x) w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszać. Przy obliczaniu objętości wody należy uwzględnić objętość polimerazy, która zostanie dodana w końcowym rozcieńczeniu 1:80 tuż przed dodaniem mieszaniny do dołków.</li>
 <li>Odlać roztwór Ligation-Ligase z szkiełek. Płukać szkiełka w 1x Wash Buffer A dwukrotnie po 2 min każdorazowo w naczyniu Coplina przy mieszaniu w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wyjąć polimerazę z zamrażarki, używając bloku chłodzącego (-20°C). Dodać polimerazę do roztworu Amplification (przygotowanego w punkcie 7.1) w rozcieńczeniu 1:80 i wymieszać w wirówce typu vortex.</li>
 <li>Odlać Wash Buffer A z szkiełek i dodać roztwór Amplification-Polymerase do każdego dołka (40 μl/dołek). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 min w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
8. Przygotowanie do obrazowania
Uwaga: Odczynniki światłoczułe. Przechowywać preparaty w warunkach chroniących przed światłem.
<ol>
 <li>Odlać roztwór Amplification-Polymerase z szkiełek i przemyć dwukrotnie po 10 min każdy w 1x Duolink II Wash Buffer B w naczyniu Coplin przy mieszaniu w RT.</li>
 <li>Zanurzyć szkiełka w 0.1 x Wash Buffer B.</li>
 <li>Całkowicie usunąć silikon ze szkiełka 16-dołkowego. Nanieść ~ 40μl Duolink II Mounting Medium z DAPI na szkiełko zakrywowe i delikatnie umieścić je nad próbkami, lekko dociskając, aby pod szkiełkiem zakrywowym nie pozostały pęcherzyki powietrza. Przymocować i uszczelnić szkiełko zakrywowe na szkiełku przedmiotowym za pomocą lakieru do paznokci. Odczekać co najmniej 15 min przed przystąpieniem do obrazowania.</li>
 <li>Przeanalizować próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Wykonać zdjęcia cyfrowe.</li>
</ol>
9. Ilościowe oznaczenie
Uwaga: Odczynniki światłoczułe. Przechowywać preparaty w warunkach chroniących przed światłem.
<ol>
 <li>Użyj programu Duolink ImageTool, aby zliczyć sygnały na obrazach i uzyskać pomiar poziomu sygnalizacji.</li>
 <li>Porównaj pomiary i sporządź wykres.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Wynik eksperymentu PLA in situ przejawia się w postaci oddzielnych fluorescencyjnych punktów. Lokalizacja sygnału zależy od badanych konkretnych białek.
<img alt="Analiza oddziaływań białkowych; fluorescencja PLA i Western blot; wyniki dla BMP4 vs. dorsomorfina." src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. In situ PLA na komórkach Neuro2a po stymulacji BMP4. Komórki traktowano 2 μM dorsomorfiny (inhibitora szlaku BMP) (A) lub 25 ng/ml BMP4 (B) przez 60 min lub pozostawiono nieleczone (C-E). Do wykrywania aktywnych kompleksów w A i B użyto przeciwciał przeciwko P-Smad1/5/8 oraz Smad4. Jako kontrole zastosowano przeciwciała pierwotne a-P-Smad1/5/8 samodzielnie (C), a-Smad4 samodzielnie (D) lub pominięto przeciwciała pierwotne (E). Niebieski: DAPI; Czerwony: sygnał PLA. Zdjęcia wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica SP5.
(F) Sygnały PLA policzono za pomocą oprogramowania Duolink ImageTool, a średnią liczbę plamek w jądrze na komórkę przedstawiono na wykresie. (G) Komórki Neuro2a pozostawiono bez inkubacji lub poddano działaniu dorsomorfiny (2 μM) bądź BMP4 (25 ng/ml) przez 60 min. Komórki poddano lizie, a białka rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeanalizowano za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciał a-P-Smad1/5/8 oraz a-PCNA jako kontroli załadunku. (*) prążek nieswoisty. Należy zauważyć, że przeciwciało a-P-Smad1/5/8 nie odróżnia 3 różnych białek obecnych w kompleksie z Smad4.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez firmę OLINK, która wytwarza odczynnik stosowany w procedurze testu ligacji w pobliżu (proximity ligation assay).

Wizualizacja kompleksów białkowych in situ jest bardzo pożądana, szczególnie w badaniach nad sygnalizacją, gdzie oddziaływania białek i ich modyfikacje są mechanizmami wykorzystywanymi przez komórki do przesyłania sygnałów z powierzchni do jądra. Dotychczas nie było możliwości wizualizacji i kwantyfikacji kompleksów dwóch białek endogennych in situ za pomocą immunofluorescencji. Kolokalizacja przeciwciał charakteryzuje się niską rozdzielczością i nie może być stosowana do obrazowania rzeczywistych oddziaływań. PLA to nowa technika, którą badacze zaczęli z dużym sukcesem stosować w różnych systemach 6, 7. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wykorzystać PLA nie tylko do wizualizacji, ale także do kwantyfikacji endogennych kompleksów efektorów Smad aktywowanych w odpowiedzi na stymulację BMP w funkcji czasu. W tym celu wykorzystaliśmy różne linie komórkowe hodowle tkankowych, w tym Neuro2a, oraz opieraliśmy się na komercyjnych przeciwciałach wytworzonych w różnych gatunkach (mysie przeciw Smad4 i królicze przeciw P-Smad1/5/8) (ryc. 1). Metoda ta pozwoliła nam po raz pierwszy zaobserwować aktywację kompleksów efektorowych BMP w czasie, a nie tylko obecność fosforylowanych Smad1/5/8, z których nie wszystkie mogą być zaangażowane w aktywne kompleksy z Smad4. Policzyliśmy sygnały (ryc. 1F) i porównaliśmy ten pomiar z kwantyfikacją uzyskaną z immunoblottingu tych samych komórek 8 (rycina 1G). Wyciągnęliśmy wniosek, że liczba punktów stanowi dokładny pomiar porównawczy poziomów sygnalizacji w czasie. Technikę tę zastosowano również w innych liniach komórkowych (HEK293T i Cos7), uzyskując podobne wyniki (dane nie przedstawiono).
Zasada działania tej technologii opiera się na dwóch unikalnych sondach dostarczanych w zestawie Duolink. Każda sonda PLA składa się z przeciwciała wtórnego sprzężonego z unikalnym syntetycznym oligonukleotydem, który pełni rolę reportera. Bliskość sond umożliwia ligację DNA dokładnie w miejscu, w którym sondy te są przytwierdzone w bezpośrednim sąsiedztwie. Odległość między oligonukleotydami, która pozwala na hybrydyzację i ligację DNA, jest niewielka (&lt;40nm), w związku z czym tylko oddziałujące ze sobą białka mogą doprowadzić do ligacji. Zligowane DNA może być następnie amplifikowane i wykrywane poprzez hybrydyzację z oznakowanymi oligonukleotydami komplementarnymi do amplifikowanej sekwencji. Amplifikacja jest specyficzna, ponieważ opiera się na zasadach hybrydyzacji DNA-DNA, a także zapewnia wysoką czułość, gdyż zligowane DNA jest powielane wielokrotnie, co prowadzi do wzmocnienia sygnału z początkowego zdarzenia ligacji. Amplifikowane DNA jest wykrywane poprzez hybrydyzację z oznakowanymi oligonukleotydami, co daje widoczny i stosunkowo duży punkt (spot). Ponieważ punkty te można zliczać, sygnał PLA dostarcza nie tylko dokładnych informacji przestrzennych (lokalizacji zdarzeń oddziaływania), ale także obiektywnej metody ilościowej oceny tych zdarzeń 2-4.
Inne techniki stosowane do wykrywania oddziaływań białkowych obejmują ko-immunoprecypitację, immunofluorescencję oraz transfer energii rezonansowej fluorescencji (FRET). Testy ko-immunoprecypitacji są szeroko stosowane, umożliwiając izolację kompleksów białkowych. Metodzie tej towarzyszy immunoblotting, co oznacza, że białka muszą być wyrażane na stosunkowo wysokim poziomie, aby mogły zostać wykryte. W ko-immunoprecypitacji czasami trudno jest wyeliminować problemy związane z wysokim tłem lub niespecyficznym wiązaniem niektórych białek do kulek. Ponadto testy ko-immunoprecypitacji pozwalają na wykrycie białek, które mogą być częścią kompleksu białkowego, ale nie potrafią odróżnić tych, które znajdują się w bardzo bliskiej odległości i oddziałują fizycznie ze sobą. Co więcej, ko-immunoprecypitacje nie zapewniają kwantyfikacji z rozdzielczością pojedynczych komórek ani informacji o lokalizacji kompleksów białkowych w komórce. Wykrywanie współistnienia kompleksów białkowych w komórce lub przedziale komórkowym za pomocą immunofluorescencji opiera się na nakładaniu się rozproszonych sygnałów, a zatem charakteryzuje się niską rozdzielczością przestrzenną i nie może dostarczyć dokładnych informacji o oddziaływaniach białek. Kwantyfikacja sygnału immunofluorescencyjnego może być przeprowadzona metodą szacunkową jedynie w przypadku, gdy różnica jest kilkukrotna, i nie może być tak dokładna ani mierzalna jak plamki PLA. FRET umożliwia wizualizację kompleksów białkowych w żywych komórkach i eliminuje konieczność stosowania przeciwciał oraz odsłaniania epitopu. Jednakże FRET zazwyczaj opiera się na nadekspresji sztucznie połączonych białek, co może nie odzwierciedlać endogennych kompleksów białkowych w taki sposób, jak ma to miejsce w PLA.
Warunki blokowania w protokole PLA są krytyczne, ponieważ może dojść do agregacji przeciwciał, co zwiększa tło. Alternatywne warunki blokowania można znaleźć w kartach produktów przeciwciał. Odpowiednie kontrole z pominięciem przeciwciał pierwotnych i wtórnych dostarczają informacji o potencjalnych błędach i muszą być one zawsze uwzględniane. Ważne jest przetestowanie różnych przeciwciał w celu wybrania tych, które dają najniższe tło podczas stosowania pojedynczo oraz najlepszy sygnał przy jednoczesnym użyciu. Fixacja komórek jest kluczowa, ponieważ nadmierne utrwalenie może spowodować całkowitą denaturację i degradację kompleksów białkowych, natomiast niewystarczająca fixacja może prowadzić do utraty kompleksów białkowych podczas poszczególnych etapów procedury. Można to kontrolować poprzez obniżenie stężenia utrwalacza do 3% lub ograniczenie czasu fixacji. Jednakże fixacja zależy również od tego, czy przeciwciała pierwotne rozpoznają białka zdenaturowane. Ponieważ technika PLA jest bardzo czuła, należy zachować szczególną staranność, aby czasy inkubacji i mikro warunki były jednakowe dla wszystkich próbek.
Próbki w żadnym przypadku nie powinny wyschnąć przed ostatnim etapem. Wyschnięcie próbek może prowadzić do zwiększenia tła. Całkowite usunięcie roztworu blokującego jest również krytyczne, aby uniknąć tła. Bufory do płukania powinny zawsze zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed użyciem, ponieważ niska temperatura spowalnia reakcje enzymatyczne. W celu dalszego rozwiązywania problemów należy zapoznać się z instrukcją do zestawu.
W celu ustalenia subkomórkowej lokalizacji sygnału PLA warto zastosować barwienia (np. DAPI, aktyny itp.). W tym przypadku wykorzystano DAPI (w medium montującym) do zabarwienia jąder komórkowych. Metoda PLA jest kompatybilna z immunofluorescencją z użyciem przeciwciał w celu określenia typu komórek lub przedziału komórkowego (nie pokazano tutaj). Dokładną kwantyfikację można przeprowadzić poprzez zliczanie sygnałów przy użyciu specjalistycznego oprogramowania (Duolink Image Tool, Olink Biosience).
Podsumowując, zademonstrowaliśmy sposób wykorzystania metody in situ PLA z użyciem zestawu Duolink do wykrywania sygnalizacji BMP w utrwalonych komórkach i przedstawiliśmy jej zalety: łatwość użycia, wysoką czułość, brak tła oraz unikalną zdolność do ilościowego określania aktywnej sygnalizacji BMP in situ.
Ograniczeniem w zastosowaniu tej techniki do badania różnych oddziaływań białkowych jest dostępność i jakość przeciwciał pierwszorzędowych rozpoznających badane białka.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0.05% (1X) z EDTA 4Na, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe 16-dołkowe</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>Polizyna</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko zakrywkowe</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany BMP-4 mysi</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Odczynniki detekcyjne Duolink II (Orange)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Sonda PLA Duolink II anty-mysia MINUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Sonda PLA Duolink II anty-krolicza PLUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Medium montażowe Duolink II z DAPI&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Bufory płuczące Duolink II do fluorescencji&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream bmp4 przy użyciu in situ pla, testu ligacji w bliskości

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Białka BMP odpowiadają za szeroki zakres efektów rozwojowych i biologicznych. Receptory BMP aktywują (fosforylują) efektory Smad1/5/8, które następnie tworzą kompleks z Smad4 i przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych w celu zainicjowania specyficznych efektów downstream BMP 1. Tradycyjne techniki immunofluorescencji z użyciem przeciwciał przeciwko peptydom phospho-Smad charakteryzują się niską czułością, wysokim tłem i oferują jedynie przybliżoną kwantyfikację, ponieważ opierają się na intensywności sygnału przeciwciał, szczególnie jeśli jest to fluorescencja światłoczuła. Ponadto nie wszystkie phospho-Smad muszą znajdować się w kompleksie z Smad4 i brać udział w aktywnej transkrypcji.
In situ PLA to technologia zdolna do wykrywania oddziaływań białkowych z wysoką specyficznością i czułością 2-4. Ta nowa technologia łączy rozpoznawanie przez przeciwciała z amplifikacją DNA będącego substytutem białka. Generuje ona zlokalizowany, dyskretny sygnał w formie punktów, ujawniający dokładną pozycję zdarzenia rozpoznania. Liczbę sygnałów można zliczyć i porównać, co pozwala na przeprowadzenie pomiaru. Zastosowaliśmy metodę in situ PLA, korzystając z zestawu Duolink oraz kombinacji przeciwciał umożliwiającej wykrycie efektorów sygnalizacji BMP, phospho-Smad1/5/8 i Smad4, tylko wtedy, gdy znajdują się one w bliskim sąsiedztwie, t.j. w kompleksie, co następuje jedynie podczas aktywacji sygnalizacji. Pozwoliło to po raz pierwszy na wizualizację i pomiar endogennej sygnalizacji BMP z wysoką specyficznością i czułością w eksperymencie z przebiegiem czasowym pod wpływem stymulacji BMP4.

W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Białka BMP odpowiadają za szeroki zakres efektów rozwojowych i biologicznych. Receptory BMP aktywują (fosforylują) efektory Smad1/5/8, które następnie...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji BMP w komórkach hodowli tkankowych. Białka BMP wiążą się z receptorami na powierzchni komórki i fosforylują trzy efektory smad: smad one, smad five oraz SMAD eight. Tworzą one kompleksy z smad four i przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie regulują transkrypcję.W niniejszym doświadczeniu wykorzystujemy metodę PLA do wizualizacji kompleksów tworzących się między endogennymi efektorami SMA a białkiem smad four w komórkach hodowli tkankowej, z pobudzeniem BMP lub bez niego. Procedura rozpoczyna się od równoległego zastosowania dwóch przeciwciał pierwszorzędowych, z których jedno rozpoznaje wszystkie trzy fosforylowane efektory smma, a drugie rozpoznaje smad four. Przeciwciała drugorzędowe, zwane sondami PLA, z których każda posiada przyłączoną unikalną krótką nić DNA, wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi w miejscach, gdzie sondy PLA znajdują się w bliskim sąsiedztwie. Nicie DNA wchodzą w interakcję po późniejszym dodaniu dwóch oligonukleotydów DNA tworzących koło.Zostają one połączone poprzez ligację enzymatyczną, tworząc pierścień, który po reakcji amplifikacji ulega powieleniu w procesie izotermicznej amplifikacji kołowej (rolling circle replication). Hybrydyzacja znakowanych, komplementarnych sond oligonukleotydowych pozwala uwydatnić fluorescencyjne punkty produktu związane z amplifikacją każdego kolistego produktu DNA, które są łatwo widoczne.Podczas obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym kropki odpowiadają kompleksom efektora, seds i smad four, co oznacza aktywną sygnalizację BMP w komórce. Głównymi zaletami PLA w porównaniu z istniejącymi metodami jest łatwość użycia, wysoka czułość oraz brak tła, a także możliwość wykorzystania tej metody do ilościowego określenia aktywnej sygnalizacji BMP in situ. Szlak BMP jest niezbędny dla rozwoju wielu organów i tkanek oraz dla procesów obejmujących proliferację i różnicowanie komórek macierzystych.Metoda PLA może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące dynamiki sygnalizacji BMP, jej poziomów oraz lokalizacji subkomórkowej, ale może służyć również do celów diagnostycznych. Ponieważ szlak ten leży u podłoża wielu chorób, BLA można wykorzystać do badania innych komponentów przekazywania sygnału w szlaku BMP lub innych szlakach, a także dostosować do pracy na przekrojach tkanek lub całych embrionach. Aby rozpocząć test przybliżonej ligacji in situ, należy przygotować hodowle komórkowe; komórki Neuro two A hoduje się w pożywce GMEM uzupełnionej o 10% FBS, 1x nieessentialne aminokwasy, 1x pirowinian oraz 1x L-glutaminę.Rozdziel komórki za pomocą trypsyny i wysiej od 15 000 do 20 000 komórek na dołek. W 16-dołkowym szkiełku do komór inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% carbon dioxide przez 24 godziny. Po 24 godzinach.Wymień pożywkę hodowlaną na uzupełnione, beztłuszczowe pożywienie GMEM i inkubuj próbki kontrolne przez kolejne dwie do trzech godzin. Trzy studzienki z komórkami utrzymuj w normalnych warunkach hodowli po drugiej inkubacji. Zahamuj szlak BMP, traktując komórki dwumikromolarną darsamorfiną, lub indukuj sygnalizację, traktując komórki BMP 4 przez 10 do 60 minut.Po stymulacji komórek odessać pożywkę z dołków i delikatnie przemyć komórki roztworem PBS, aby uniknąć ich odklejenia. Nie pipetować PBS bezpośrednio na komórki. Następnie odessać PBS i usunąć komory, pozostawiając silikon wokół dołków.Do dołków dodać 50 µL świeżo przygotowanego i przefiltrowanego 4% paraformaldehydu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wytrząsania. Po utrwaleniu przemyć komórki buforem PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem w naczyniu typu copin. Powtórzyć płukanie dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić trzy przemycia.Następnie przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 0,5% Triton X 100 w PBS w naczyniu typu Copin i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie przemyj komórki 0,05% tween 20 i TBS trzykrotnie, po 5 minut na każde płukanie, z mieszaniem w naczyniu typu Copin. Rozpocznij procedurę blokowania, lekko uderzając w preparat, aby usunąć ostatnią porcję roztworu do płukania.Należy uważać, aby nie doprowadzić do wyschnięcia komórek. Do każdej studzienki z roztworem blokującym należy dodać jedną kroplę DUO link. Inkubować komórki w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze 37°C w podgrzewanej komorze wilgotnościowej, wykonanej z pustego pudełka na końcówki do pipet z wodą destylowaną.Aby przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych, należy rozcieńczyć przeciwciała anty-phospho smad 1 5 8 oraz anty-SMAD four one w stosunku 1:100 w rozcieńczalniku DuoLink Two Antibody Diluent. Każde przeciwciało należy zastosować pojedynczo oraz w kombinacjach. Następnie należy opukać preparat, aby usunąć z niego roztwór blokujący, a do odpowiednich dołków dodać po 40 µL roztworów przeciwciał. Można dołączyć kontrolę negatywną z samym rozcieńczalnikiem.Wykonaj ten krok szybko, aby komórki nie wyschły. Następnie inkubuj preparaty w temperaturze 37°C w uprzednio podgrzanej komorze wilgotnej przez jedną godzinę. Podczas inkubacji rozcieńcz dwie sondy PLA w rozcieńczalniku.Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodaj 8 µL każdej sondy oraz 24 µL rozcieńczalnika, aby sondy zostały rozcieńczone w roztworze w stosunku 1:5. Po jednogodzinnej inkubacji odlej roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyj preparaty dwukrotnie buforem Duo link to Wash Buffer a przez 5 minut każdego mycia w temperaturze pokojowej, wytrząsając je w naczyniu do sprzęgania. Po zakończeniu płukania odlej pozostały bufor myjący A z preparatów i dodaj do każdego z nich 40 µL roztworu sond PLA.Następnie inkubuj preparaty na szkiełkach w temperaturze 37 °C w uprzednio podgrzanej, nawilżonej komorze. Przez jedną godzinę przygotuj odpowiednią objętość mieszaniny ligacyjnej z zapasu duo link ligation stock. W tym celu najpierw wymieszaj zapas duo link ligation stock w wortexie, a następnie rozcieńcz go do stężenia 1x w wodzie wysokiej czystości.Należy pamiętać, że enzym ligaza jest dodawany do tego roztworu w stosunku 1:40, a na każdą studniczkę wymagane jest 40 µL mieszaniny. Po inkubacji należy usunąć roztwór sond PLA z szkiełek i przemyć je dwukrotnie buforem do mycia (Wash Buffer). Podczas ostatniego mycia, które trwa pięć minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu w naczyniu do sprzęgania, należy wyjąć Duo link Ligase z bloku chłodzącego, a następnie dodać go do roztworu ligacji do końcowego rozcieńczenia 1:40 i wymieszać na vortexie.Następnie odsącz końcową objętość Buforu do Płukania A z prowadnic i dodaj 40 µL produktu ligacji. Wymieszaj z enzymem w każdej studni. Inkubuj prowadnice w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut.W temperaturze 37°C rozmrozić zapas do amplifikacji DUO link i przygotować etap amplifikacji podczas inkubacji, rozcieńczając zapas do amplifikacji DUO Link w wodzie o wysokiej czystości do stężenia 1x. Odczynniki należy przechowywać w ciemności, ponieważ są one wrażliwe na światło. Po zakończeniu etapu ligacji odlać roztwór i przemyć preparaty dwukrotnie Buforem do Mycia A przez dwie minuty każdy, w temperaturze pokojowej, z wytrząsaniem w naczyniu do sprzęgania; podczas ostatniego mycia dodać polimerazę duo link do roztworu amplifikacyjnego do końcowego rozcieńczenia 1:280 i wymieszać za pomocą wortexa. Po odlaniu buforu do mycia dodać 40 µL mieszaniny amplifikacyjnej do każdej studni i inkubować preparaty w ciemnej, wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37°C.Po zakończeniu inkubacji podczas amplifikacji, zlej roztwór polimerazy z szkiełek i przemyj je dwukrotnie w buforze do mycia Wash buffer B przez 10 minut każdego mycia, umieszczając je w naczyniu do sprzęgania; podczas tego kroku należy chronić szkiełka przed światłem, ponieważ odczynniki są światłoczułe. Po dwóch myciach zanurz szkiełka w 0,1-krotnym stężeniu buforu do mycia Wash buffer B. Następnie całkowicie usuń silikon z szkiełka 16-dołkowego, a potem dodaj około 40 µL roztworu duo.Nanieś medium montażowe za pomocą pipety na szkiełko nakrywkowe i ostrożnie połóż je na próbkach, lekko dociskając, aby pod szkiełkiem nie pozostały pęcherzyki powietrza; utrwal i zabezpiecz szkiełko nakrywkowe na preparacie za pomocą laku do paznokci, odczekując co najmniej 15 minut przed obrazowaniem. Są to obrazy konfokalne komórek, które były traktowane 2 µM dorsomorfiny, inhibitora szlaku BMP, lub traktowane 25 ng/mL BMP4 przez 60 minut.Do detekcji aktywnych kompleksów smad wykorzystano przeciwciała przeciwko Phospho Smad 1 58 oraz Smad four, które widoczne są jako czerwone punkty. Jądra komórkowe zostały zabarwione na niebiesko przy użyciu dpi. Sygnały PLA przeliczono za pomocą oprogramowania DUO link image tool, a średnią liczbę punktów w jądrze na jedną komórkę przedstawiono na wykresie.Brak barwienia w przypadku zastosowania każdego z przeciwciał pierwszorzędowych osobno wskazuje na brak niespecyficznego wiązania sond PLA i następującego po nim ligowania oligonukleotydów. Podobnie, żadnych sygnałów punktowych nie wykryto w innym kontrolnym punkcie negatywnym z pominięciem obu przeciwciał pierwszorzędowych. W analizie immunoblottingu SDS-PAGE komórek neuro 2A wykazano obecność fosforylowanych białek SMAD 1 5 8 w komórkach niepoddanych działaniu czynnika oraz w komórkach traktowanych BMP.Niemniej jednak poziomy phospho smad są wyraźnie obniżone w komórkach traktowanych morfiną grzbietową. Przeciwciało przeciwko PCNA służy jako kontrola ładowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu postępowania zgodnie z opisanymi krokami oraz konfiguracją, którą sugerujemy, aby uzyskać wyniki w czasie krótszym niż sześć godzin od utrwalenia komórek.Podsumowując, kolejne etapy obejmują inkubację z przeciwciałem blokującym, inkubację z sondami PLA, ligację z amplifikacją, montowanie oraz obrazowanie.

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie kompleksów efektorowych sygnałowych w dół strumieniowym od BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu wiązania bliskiego sąsiedztwa

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Poznaj metodę PLA do wizualizacji i ilościowego oznaczania sygnalizacji BMP4 w komórkach Neuro 2A. Technika ta umożliwia wykrywanie aktywnych kompleksów efektorowych in situ z wysoką czułością.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Przeglądaj więcej filmów