Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Dzień dobry, nazywam się Oliver Yu i reprezentuję Dan Plant Science Center. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak generować rośliny transgeniczne za pomocą Agrobacterium Ogn. Technika ta została wprowadzona do Dan Center przez dr. Chrisa Taylora, obecnie pracującego na Ohio State University.

Kilku moich byłych członków grupy udoskonaliło te techniki na przestrzeni lat, a obecnie członkowie mojej grupy, dr Stone i Mao, przygotowali ten film, aby pokazać, jak tworzone są kompozytowe układy korzeniowe Harry Root. Agrobacterium ZOS są bardzo podobne do Agrobacterium tumefaciens pod względem wprowadzania obcego DNA do roślin, jednak ZOS mogą indukować intensywniejsze formowanie korzeni w tkankach typu dzikiego, tworząc rośliny kompozytowe, takie jak ta. Zatem w tych roślinach kompozytowych niektóre korzenie są transgeniczne, podczas gdy pędy pozostają typu dzikiego.

W związku z tym technologia ta nie będzie wytwarzać nasion transgenicznych. Istnieją jednak trzy główne zalety roślin z wysoką wydajnością regeneracji korzeni, które sprawiają, że technologia ta jest bardzo użyteczna. Po pierwsze, wiele gatunków roślin, zwłaszcza gatunki dwuimienne, może zostać przekształconych za pomocą Agrobacterium.

Po drugie, przed transformacją nie musimy zakładać kultur tkankowych. Możemy wykorzystać wiele części roślin, takich jak siewki, pędy i korzenie, aby bezpośrednio generować rośliny kampy. I wreszcie, transgeniczna tkanka korzenia może być uzyskana w ciągu zaledwie kilku tygodni.

W przypadku transformacji soi oraz lucerny medycznej możemy uzyskać korzenie transgeniczne w czasie krótszym o trzy tygodnie niż przy transformacji OPIS. Ogólnie rzecz biorąc, technologia hodowli roślin z wyższymi komórkami korzenia jest bardzo użytecznym narzędziem do badania funkcji genów oraz fenotypów związanych z korzeniami. Witajcie, nazywam się Ong.

Witajcie, nazywam się [Imię], a to jest mój operator Bill. Dzisiaj przedstawimy protokół Harry root Composite Plant. Ten protokół wykorzystujemy w wielu naszych projektach.

Już zaczęliśmy, tak. W naszej demonstracji posłużymy się przykładem meta cargo Tula. Są to dojrzałe strąki meta cargo.

Umieść strąki w moździerzu, a następnie rozetrzyj je długim, zdecydowanym ruchem. Oddziel nasiona od strąków poprzez delikatne potrząsanie; umieść nasiona w probówce do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj 5 mililitrów stężonego kwasu siarkowego.

Bardzo ostrożne wirowanie. Trwa około 10 minut. Wirować probówkę w wortexie dwa lub trzy razy.

Podczas traktowania kwasem łupiny nasion zmieni kolor na żółty. Usunąć kwas siarkowy z probówki i przepłukać nasiona co najmniej pięć razy sterylną wodą. Namoczyć nasiona w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej przez sześć godzin, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C przez dwa dni.

Aby zsynchronizować kiełkowanie, należy rozłożyć od 20 do 30 nasion na wilgotnym papierze filtracyjnym w szalce Petriego. Po pięciu do sześciu dniach przenieść siewki do gleby, a następnie hodować je w szklarni przez cztery tygodnie.

Do transformacji roślin kompozytowych zazwyczaj stosujemy szczep agrobacterium Zony K 5 99. Wektor wahadłowy lub wektor binarny można wprowadzić do szczepu K 5 99 zgodnie ze standardowym protokołem transformacji agrobacterium tumefaciens. Należy zaszczepić agrobacterium i inkubować je w temperaturze 30 °C przez 16 do 24 godzin. Po okresie wzrostu komórki należy zebrać, przelewając roztwór hodowlany do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Wirować w wirówce przy 5 000 G przez 30 minut. Resuspender osad w pożywce wolnej od azotu. Należy rozcieńczyć komórki agrobakterii do poziomu 0,3 przy OD 600.

Stężenie to jest kluczowe dla maksymalizacji wydajności transformacji. Jako macierz wspierającą wykorzystujemy ściankę skalną. Zastosowanie tego materiału jest istotne dla uzyskania wysokiej częstotliwości transformacji.

Dotnij ściankę skalną do odpowiedniego rozmiaru. Kawałek skalny. Wywierć w górnej części otwór o średnicy około 1,5–2 cm. Za pomocą końcówki pipety dodaj 5 ml roztworu resuspenderowanego Agrobacterium Zony do każdego kawałka.

Wybierz fragment łodygi z dwiema lub trzema pąkami pomocniczymi i wykonaj skośne cięcie. Włóż fragmenty rośliny do otworu w skalnej ścianie. Umieść cięte rośliny w komorze wzrostu lub na blacie laboratoryjnym na trzy tygodnie.

Co 10 dni dodaj pięć mililitrów pożywki do każdej wtyczki. Po trzech tygodniach od strony cięcia zregenerują się korzenie. Namocz roślinę w wodzie.

Ostrożnie usuń zmiękczoną ściankę skalną, uważając, aby nie uszkodzić korzeni. Upewnij się, że cała ścianka skalna została usunięta. Kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami można przenieść na piasek lub perlit. W przypadku eksperymentów nad symbiozą, hoduj rhizobium w pożywce z ekstraktem drożdżowym manito przez siedem dni w temperaturze 30 °C.

Zebrać komórki zoia Resus. Zawiesić osad w pożywce bezazotowej. Rozcieńczyć roztwór do wartości 0,08 przy OD 600.

Do każdej kompozytowej kultury roślin dodać 10 mililitrów roztworu ZOA, a następnie hodować rośliny przez dodatkowe dwa do trzech tygodni, aby umożliwić formowanie się brodawek korzeniowych. Usunąć piasek z roślin kompozytowych poprzez ich wyrywanie i przemywanie. Wykorzystać ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w celu sprawdzenia transgenicznych korzeni.

W tym celu należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie nasze konstrukty korzeni włochatych posiadają konstytutywną kasetę GFP służącą do przesiewania linii transgenicznych. Na zdjęciu przedstawiono kompozytowe rośliny z transgenicznymi korzeniami włochatymi GFP obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Korzenie transgeniczne o intensywniejszej zielonej fluorescencji są łatwe do odróżnienia od korzeni nietransgenicznych. W włochatych korzeniach roślin kompozytowych powstają brodawki. Poniżej znajduje się pełny protokół.

Ponownie podkreślamy, że generowanie roślin kompozytowych z korzeniami włóknistymi jest szybką i łatwą metodą pozyskiwania dużych ilości tkanki transgenicznej, szczególnie w przypadku gatunków diploidalnych. Chociaż metoda ta nie pozwala na uzyskanie nasion transgenicznych, umożliwia ona wytworzenie materiału transgenicznego w ciągu kilku tygodni. Jest ona szczególnie odpowiednia dla roślin, w przypadku których występuje trudność w ustanawieniu kultury tkankowej i transformacji.

Na przestrzeni lat wykorzystywaliśmy tę technologię do badania funkcji genów, funkcji promotorów, mikroRNA, rozwoju korzeni i korzeni bocznych, odpowiedzi obronnej i stresowej na antybiotyki, nodulacji oraz innych procesów symbiotycznych. Przeprowadziliśmy badania nad odpowiedzią hormonalną, profilowaniem metabolicznym, profilowaniem genów oraz analizą proteomiczną z wykorzystaniem roślin kompozytowych o wyższym stopniu rozwoju korzeni. Mamy nadzieję, że ten materiał wideo pomoże Państwu dostosować ten system do preferowanych gatunków.

Zapraszamy do kontaktu w przypadku pytań dotyczących tej technologii. Powodzenia.