Name: Wytwarzanie roślin kompozytowych w Medicago truncatula stosowanych do testów nodulacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Poznaj metodę tworzenia roślin kompozytowych z włochatymi korzeniami w Medicago truncatula do badań nodulacyjnych. Technika ta umożliwia szybkie uzyskanie transgenicznego materiału korzeniowego bez konieczności stosowania tradycyjnych metod kultur tkankowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr. Chrisowi Taylorowi (Ohio State University) za wprowadzenie technologii korzeni włochatych do naszego laboratorium oraz dr. Senthilowi Subramanianowi (South Dakota State University) i dr. Juanowi Zhangowi (Ludong University, Shandong, Chiny) za udoskonalenie protokołu. Dziękujemy również dr. Hao Chengowi (Nanjing Agriculture University) za pomoc w przygotowaniu tego filmu. Praca ta jest częściowo finansowana z grantów DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) oraz USDA (2010-65116-20514) przyznanych O.Y

Poniższy protokół został zastosowany do generowania kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root” u modelowego gatunku roślin strączkowych M. truncatula. Podobne protokoły zostały dostosowane dla co najmniej ośmiu gatunków roślin 1-4. Wykorzystaliśmy kompozytowe rośliny M. truncatula z korzeniami typu „hairy root” do badania funkcji genów w rozwoju korzeni i brodawek korzeniowych. Protokół został podzielony na cztery sekcje: 1) przygotowanie materiału roślinnego; 2) generowanie kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root”; 3) infekcja symbiotyczna Rhizobia; oraz 4) identyfikacja korzeni transgenicznych. Do przesiewania korzeni transgenicznych w roślinach kompozytowych wykorzystaliśmy wektor binarny zawierający gen zielonego białka fluorescencyjnego (gfp) jako reporter 3. W porównaniu z selekcją opartą na antybiotykach, przesiewanie oparte na GFP jest szybkie, łatwe i niedrogie. W naszej konstrukcji gen gfp zoptymalizowany pod kątem ekspresji w retikulum endoplazmatycznym (ER) jest sterowany przez super-promotor ubikwityny, który wykazuje silne konstytutywne sygnały GFP w korzeniach transgenicznych, co pozwala na łatwe odróżnienie korzeni transgenicznych od nietransgenicznych.
1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Nasiona M. truncautla zbiera się z roślin hodowanych w szklarni (wilgotność względna 50%, cykl światło/ciemność 16/8 h, temperatura dzień/noc 22/18°C). Dojrzałe nasiona można przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Około 100 nasion poddaje się skaryfikacji w 10 ml stężonego kwasu siarkowego (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) przez 10 min, okresowo wstrząsając naczyniem.</li>
	<li>Nasiona płucze się 5-7 razy sterylną wodą przy łagodnym mieszaniu.</li>
	<li>Następnie nasiona namacza się w wodzie w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, a następnie przechowuje w temperaturze 4°C przez 36-48 godzin w celu synchronizacji kiełkowania.</li>
	<li>Około 20-30 nasion rozkłada się na zwilżonym papierze filtracyjnym umieszczonym w szalce Petriego. Przechowuje się je w temperaturze 22°C, przy cyklu światło/ciemność 16/8 h i natężeniu światła 40 μmol.m-2.s-1 przez 5-6 dni.</li>
	<li>Wykiełkowane siewki przenosi się do gleby i umieszcza w szklarni na miesiąc.</li>
</ol>
2. Generowanie roślin kompozytowych z korzeniami typu hairy root
<ol>
	<li>Konstrukcje binarne zawierające geny zainteresowania przetransformowano do A. rhizogenes zgodnie ze standardowymi protokołami. Opracowaliśmy zestaw wektorów binarnych zawierających gen gfp jako marker ułatwiający selekcję tkanek transgenicznych. Wektory te zawierają różne promotory i wszystkie posiadają miejsca klonowania Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu nadekspresji lub wyciszenia docelowych genów 3,5.</li>
	<li>A. rhizogenes hoduje się w 50 ml pożywki LB z odpowiednią selekcją antybiotykową w temperaturze 28°C przez 16-24 godziny.</li>
	<li>Bakterie są zbierane i resuspendowane do końcowego stężenia OD600=0.3 w pozbawionym azotu roztworze soli mineralnych dla roślin (Tabela 1 i 6).</li>
	<li>Aby wspomóc regenerację korzeni włochatych, wysterylizowaną matrycę wspierającą („Rock Wool”, Hummert International, Earth City, MO) tnie się na kostki o objętości około 3 cm3. W jednej szalce Petri umieszczamy 4 kostki.</li>
	<li>Na górze każdej kostki za pomocą końcówki pipety wykonuje się otwór, aby ułatwić wprowadzenie eksplantatów. Do każdej kostki dodaje się A. rhizogenes (5 mL).</li>
	<li>Za pomocą cięcia skośnego wycina się fragment pędu z 2-3 pąkami pachymerystycznymi. Następnie eksplantat wprowadza się do kostki i inkubuje w temperaturze 22°C przez około trzy tygodnie. Przez pierwsze 10 dni eksplantaty Medicago pozostawiamy bez podlewania, a następnie w razie potrzeby podlewamy je 5 ml roztworu pozbawionego azotu. Stwierdzono, że usunięcie merystemu wierzchołkowego może zmniejszyć tworzenie się korzeni przybyszowych.</li>
</ol>
3. Infekcja symbiotycznymi ryzobiami (Sinorhizobium Meliloti)
<ol>
	<li>Po trzech tygodniach z wełny mineralnej wyrosną niektóre korzenie przybyszowe. Kompozytowe rośliny z korzeniami włóknistymi przenosi się do piasku lub wermikulitu (sterylizowanego), z wełną mineralną lub bez niej. Są one hodowane w szklarni w temperaturze 22°C, w cyklu światła/ciemności 16/8 h i przy natężeniu światła 300 μmol.m-2.s-1 przez kolejny tydzień.</li>
	<li>Przed infekcją ryzobiami, S. meliloti 1201 jest hodowany w 50 ml pożywki ekstrakt drożdżowy-mannitol przez 7 dni w temperaturze 30 °C (Tabela 2 oraz 6,7).</li>
	<li>Resuspendowane komórki ryzobiów rozcieńcza się do końcowego stężenia OD600=0.08 przy użyciu bezoazotowej roztworu odżywczego. 10 ml świeżej zawiesiny S. meliloti naniesiono na każdą roślinę kompozytową w celu indukowania tworzenia brodawek.</li>
</ol>
4. Identyfikacja korzeni transgenicznych
<ol>
	<li>Dwa tygodnie po inokulacji ryzobiami rośliny kompozytowe są wyrywane poprzez przemywanie w wodzie. Korzenie można łatwo oddzielić od piasku lub perlitu w wodzie.</li>
	<li>Korzenie włochate umieszczamy pod mikroskopem UV (Nikon SMZ1500, wzbudzenie 460-500nm, filtr dichroiczny 505nm, filtr barierowy powyżej 510nm). Korzenie transgeniczne są GFP dodatnie, a korzenie przybyszowe są GFP ujemne. Następnie zbieramy korzenie zgodnie z sygnałem GFP, zliczamy liczbę brodawek, mierzymy długość korzeni i obliczamy gęstość korzeni bocznych. Korzenie GFP ujemne służą jako kontrola.</li>
</ol>
5. Reprezentatywny wynik
W naszym doświadczeniu nowe korzenie włoskowate zregenerowały się z eksplantów w ciągu 2-3 tygodni po inokulacji A. rhizogenes. Pod mikroskopem UV korzenie transgeniczne niosące gen gfp wykazują silną zieloną fluorescencję (Ryc. 1). Liczba zregenerowanych korzeni oraz odsetek korzeni dodatnich pod kątem GFP zależą od stanu eksplantów i środowiska wzrostu roślin kompozytowych. Średnio 25% wytworzonych korzeni stanowiły transgeniczne korzenie włoskowate 3. Aby zwiększyć wydajność transformacji: 1) plastikowa kopuła osłonowa, przedstawiona na filmie, jest wystarczająca do utrzymania wilgotności w tacy hodowlanej przez pierwsze kilka dni, a rośliny wymagają wtedy niewielkiej ilości wody. Nadmierne podlewanie jest niekorzystne dla formowania się korzeni włoskowatych; 2) stężenie inokulum Agrobacterium jest istotne dla transformacji. Nadmierna liczba komórek nie sprzyja formowaniu się korzeni włoskowatych ani grudek bakteryjnych. W przypadku formowania grudek roztwór do podlewania musi być pozbawiony azotu, w przeciwnym razie utworzy się niewiele grudek.
Kompozytowe rośliny z korzeniami typu hairy root można wytworzyć, wykorzystując jako materiał wyjściowy liścienie lub całe siewki. W celu generowania korzeni typu hairy root z innych tkanek konieczne są jedynie niewielkie modyfikacje powyższego protokołu 8. Co istotne, każdy korzeń typu hairy root stanowi niezależne zdarzenie transformacji. W związku z tym fenotypy obserwowane w jednej roślinie kompozytowej są sumą kilku zdarzeń transformacji, które wymagają potwierdzenia poprzez powtórzenia na wielu roślinach kompozytowych.
 <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; A, B pokazujące strukturę strzępek grzyba z zaznaczonymi obszarami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. A. Korzenie transgeniczne można wyodrębnić z korzeni włochatych. B. W kompozytowych roślinach z korzeniami włochatymi utworzyły się brodawki. 4-tygodniowe rośliny M. truncatula z korzeniami włochatymi umieszczono pod mikroskopem UV, co pozwoliło na łatwą identyfikację korzeni wykazujących ekspresję GFP. (Czerwona strzałka: korzeń GFP; żółta strzałka: korzeń bez GFP)
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy</td>
			<td>g/200ml</td>
			<td>ml roztworu zapasowego/litr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>12.3</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O</td>
			<td>14.7</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4.3H2O</td>
			<td>6.8</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>11</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe Cl3.6H2O</td>
			<td>0.49</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikroskładniki</td>
			<td>Patrz poniżej</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mikroskładniki odżywcze</td>
			<td>g na litr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>0.142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO₄4.H2O</td>
			<td>0.077</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO44.7H2O</td>
			<td>0.1725</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO₄4.5H2O</td>
			<td>0.037</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4. H2O</td>
			<td>0.024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2. H2O</td>
			<td>0.0025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiSO44</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Bezozotowy roztwór odżywczy
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4·7H2O</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekstrakt drożdżowy</td>
			<td>0,4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH=6,8</td>
			<td>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. pożywka z ekstraktem drożdżowym i mannitolem (na litr)

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Generowanie kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root” jest szybką i łatwą metodą pozyskiwania dużych ilości materiału transgenicznego dla wielu gatunków roślin dwuliściennych. Choć metoda ta nie pozwala na uzyskanie nasion transgenicznych, umożliwia otrzymanie materiałów transgenicznych w ciągu kilku tygodni. Jest ona szczególnie odpowiednia dla roślin, w przypadku których trudno jest ustanowić kultury tkankowe lub wygenerować stabilne transformanty. Na przestrzeni lat wykorzystywaliśmy tę technologię do badania funkcji genów, funkcji promotorów, mikroRNA, rozwoju korzeni oraz korzeni bocznych, odpowiedzi obronnych i reakcji na stres abiotyczny, nodulacji i innych procesów symbiotycznych, odpowiedzi hormonalnych, profilowania metabolicznego, profilowania genów, analiz proteomicznych oraz innych procesów biologicznych. Protokół ten jest niezawodny i powtarzalny.

generowanie roślin kompozytowych u medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Podobnie jak Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes może przenosić obce DNA do komórek roślinnych w oparciu o autonomiczny plazmid indukujący korzenie (Ri). A. rhizogenes może powodować tworzenie się tzw. włochatych korzeni w tkankach roślinnych i formować rośliny kompozytowe po transformacji. W takich roślinach kompozytowych niektóre z regenerowanych korzeni są transgeniczne, niosąc T-DNA typu dzikiego oraz zmodyfikowany wektor binarny; natomiast pędy pozostają nietransgeniczne, służąc jako źródło energii i wsparcie dla wzrostu. Te kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami nie wytwarzają transgenicznych nasion, jednak posiadają szereg istotnych cech, które czynią je bardzo użytecznymi w badaniach nad roślinami. Po pierwsze, dzięki szerokiemu zakresowi gospodarzy, A. rhizogenes może transformować wiele gatunków roślin, zwłaszcza dwuliścienne, co umożliwia inżynierię genetyczną w wielu gatunkach. Po drugie, A. rhizogenes infekuje tkanki i eksplantaty bezpośrednio; aby uzyskać rośliny kompozytowe, nie jest konieczne prowadzenie kultur tkankowych przed transformacją, co czyni je idealnymi do transformacji gatunków roślin trudnych do modyfikacji. Co więcej, transgeniczne tkanki korzeni mogą zostać wygenerowane w ciągu zaledwie kilku tygodni. W przypadku Medicago truncatula transgeniczne korzenie można uzyskać już w trzy tygodnie, co jest szybsze niż standardowa transformacja Arabidopsis metodą floral dip. Ogólnie rzecz biorąc, technologia kompozytowych roślin z włochatymi korzeniami jest wszechstronnym i użytecznym narzędziem do badania funkcji genów oraz fenotypów związanych z korzeniami. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami mogą być wykorzystane do badania interakcji roślina-rhizobium oraz nodulacji u trudnego do transformacji gatunku M. truncatula.

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Podobnie jak Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes może przenosić obce cząsteczki DNA do komórek roślinnych w oparciu o autonomiczny plazmid indukujący korzenie (Ri)...

Dzień dobry, nazywam się Oliver Yu i reprezentuję Dan Plant Science Center. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak generować rośliny transgeniczne za pomocą Agrobacterium Ogn. Technika ta została wprowadzona do Dan Center przez dr. Chrisa Taylora, obecnie pracującego na Ohio State University.Kilku moich byłych członków grupy udoskonaliło te techniki na przestrzeni lat, a obecnie członkowie mojej grupy, dr Stone i Mao, przygotowali ten film, aby pokazać, jak tworzone są kompozytowe układy korzeniowe Harry Root. Agrobacterium ZOS są bardzo podobne do Agrobacterium tumefaciens pod względem wprowadzania obcego DNA do roślin, jednak ZOS mogą indukować intensywniejsze formowanie korzeni w tkankach typu dzikiego, tworząc rośliny kompozytowe, takie jak ta. Zatem w tych roślinach kompozytowych niektóre korzenie są transgeniczne, podczas gdy pędy pozostają typu dzikiego.W związku z tym technologia ta nie będzie wytwarzać nasion transgenicznych. Istnieją jednak trzy główne zalety roślin z wysoką wydajnością regeneracji korzeni, które sprawiają, że technologia ta jest bardzo użyteczna. Po pierwsze, wiele gatunków roślin, zwłaszcza gatunki dwuimienne, może zostać przekształconych za pomocą Agrobacterium.Po drugie, przed transformacją nie musimy zakładać kultur tkankowych. Możemy wykorzystać wiele części roślin, takich jak siewki, pędy i korzenie, aby bezpośrednio generować rośliny kampy. I wreszcie, transgeniczna tkanka korzenia może być uzyskana w ciągu zaledwie kilku tygodni.W przypadku transformacji soi oraz lucerny medycznej możemy uzyskać korzenie transgeniczne w czasie krótszym o trzy tygodnie niż przy transformacji OPIS. Ogólnie rzecz biorąc, technologia hodowli roślin z wyższymi komórkami korzenia jest bardzo użytecznym narzędziem do badania funkcji genów oraz fenotypów związanych z korzeniami. Witajcie, nazywam się Ong.Witajcie, nazywam się [Imię], a to jest mój operator Bill. Dzisiaj przedstawimy protokół Harry root Composite Plant. Ten protokół wykorzystujemy w wielu naszych projektach.Już zaczęliśmy, tak. W naszej demonstracji posłużymy się przykładem meta cargo Tula. Są to dojrzałe strąki meta cargo.Umieść strąki w moździerzu, a następnie rozetrzyj je długim, zdecydowanym ruchem. Oddziel nasiona od strąków poprzez delikatne potrząsanie; umieść nasiona w probówce do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj 5 mililitrów stężonego kwasu siarkowego.Bardzo ostrożne wirowanie. Trwa około 10 minut. Wirować probówkę w wortexie dwa lub trzy razy.Podczas traktowania kwasem łupiny nasion zmieni kolor na żółty. Usunąć kwas siarkowy z probówki i przepłukać nasiona co najmniej pięć razy sterylną wodą. Namoczyć nasiona w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej przez sześć godzin, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C przez dwa dni.Aby zsynchronizować kiełkowanie, należy rozłożyć od 20 do 30 nasion na wilgotnym papierze filtracyjnym w szalce Petriego. Po pięciu do sześciu dniach przenieść siewki do gleby, a następnie hodować je w szklarni przez cztery tygodnie.Do transformacji roślin kompozytowych zazwyczaj stosujemy szczep agrobacterium Zony K 5 99. Wektor wahadłowy lub wektor binarny można wprowadzić do szczepu K 5 99 zgodnie ze standardowym protokołem transformacji agrobacterium tumefaciens. Należy zaszczepić agrobacterium i inkubować je w temperaturze 30 °C przez 16 do 24 godzin. Po okresie wzrostu komórki należy zebrać, przelewając roztwór hodowlany do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.Wirować w wirówce przy 5 000 G przez 30 minut. Resuspender osad w pożywce wolnej od azotu. Należy rozcieńczyć komórki agrobakterii do poziomu 0,3 przy OD 600.Stężenie to jest kluczowe dla maksymalizacji wydajności transformacji. Jako macierz wspierającą wykorzystujemy ściankę skalną. Zastosowanie tego materiału jest istotne dla uzyskania wysokiej częstotliwości transformacji.Dotnij ściankę skalną do odpowiedniego rozmiaru. Kawałek skalny. Wywierć w górnej części otwór o średnicy około 1,5–2 cm. Za pomocą końcówki pipety dodaj 5 ml roztworu resuspenderowanego Agrobacterium Zony do każdego kawałka.Wybierz fragment łodygi z dwiema lub trzema pąkami pomocniczymi i wykonaj skośne cięcie. Włóż fragmenty rośliny do otworu w skalnej ścianie. Umieść cięte rośliny w komorze wzrostu lub na blacie laboratoryjnym na trzy tygodnie.Co 10 dni dodaj pięć mililitrów pożywki do każdej wtyczki. Po trzech tygodniach od strony cięcia zregenerują się korzenie. Namocz roślinę w wodzie.Ostrożnie usuń zmiękczoną ściankę skalną, uważając, aby nie uszkodzić korzeni. Upewnij się, że cała ścianka skalna została usunięta. Kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami można przenieść na piasek lub perlit. W przypadku eksperymentów nad symbiozą, hoduj rhizobium w pożywce z ekstraktem drożdżowym manito przez siedem dni w temperaturze 30 °C.Zebrać komórki zoia Resus. Zawiesić osad w pożywce bezazotowej. Rozcieńczyć roztwór do wartości 0,08 przy OD 600.Do każdej kompozytowej kultury roślin dodać 10 mililitrów roztworu ZOA, a następnie hodować rośliny przez dodatkowe dwa do trzech tygodni, aby umożliwić formowanie się brodawek korzeniowych. Usunąć piasek z roślin kompozytowych poprzez ich wyrywanie i przemywanie. Wykorzystać ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w celu sprawdzenia transgenicznych korzeni.W tym celu należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie nasze konstrukty korzeni włochatych posiadają konstytutywną kasetę GFP służącą do przesiewania linii transgenicznych. Na zdjęciu przedstawiono kompozytowe rośliny z transgenicznymi korzeniami włochatymi GFP obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym.Korzenie transgeniczne o intensywniejszej zielonej fluorescencji są łatwe do odróżnienia od korzeni nietransgenicznych. W włochatych korzeniach roślin kompozytowych powstają brodawki. Poniżej znajduje się pełny protokół.Ponownie podkreślamy, że generowanie roślin kompozytowych z korzeniami włóknistymi jest szybką i łatwą metodą pozyskiwania dużych ilości tkanki transgenicznej, szczególnie w przypadku gatunków diploidalnych. Chociaż metoda ta nie pozwala na uzyskanie nasion transgenicznych, umożliwia ona wytworzenie materiału transgenicznego w ciągu kilku tygodni. Jest ona szczególnie odpowiednia dla roślin, w przypadku których występuje trudność w ustanawieniu kultury tkankowej i transformacji.Na przestrzeni lat wykorzystywaliśmy tę technologię do badania funkcji genów, funkcji promotorów, mikroRNA, rozwoju korzeni i korzeni bocznych, odpowiedzi obronnej i stresowej na antybiotyki, nodulacji oraz innych procesów symbiotycznych. Przeprowadziliśmy badania nad odpowiedzią hormonalną, profilowaniem metabolicznym, profilowaniem genów oraz analizą proteomiczną z wykorzystaniem roślin kompozytowych o wyższym stopniu rozwoju korzeni. Mamy nadzieję, że ten materiał wideo pomoże Państwu dostosować ten system do preferowanych gatunków.Zapraszamy do kontaktu w przypadku pytań dotyczących tej technologii. Powodzenia.

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie roślin kompozytowych w Medicago truncatula stosowanych w badaniach węzła korzeniowego

Opisano test oparty na śmierci komórek w celu badania PTI u roślin Nicotiana benthamiana.

Analiza odporności wywołanej przez wzorce molekularne związane z patogenami (PTI) u roślin

Opisano dwie odrębne metody przesiewania roślin pod kątem infekcji nicielami okrągłymi (nematodami) tworzącymi narośla korzeniowe. Opisane podejścia obejmują wysokoprzepustowe badania z użyciem nematod w sposób niedestrukcyjny, co ułatwia wykorzystanie tych roślin w programach hodowlanych.

Przesiewy wysokoprzepustowe i niskoprzepustowe z wykorzystaniem nicieni korzeniowych Meloidogyne spp.

Wzrost roślin Medicago truncatula w symbiozie z bakteriami wiążącymi azot Sinorhizobium meliloti w indywidualnych, sterylnych mikrokosmosach wykonanych ze standardowych płytek laboratoryjnych pozwala na częste badanie systemów korzeniowych i guzków bez uszczerbku dla sterylności. Rośliny można utrzymywać w tych komorach wzrostowych do 9 tygodni.

Jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym Sinorhizobium meliloti

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.

Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Parasponia andersonii to szybko rosnące drzewo tropikalne, które należy do rodziny konopi (Cannabaceae) i może tworzyć brodawki korzeniowe wiążące azot w połączeniu z rhizobium. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół odwrotnych analiz genetycznych u P. andersonii w oparciu o stabilną transformację za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9.

Transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa Cannabaceae Parasponia andersonii wiążącego azot

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół jednoetapowej metody transformacji, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, w celu produkcji roślin kompozytowych.

Wydajna i powtarzalna metoda wytwarzania roślin złożonych metodą transformacji owłosionych korzeni na bazie Agrobacterium rhizogenes

Poznaj metodę tworzenia roślin kompozytowych z włochatymi korzeniami w Medicago truncatula do badań nodulacyjnych. Technika ta umożliwia szybkie uzyskanie transgenicznego materiału korzeniowego bez konieczności stosowania tradycyjnych metod kultur tkankowych.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Przeglądaj więcej filmów