Analiza transkryptomu pojedynczych komórek
25 kwietnia 2011
W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie próbek z pojedynczych komórek do analizy transkryptomu. W pierwszej kolejności osiąga się to poprzez znalezienie komórki odpowiedniej do izolacji. Następnie mikropipetę ustawia się obok komórki przeznaczonej do wyizolowania.
Następnie przykładane jest ssanie do strzykawki, aż komórka zostanie wciągnięta do końcówki mikropipety. Ostatnim krokiem procedury jest odłamanie końcówki mikropipety do probówki zbiorczej i wydmuchanie pozostałej zawartości mikropipety do probówki. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące różnice w populacjach mRNA między komórkami poprzez analizę mikroarray materiału amplifikowanego metodą amplifikacji arna, opisaną również w protokole, lub w innych zastosowaniach, takich jak PCR lub sekwencjonowanie następnej generacji.
Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w różnice między pojedynczymi komórkami, może być ona również zastosowana do przedziałów podkomórkowych, takich jak dendryty lub klasy dendrytów, dostarczając istotnych informacji na temat funkcji dendrytów. Procedurę zademonstruje Jennifer Singh, stażystka podoktorska w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem protokołu pierwotne neurony z hipokampów szczurzych z 18. dnia embrionalnego zostały wysiane na szkiełka przedmiotowe o średnicy 12 mm w naczyniach o średnicy 35 mm i hodowane zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby przygotować pipety do pobierania próbek, należy użyć mikropipetowycza do wyciągnięcia autoklawowanych pipet szklanych do średnicy odpowiedniej dla elektrofizjologii.
Przy użyciu programu ustawionego fabrycznie przez producenta rozmiar otworu nie jest krytyczny, ponieważ końcówka zostanie odłamana przed pobraniem komórek. Pipety należy przechowywać ostrożnie w środowisku wolnym od kurzu, na przykład w słoiku do przechowywania mikropipet, aby końcówki pozostały nienaruszone do momentu zbioru komórek. Przygotować odpowiednią liczbę probówek einor o pojemności 1,7 milliliter, dodając do każdej 2 µL PBS w celu przechowywania zebranego materiału.
Wyjmij z inkubatora jedną szalkę 35 mm z szkiełkami nakrywkami, wykonując tę czynność w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Szybko przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z tej szalki na pokrywkę nowej szalki 35 mm zawierającej HBSS. Niezwykle ważne jest niezwłoczne oddanie nieużywanych szkiełkek nakrywkowych do inkubatora, ponieważ komórki tracą żywotność.
W przypadku pozostawienia na dłuższy czas. Do zbioru komórek niezbędny jest odwrócony mikroskop świetlny z obiektywem 40x, wyposażony w mikromanipulator. Należy użyć uchwytu do pipety z elastycznym przewodem odprowadzającym od uchwytu; przewód należy przymocować do stabilnej powierzchni, aby zapobiec niepożądanemu przemieszczaniu się pipety podczas zbierania.
Na końcu rurki umieść igłę w taki sposób, aby można było przymocować i wymieniać między użytkownikami strzykawkę o pojemności 1 ml z połączeniem luer lock. Przygotuj mikropipetę, kontrolowanie uszkadzając końcówkę poprzez naprężenie chusteczki Kim wipe między palcami jednej ręki i bardzo delikatne przesunięcie końcówki pipety po papierze jeden lub dwa razy. Otwór powinien wynosić w przybliżeniu od 75 do 100% wielkości docelowej komórki.
Zabezpiecz mikropipetę w uchwycie do mikropipety, a następnie przymocuj uchwyt do wkładki w mikromanipulatorach. Na koniec ustaw obiektyw 40 x. Umieść szalkę na stoliku mikroskopu i znajdź obszar komórek odpowiedni do zbioru.
W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych komórka powinna być stosunkowo odizolowana od sąsiednich komórek. Aby zapobiec pobraniu okolicznych komórek lub ich wypustek, należy umieścić komórkę przeznaczoną do zbioru w centrum pola widzenia. Używając mikromanipulatora, wprowadź mikropipetę w kierunku roztworu w naczyniu, w obręb drogi optycznej.
Obniż końcówkę pipety do roztworu. Patrząc przez okular, pipeta powinna być widoczna jako cień w polu widzenia. Od tego momentu wywieraj dodatnie ciśnienie, delikatnie wydmuchując powietrze przez strzykawkę znacznie powyżej płaszczyzny komórek.
Dostosuj położenie końcówki pipety tak, aby znajdowała się w polu widzenia, a następnie ustaw ostrość na końcówkę pipety za pomocą pokręteł grubego ustawiania ostrości. Na tym etapie oceń, czy średnica otworu pipety jest zbyt duża czy zbyt mała. Jeśli średnica otworu jest nieprawidłowa, wymień ją na inną mikropipetę, aż zostanie dobrana odpowiednia średnica, aby zapobiec pęknięciu pipety w obszarze zbierania.
Użyj pokrętła ostrzenia wstępnego, aby przesunąć płaszczyznę ogniskowej, a następnie zbliż końcówkę pipety do komórek za pomocą mikromanipulatorów. Gdy komórki znajdą się bliżej, stosuj ostrzenie precyzyjne, aż komórki i końcówka pipety będą ostre. Zaprzestań stosowania nadciśnienia przed dotarciem do wybranych komórek, aby uniknąć ich zdmuchnięcia z szkiełka podstawowego.
Ustaw końcówkę pipety za pomocą mikromanipulatorów tak, aby dotykała ona ciała komórki przeznaczonej do pobrania. Używając strzykawki, delikatnie zassij zawartość ustami, aż komórka zostanie wciągnięta do końcówki pipety. Jeśli komórka nie wchodzi do pipety, delikatnie przesuń końcówkę bliżej komórki i w dół, aż zostanie ona uniesiona z szkiełka nakrywkowego.
Użyj mikromanipulatora, aby natychmiast przenieść pipetę w górę i wyciągnąć ją z roztworu. Wyjmij pipetę z uchwytu. Trzymając przygotowaną probówkę typu einor o pojemności 1,7 mililitra w jednej ręce, delikatnie odłam końcówkę pipety o krawędź probówki w pobliżu jej dna.
Kierując się w stronę oznaczenia 0,1 mililitra, z końcówką przełamaną wycentrowaną wewnątrz probówki, wprowadź igłę połączoną z strzykawką o objętości jednego mililitra do górnego otworu pipety. Szybko naciśnij tłok, wymuszając wyprysk roztworu z pipety do probówki. Należy uważać, aby końcówka nie dotknęła cieczy znajdującej się na ściankach probówki.
Ponieważ działanie kapilarne zassie ciecz z powrotem do pipety, komórka powinna pozostać w samym czubku końcówki, co powinno być wystarczające do jej prawidłowego wydalenia. Szybko odwiruj zawartość probówki w mikrocentryfużce stołowej i zamroź na suchem lodzie lub umieść na lodzie w celu dalszej obróbki lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie następnej generacji. Przedstawiono tutaj przykład udanego zbioru izolowanego neuronu.
Na początek wybrano obszar o stosunkowo niskiej gęstości komórek. Następnie końcówkę pipety przesunięto w kierunku wybranej komórki. Tutaj przedstawiono pole widzenia po pobraniu komórki.
Należy zauważyć, że procesy otaczające pozostają na szkiełku nakrywce. Z kolei na tej ilustracji przedstawiono dwa obrazy końcówek pipet, których rozmiar jest niewłaściwy do efektywnego zbierania. Taka końcówka doprowadzi do niepełnego zbioru, natomiast końcówka pokazana tutaj spowoduje zebranie otaczającego środowiska.
Po zbiorze i amplifikacji RNA zaleca się przeprowadzenie analizy za pomocą bioanalizatora w celu zbadania rozkładu i ilości amplifikowanego RNA. Pomyślna amplifikacja materiału z pojedynczej komórki pozwoli uzyskać całkowitą ilość rzędu kilku mikrogramów, a rozkład będzie gładki i szeroki. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu kilku minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo; podczas realizacji tej procedury ważne jest stosowanie technik wolnych od RNA.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolowania pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronów szczura w celu analizy transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Technika ta jest możliwa do zaadaptowania do różnych typów komórek, co pozwala na szczegółowe badanie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Transkryptomika
Wstęp
- Analiza pojedynczych komórek pozwala na poznanie heterogeniczności komórkowej.
- Zrozumienie różnic w ekspresji genów jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
- Pierwotne hodowle neuronów są niezbędne do badania funkcji neuronalnych.
- Techniki pozyskiwania materiału są istotne dla dokładnej analizy transkryptomu.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji pojedynczych neuronów.
- Ułatwienie analizy transkryptomu pojedynczych komórek.
- Pogłębienie wiedzy na temat zmienności ekspresji genów w neuronach.
Zastosowane metody
- Izolacja pojedynczych komórek przy użyciu technik mikropipetowania.
- Zastosowanie amplifikacji aRNA do analizy transkryptomu.
- Wykorzystanie odwróconego mikroskopu świetlnego do wizualizacji komórek.
- Mikromanipulator do precyzyjnego pozycjonowania pipety.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja pojedynczych neuronów z kultur pierwotnych.
- Wykazanie różnic w populacjach mRNA pomiędzy izolowanymi komórkami.
- Potencjalne zastosowania w PCR i sekwencjonowaniu nowej generacji.
- Wgląd w funkcje dendrytów poprzez ukierunkowane pobieranie materiału.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia szczegółową analizę transkryptomiczną na poziomie pojedynczych komórek.
- Można ją dostosować do różnych typów komórek poza neuronami.
- Podejście to pogłębia nasze zrozumienie różnorodności komórkowej w tkankach neuronalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza transkryptomu pojedynczych komórek pozwala zespołom biofarmaceutycznym na rozstrzygnięcie heterogeniczności komórkowej i odkrycie różnic w ekspresji genów, które są maskowane w analizach tkanki zbiorczej. Możliwość ta jest kluczowa dla walidacji celów terapeutycznych, ograniczania ryzyka mechanistycznego oraz priorytetyzacji populacji komórek istotnych dla danej choroby we wczesnej fazie odkrywania leków. Integracja solidnych przepływów pracy w analizach pojedynczych komórek zwiększa pewność predykcyjną i wspomaga decyzje dotyczące selekcji projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę ekspresji genów z rozdzielczością pojedynczych komórek, co pozwala wyjaśnić aktywność szlaków i zaangażowanie celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie sygnatur molekularnych między typami komórek a przedziałami wewnątrzkomórkowymi.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez ujawnienie heterogeniczności w tkankach istotnych dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych próbek pojedynczych komórek do dalszych analiz transkryptomicznych.
- Umożliwia powtarzalną izolację i amplifikację RNA z pojedynczych komórek, co wspiera opracowywanie analiz ilościowych.
- Zapewnia skalowalny materiał wejściowy dla platform mikromacierzy, PCR lub sekwencjonowania nowej generacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie profilowania molekularnego z odpowiednimi dla choroby podtypami lub przedziałami neuronalnymi, wspierając odkrywanie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki możliwości przeprowadzania analiz z rozdzielczością na poziomie pojedynczych komórek.
- Zmniejsza ryzyko promowania niereprezentatywnych celów poprzez potwierdzenie ich ekspresji w odpowiednich populacjach komórek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten schemat izolacji pojedynczych komórek i amplifikacji aRNA łączy wczesny etap odkrywania z badaniami przedklinicznymi, dostarczając wysokorozdzielczych danych transkryptomicznych do walidacji celów oraz identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe produkty RNA, odpowiednie do późniejszych analiz wysokoprzepustowych.
- Analityka: Generuje amplifikowane RNA do mikromacierzy lub sekwencjonowania, co umożliwia rzetelne porównanie ekspresji genów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z podtypami lub przedziałami neuronalnymi istotnymi dla danej choroby.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Zapewnia zestandaryzowany, adaptowalny schemat postępowania dla różnych typów komórek i modeli eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i amplifikację pojedynczych komórek, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów o potwierdzonej istotności komórkowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z pojedynczymi komórkami oraz zastosowania technik wolnych od RNA w celu zapobiegania kontaminacji.
- Wymaga dostępu do aparatury do mikromanipulacji oraz platform analitycznych do ilościowego oznaczania i analizy RNA.
- Wymaga standaryzacji protokołów izolacji i amplifikacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do różnych typów komórek i przedziałów subkomórkowych poprzez modyfikacje protokołu.
- Integralność próbek i wydajność RNA są wrażliwe na sposób obchodzenia się z materiałem oraz czas, co wymaga starnego zarządzania przebiegiem prac.
