Analiza transkryptomu pojedynczych komórek
April 25th, 2011
W tym artykule opisujemy prostą metodę pobierania pojedynczych komórek z pierwotnych hodowli neuronów szczurów i późniejszej analizy transkryptomu za pomocą amplifikacji aRNA. Takie podejście można uogólnić na dowolny typ komórki.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbek z pojedynczych komórek do analizy transkryptomu. Osiąga się to poprzez znalezienie najpierw komórki nadającej się do izolacji. Mikropipetę umieszcza się następnie obok komórki, która ma zostać odizolowana.
Następnie do strzykawki przykłada się ssanie, aż do momentu, gdy komórka zostanie wciągnięta do końcówki mikropipety. Ostatnim etapem procedury jest wbicie końcówki mikropipety do probówki zbiorczej i wrzucenie pozostałej zawartości mikropipety do probówki. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują różnice w populacjach mRNA między komórkami poprzez analizę mikromacierzową materiału amplifikowanego przy użyciu metody amplifikacji arna, również opisanej w protokole lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji.
Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd i różnice między pojedynczymi komórkami, może być również stosowana do przedziałów subkomórkowych, takich jak dendryty lub klasy dendrytów, i dostarczać ważnych informacji na temat funkcji dendrytów. Procedurę zademonstruje Jennifer Singh, doktor habilitowany w moim laboratorium Przed rozpoczęciem tego protokołu, pierwotne neurony od 18 dnia embrionalnego, szczura Hippo Campi, zostały posiane na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych w 35-milimetrowej naczyniu i utrzymywane zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Aby przygotować pipety do zbioru, użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć szklane pipety autoklawu do średnicy odpowiedniej dla elektrofizjologii.
Korzystając z wstępnie ustawionego programu producenta, rozmiar otworu nie jest krytyczny, ponieważ końcówka zostanie złamana przed pobraniem ogniw. Ostrożnie przechowuj pipety w środowisku wolnym od kurzu, takim jak słoik do przechowywania mikropipet, w którym końcówki pozostaną nienaruszone, gdy będą gotowe do pobrania komórek. Przygotuj żądaną liczbę 1,7 mililitra probówek einor, dodając dwa mikrolitry PBS do przechowywania zebranego materiału.
Wyjąć 1 35-milimetrową miskę z szkiełkami nakrywkowymi z inkubatora w kapturze do hodowli tkankowych. Szybko przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z tego naczynia na pokrywkę nowego 35-milimetrowego naczynia zawierającego HBSS. Bardzo ważne jest, aby zwracać szkiełka nakrywkowe, które nie są manipulowane, do inkubatora, gdy komórki stają się niezdrowe.
W przypadku pozostawienia na dłuższy czas. Do pobierania komórek niezbędny jest mikroskop światła odwróconego z obiektywem 40x wyposażonym w mikromanipulator. Użyj uchwytu na pipety z elastycznym wężem odchodzącym od uchwytu, przymocuj rurkę do stabilnej powierzchni, aby zapobiec niepożądanemu ruchowi pipety podczas pobierania.
Na końcu rurki włóż igłę, aby można było przymocować jednomililitrową strzykawkę z połączeniem blokady przynęty i wymieniać ją między użytkownikami. Przygotuj mikropipetę, łamiąc końcówkę w kontrolowany sposób, trzymając napiętą chusteczkę Kim między palcami jednej ręki i bardzo delikatnie przesuwając końcówkę pipety po papierze jeden lub dwa razy. Otwór powinien wynosić około 75 do 100% docelowego rozmiaru komórki.
Zamocuj mikropipetę w uchwycie mikropipety i przymocuj uchwyt mikropipety do wkładki na mikromanipulatorach. Na koniec ustaw cel 40x. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu i znajdź obszar komórek odpowiedni do zbioru.
W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych komórka powinna być względnie odizolowana od swoich sąsiadów. Aby zapobiec zbieraniu otaczających komórek i/lub procesów, umieść komórkę, która ma zostać pobrana, w środku pola widzenia. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć mikropipetę w kierunku roztworu w naczyniu na ścieżkę światła.
Opuść końcówkę pipety do roztworu. Patrząc przez okular, pipeta powinna wyglądać jak cień w polu view. Od tego momentu należy wywierać nadciśnienie, lekko przez strzykawkę znacznie powyżej płaszczyzny komórek.
Wyreguluj położenie końcówki pipety, aż znajdzie się w polu view i ustaw ostrość na końcówce pipety za pomocą pokręteł ustawiania ostrości. W tym momencie oceń, czy rozmiar otworu pipety jest za duży lub za mały. Jeśli rozmiar otworu jest nieprawidłowy, wymień go na inną mikropipetę, aż zostanie znaleziony prawidłowy rozmiar otworu, aby zapobiec pęknięciu pipety w obszarze zbierania.
Użyj ostrości kursu, aby przesunąć płaszczyznę ogniskowej przed przesunięciem końcówki pipety w kierunku komórek za pomocą manipulatorów mikrom. W miarę zbliżania się komórek należy używać precyzyjnego ustawiania ostrości, aż zarówno komórki, jak i końcówka pipety będą w ostrości. Przestań wywierać nadciśnienie przed dotarciem do komórek powoda, aby uniknąć zdmuchnięcia ich z szkiełka nakrywkowego.
Umieść końcówkę pipety z mikromanipulatorami tak, aby dotykała somy komórkowej, która ma zostać pobrana. Za pomocą strzykawki delikatnie odsysać ustami, aż komórka wejdzie do końcówki pipety. Jeśli kuweta nie wchodzi do pipety, delikatnie przesuń końcówkę bliżej kuwety i w dół, aż uniesie się z szkiełka nakrywkowego.
Użyj mikromanipulatora, aby natychmiast przesunąć pipetę w górę i wyjąć ją z roztworu. Wyjmij pipetę z uchwytu. Przytrzymaj przygotowaną probówkę einor o pojemności 1,7 mililitra w jednej ręce i delikatnie złamij końcówkę pipety z boku rurki w kierunku dołu.
Dążąc do oznaczenia 0,1 mililitra ze złamaną końcówką wyśrodkowaną wewnątrz probówki, włóż igłę przymocowaną do jednomililitrowej strzykawki do górnego otworu pipety. Szybko wcisnąć tłok, zmuszając roztwór z pipety do rozpylenia się do probówki. Uważaj, aby nie dotknąć końcówki żadnym płynem po bokach tuby.
Ponieważ działanie kapilarne spowoduje wprowadzenie płynu z powrotem do pipety, komórka powinna pozostać na samej końcówce pipety, co powinno być wystarczające do prawidłowego wydalenia komórki. Szybko odwiruj zawartość probówki za pomocą biurkowego mikrofuge i zamroź na suchym lodzie lub umieść na lodzie w celu dalszego przetwarzania lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji. Pokazany tutaj jest przykład udanego zbioru wyizolowanego neuronu.
Na początek wybrano obszar komórek o stosunkowo niskiej gęstości. Końcówka pipety została następnie przesunięta w kierunku żądanej komórki. W tym miejscu pokazane jest pole widzenia po pobraniu komórki.
Należy zauważyć, że otaczające procesy pozostają na szkiełku nakrywkowym. Z drugiej strony, na rysunku przedstawiono dwa obrazy końcówek pipet, które mają nieodpowiedni rozmiar do efektywnego zbioru. Ta wskazówka doprowadzi do niepełnych zbiorów, podczas gdy pokazana tutaj wskazówka spowoduje zbiory w okolicznym środowisku.
Po zbiorach i analizie amplifikacji RNA zaleca się użycie bioanalizatora w celu zbadania rozmieszczenia i ilości amplifikowanego RNA. Udana amplifikacja z materiału jednokomórkowego da całkowite ilości w niskich mikrogramach i będzie miała dystrybucję, która jest gładka i szeroka Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu kilku minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo podczas wykonywania tej procedury, ważne jest, aby użyć techniki wolnej od RNA.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę pobierania pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronów szczurów do analizy transkryptomu przy użyciu amplifikacji aRNA. Technika ta jest przystosowana do różnych typów komórek, umożliwiając szczegółowe badanie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Transkryptomyka
Tło
- Analiza pojedynczych komórek zapewnia wgląd w heterogeniczność komórkową.
- Rozumienie różnic w ekspresji genów jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
- Pierwotne kultury neuronów są niezbędne do badań funkcji neuronów.
- Techniki pobierania są ważne dla dokładnej analizy transkryptomu.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolowywania pojedynczych neuronów.
- Ułatwienie analizy transkryptomu pojedynczych komórek.
- Poprawa zrozumienia zmienności ekspresji genów w neuronach.
Stosowane metody
- Izolowanie pojedynczych komórek za pomocą technik mikropipetowych.
- Zastosowanie amplifikacji aRNA do analizy transkryptomu.
- Zastosowanie mikroskopu świetlnego odwróconego do wizualizowania komórek.
- Użycie mikromanipulatora do precyzyjnego pozycjonowania pipety.
Główne wyniki
- Udane izolowanie pojedynczych neuronów z kultur pierwotnych.
- Demonstracja różnic w populacjach mRNA między izolowanymi komórkami.
- Potencjalne zastosowania w PCR i sekwencjonowaniu nowej generacji.
- Wgląd w funkcje dendrytów poprzez ukierunkowane pobieranie.
Konkluzje
- Metoda ta pozwala na szczegółową analizę transkryptomu na poziomie pojedynczych komórek.
- Może być przystosowana do różnych typów komórek poza neuronami.
- To podejście zwiększa nasze zrozumienie różnorodności komórkowej w tkankach nerwowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptome analysis enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and uncover gene expression differences that are masked in bulk tissue assays. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and prioritizing disease-relevant cell populations in early discovery. Integrating robust single-cell workflows strengthens predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression at the resolution of individual cells, clarifying pathway activity and target engagement.
- Supports biological de-risking by distinguishing molecular signatures between cell types and subcellular compartments.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing heterogeneity within disease-relevant tissues.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell samples for downstream transcriptomic assays.
- Enables reproducible isolation and amplification of RNA from individual cells, supporting quantitative assay development.
- Provides scalable input material for microarray, PCR, or next-generation sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neuronal subtypes or compartments, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling single-cell resolution analyses.
- Reduces risk of advancing non-representative targets by confirming expression in relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell isolation and aRNA amplification workflow bridges early discovery and preclinical research, providing high-resolution transcriptomic data for target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling gene expression analysis at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs suitable for downstream high-throughput assays.
- Analytics: Generates amplified RNA for microarray or sequencing, enabling robust comparison of gene expression across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neuronal subtypes or compartments.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for diverse cell types and experimental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and amplification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated cellular relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling and RNA-free technique to prevent contamination.
- Needs access to micro-manipulation instrumentation and analytical platforms for RNA quantification and analysis.
- Demands cross-team standardization of isolation and amplification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and subcellular compartments with protocol modifications.
- Sample integrity and RNA yield are sensitive to handling and timing, requiring careful workflow management.
