Name: Analiza transkryptomu pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych neuronów z pierwotnych kultur szczura do analizy transkryptomu przy użyciu wzmacniania aRNA. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Kevina Miyashiro za wysiewanie i hodowlę linii komórkowych oraz dla dr Terri Schochet za udostępnienie kultur komórkowych do zdjęć zamieszczonych w niniejszym dokumencie. Dodatkowo podziękowania dla Kevina Miyashiro, dr Petera Buckleya i Tiiny Pertiz za wkład w opracowanie procedury aRNA. Prace te zostały sfinansowane przez National Institute on Aging, National Institute on Mental Health oraz fundusze Human Resources Fact Finder z Commonwealth of Pennsylvania.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
<li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li>
<li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li>
<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr Eberwine jest wynalazcą objętego patentem aRNA, który został licencjonowany firmie LBS technologies, w której Dr Eberwine posiada udziały.

Uwagi i rozwiązywanie problemów
<ul>
<li>Warto wykonać zdjęcia przed i po zabiegu, aby wykazać, że komórka docelowa została wyizolowana, a pozostała półcień pozostał nienaruszony.</li>
<li>Jeśli podczas pobierania do pipety dostaje się zbyt dużo roztworu, można zastosować trójdrożne złączki Luer-Lock oraz tłok strzykawki, aby utrzymać dodatnie ciśnienie w cewce. Wymagana objętość zależy od rodzaju przetwarzania, ale dla większości zastosowań wartość do 5 μl powinna być wystarczająca.</li>
</ul>
Ogólne wskazówki dotyczące technik biologii molekularnej
<ul>
<li>Wszystkie probówki ze stokami należy wymieszać na wirówce laboratoryjnej (vortex) i odwirować przed dodaniem do reakcji. NIGDY nie należy mieszać enzymów na vortexie.</li>
<li>Przed dodaniem enzymu należy dokładnie wymieszać składniki reakcji, aby upewnić się, że bufor ma odpowiednie stężenie.</li>
<li>Jeśli to możliwe, należy przechowywać stoki enzymów w temperaturze -20°C, korzystając z chłodziarek typu stratacooler. W przeciwnym razie należy je wyjąć bezpośrednio przed użyciem, przechowywać w lodzie i niezwłocznie zwrócić do -20°C.</li>
<li>Przy przygotowywaniu więcej niż jednej reakcji zawsze należy sporządzać mieszaniny główne (master mixes), aby zminimalizować błędy pipetowania. Obliczyć wymaganą objętość na podstawie liczby próbek i dodać 10-20% zapasu.</li>
<li>RNA należy przechowywać w temperaturze -80°C, aby opóźnić degradację. RNA jest najstabilniejsze w buforze, co zapobiega apurynacji RNA zachodzącej w warunkach kwasowych.</li>
</ul>
Ogólny zarys procedury aRNA
Rysunek 4A przedstawia pierwszy etap procedury aRNA. W reakcji syntezy pierwszej nici fragment poly-T primera T7-oligo(dT) selekcjonuje gatunki mRNA (długi biały prostokąt) poprzez wiązanie się z ogonami polyA. Niektóre mikroRNA są również poliadenylowane i zostaną wychwycone w tej procedurze. Co ważniejsze jednak, najliczniejsze RNA w komórce, czyli RNA rybosomalne, nie zostaną tak wychwycone. Oligonukleotyd ten służy jako primer dla odwrotnej transkryptazy do syntezy komplementarnej nici cDNA (długi szary prostokąt), wykorzystując mRNA jako matrycę. Fragment T7 primera T7-oligo(dT) wprowadza promotor polimerazy RNA T7 w ramce odczytu z sekwencją antysensowną względem wyjściowego mRNA. Jest on wykorzystywany później w reakcji transkrypcji in vitro.
Następnie mRNA w hybrydzie mRNA/DNA utworzonej w poprzednim kroku jest częściowo hydrolizowane przez RNazę H, co prowadzi do powstania „starterów” RNA (małe białe prostokąty) podobnych do fragmentów Okazaki powstających podczas syntezy DNA na nici opóźnionej. Polimeraza DNA I wykorzystuje fragmenty RNA do inicjacji syntezy DNA, używając jako matrycy DNA komplementarnego do mRNA. Po dotarciu do kolejnego fragmentu RNA, jej aktywność nukleazowa 5' do 3' usuwa rybonukleotydy i zastępuje je deoksyrybonukleotydami. Dodaje się ligazę DNA w celu połączenia wszystkich nici, w których zastąpienie nici prowadzącej nie zostało zakończone. Dodaje się polimerazę DNA T4, aby wypełnić obszary, w których fragmenty RNA służyły jako pierwotne startery dla polimerazy DNA I, tworząc w ten sposóbtęmpo-końcowe dwuniciowe cDNA, które następnie jest oczyszczane przed przeprowadzeniem reakcji IVT.
W reakcji IVT polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7 wbudowanym w dwuniciowe cDNA i syntetyzuje cząsteczki RNA antysensownego (długie czarne prostokąty), wykorzystując nić sensowną jako matrycę. Służy to jako etap amplifikacji, w którym z każdej dwuniciowej cząsteczki cDNA powstają tysiące cząsteczek RNA antysensownego (Rysunek 4A).
Druga runda, przedstawiona na rysunku 4B, rozpoczyna się od reakcji odwrotnej transkrypcji, która nieco różni się od tej z pierwszej rundy, ponieważ startowym RNA jest RNA antysensowne (czarny pełny prostokąt), któremu brakuje ogona poliadenylowanego, będącego celem startera T7-oligo(dT) w pierwszej rundzie. W związku z tym reakcja ta jest inicjowana za pomocą starterów losowych (małe szare prostokąty), a następnie RNA zostaje zdenaturowane. Reakcja syntezy drugiej nici jest inicjowana przez starter T7-oligo(dT), który wiąże się z sekwencją poli-A na końcu 3' sensownego RNA powstałego w poprzedniej reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie przeprowadza się kolejną reakcję IVT w taki sam sposób, jak w pierwszej rundzie. Tę drugą rundę zazwyczaj powtarza się co najmniej raz, aby uzyskać trzy rundy amplifikacji z pojedynczej komórki.
Zastosowania
Techniki przedstawione w niniejszym artykule mogą zostać zastosowane w szerokim zakresie aplikacji. Protokół izolacji pojedynczych komórek można zmodyfikować do użytku w świeżych skrawkach tkanki.14 Choć jest to technicznie trudniejsze, w tym alternatywnym przygotowaniu obowiązują te same zasady. Ponadto, po niewielkiej korekcie rozmiaru pipety, można przeprowadzić pomiary fizjologiczne komórek przed ich pobraniem, co pozwala na ściśle kontrolowane badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi fizjologicznych. Inną niewielką modyfikacją jest izolacja wypustek z somy komórki.15 W tym zastosowaniu ciała komórek należy pobrać jedną pipetą, a następnie, używając nowej pipety, zebrać od 100-300 zidentyfikowanych dendrytów lub aksonów do każdej probówki.16
Po zebraniu komórek można przeprowadzić porównania zawartości i składu mRNA pomiędzy różnymi, a nawet w obrębie tej samej populacji komórek. Włączenie biotynylowanego UTP w trzeciej rundzie syntezy aRNA umożliwia analizę mikromacierzy w celu określenia względnej zawartości mRNA. Skład pierwotnej populacji mRNA może być również określony po procedurze aRNA przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Amplifikowane aRNA może być także wykorzystane do potwierdzenia badań konwersji fenotypu komórkowego, w których pełny zestaw mRNA z jednego typu komórek jest transfekowany do innego typu komórek w celu wywołania przejścia fenotypu tego drugiego typu w fenotyp pierwszego; procedura ta została opracowana w tym laboratorium i jest znana jako TIPeR.17 Badania te są szczególnie użyteczne w analizie stanów chorobowych i fenotypów komórkowych i są obecnie prowadzone w laboratorium. Na materiale amplifikowanym można wykonać RT-PCR lub qPCR, aby potwierdzić ekspresję genów specyficznych dla danej komórki. Dodatkowo, oceny wydajności transfekcji lub transdukcji można przeprowadzić na poziomie pojedynczej komórki.
Zalety i ograniczenia
Jak stwierdzono w streszczeniu, izolacja pojedynczych komórek do analizy eliminuje efekty uśredniania obserwowane podczas analizy heterogenicznych populacji komórkowych. Efekty uśredniania te zniekształcają obraz zawartości mRNA w pojedynczej komórce poprzez nadmierne reprezentowanie obfitych transkryptów oraz uśrednianie, co uniemożliwia wykrycie wielu transkryptów o niskiej liczności. Do sortowania poszczególnych komórek można wykorzystać cytometrię przepływową, jednak metoda ta wymaga znajomości markerów specyficznych dla komórek oraz kosztownego sprzętu.18 Laserowa mikrodysekcja z wykorzystaniem systemów przechwytywania laserowego UV lub IR umożliwia wyizolowanie pojedynczych komórek, a nawet fragmentów wewnątrzkomórkowych, ale wymaga, aby komórki będące przedmiotem zainteresowania znajdowały się na powierzchni bardzo cienkich przekrojów.19 Podobnie jak w przypadku cytometrii przepływowej, laserowa mikrodysekcja również wymaga kosztownego sprzętu.
Jedną z głównych zalet opisanej powyżej techniki zbierania opartej na elektrodach jest możliwość uzyskania cennych danych elektrofizjologicznych z badanej komórki przed jej zebraniem, co pozwala na przeprowadzenie analizy funkcjonalnej i transkryptomicznej na tej samej komórce.20 Wadą naszej techniki jest to, że wymaga ona doświadczenia w obsłudze mikromanipulatorów. Badacze zaznajomieni z mikromanipulatorami uznają tę technikę za bardzo intuicyjną; jednak osoby bez takiego doświadczenia będą musiały opanować precyzyjne ruchy, które są tutaj niezbędne.
Każda technika amplifikacji wiąże się z preferencyjną amplifikacją określonych transkryptów w zależności od ich wielkości oraz składu nukleotydowego.4,6,7 Techniki oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takie jak polimerazy reakcyjna z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) oraz szybka amplifikacja końców cDNA (RACE), prowadzą do wykładniczej amplifikacji transkryptów, podczas gdy procedura amplifikacji aRNA skutkuje amplifikacją liniową. Zatem jedną z głównych zalet procedury aRNA jest zdolność do lepszego zachowania względnej liczby transkryptów mRNA poprzez jedynie liniową amplifikację błędów lub odchyleń występujących w procesie amplifikacji, w przeciwieństwie do wykładniczej amplifikacji wspomnianych błędów i odchyleń.
Procedura aRNA w połączeniu z analizą mikromacierzy umożliwia porównanie poziomu mRNA pomiędzy pojedynczymi komórkami o podobnej lub różnej morfologii, poddanymi lub nie poddanymi działaniu określonych czynników. Dodatkowo, amplifikowany materiał może zostać poddany sekwencjonowaniu nowej generacji.5,8 Należy jednak zachować ostrożność podczas takich analiz, ponieważ w przeciwieństwie do zastosowania starterów przypadkowych w tej procedurze, opisana powyżej metoda z zastosowaniem starterów oligo-dT powoduje preferencyjną amplifikację końców 3' mRNA i zazwyczaj prowadzi do niewielkiego skrócenia materiału amplifikowanego przy każdej kolejnej rundzie. Należy zachować ostrożność podczas analizy wyników mikromacierzy metodami standardowymi, ponieważ w przypadku lekko skróconego materiału amplifikowanego mogą wystąpić fałszywie ujemne wyniki. Ponadto, choć wyniki sekwencjonowania zapewnią pełną sekwencję 5' większości oryginalnych cząsteczek mRNA, sekwencje 5' niektórych mRNA mogą zostać pominięte. Z tych powodów liczba rund amplifikacji powinna być ograniczona.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>szkiełka podstawowe Spiegelgas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>szalki hodowlane Nunc 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Woda do hodowli komórkowych</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Do przygotowania roztworów stosowanych w hodowli komórkowej oraz do płukania szkiełek podstawowych</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, ultrapure</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM z dodatkiem soli Earle'a&amp;rsquo;sole solne i glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Do wysiewania komórek</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>cytozyna beta-D-arabinofuranozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM z dodatkiem soli Earle'a&amp;rsquo;sole L-glutaminy</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>suplement bezsurowiczy B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemowe (średnica zewnętrzna 1,5 mm, długość 100 mm)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Można zastosować dowolną pipetę z borokrzemianowego szkła, pod warunkiem uzyskania odpowiedniej średnicy otworu. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Każdy roztwór będzie odpowiedni, pod warunkiem że składniki nie&amp;rsquo;aby nie zakłócić żadnego z przyszłych etapów przetwarzania (tj. brak Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; lub Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Rozmiar igły (gauge) zależy od średnicy pipet</td></tr><tr><td>mieszanka dNTP</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>oligo dt-T7</td><td>Niestandardowy</td><td>Certyfikat Midland</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do drugiej nici (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Dostarczono z buforem do syntezy drugiej nici</td></tr><tr><td>Ligaza DNA z E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>RNaza H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>zestaw Megascript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Startery losowe</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>odwrotna transkryptaza Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>zestaw (18080-044) zawiera bufor do pierwszej nici (Y02321) oraz DTT</td></tr><tr><td>Zestaw MEGAclear</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania produktów reakcji MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA T4</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do amplifikacji RNA Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Wypalarka do mikropipet typu Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Firma Sutter oferuje wiele innych modeli, z których wiele zostało omówionych w podręczniku.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Wiele innych mikromanipulatorów będzie odpowiednich, np. nowsze modele firmy Eppendorf</td></tr><tr><td>Stojak na pipety</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Będzie się różnić w zależności od mikromanipulatora i średnicy zewnętrznej pipety.</td></tr><tr><td>Zestaw Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Transcriptome Analysis of Single Cells

Wiele technik analizy ekspresji genów opiera się na materiale wyizolowanym z heterogenicznych populacji komórek z homogenatów tkankowych lub komórek w hodowli.1,2,3 W przypadku mózgu obszary takie jak hipokamp zawierają złożoną strukturę różnych typów komórek, z których każda posiada odrębne profile mRNA. Zdolność do pozyskiwania pojedynczych komórek umożliwia bardziej szczegółowe badanie różnic molekularnych między populacjami komórek oraz w ich obrębie. Opisujemy prostą i szybką metodę pozyskiwania komórek do dalszego przetwarzania. Do izolacji (poprzez aspirację) wybranej komórki i wygodnego przeniesienia jej do probówki Eppendorf w celu dalszej obróbki za pomocą dowolnej liczby technik biologii molekularnej wykorzystuje się pipety często stosowane w elektrofizjologii. Nasz protokół można zmodyfikować w celu pozyskiwania dendrytów z hodowli komórkowych lub nawet pojedynczych komórek zacute slice'ów.
Opisujemy również metodę amplifikacji aRNA jako główną aplikację analityczną następującą po izolacji pojedynczych komórek. Metoda ta została opracowana wcześniej w naszym laboratorium jako alternatywa dla innych technik analizy ekspresji genów, takich jak transkrypcja odwrotna czy polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (PCR).4,5,6,7,8 Technika ta umożliwia linearną amplifikację poliaadenylowanego RNA, zaczynając od ilości materiału rzędu femtogramów, co pozwala uzyskać mikrogramowe ilości antysensownego RNA. Materiał poddany amplifikacji linearnej zapewnia dokładniejszą ocenę względnej obfitości składników transkryptomu izolowanej komórki niż wykładnicza amplifikacja metodą PCR. Podstawowa procedura składa się z dwóch rund amplifikacji. W skrócie, do dwuniciowego cDNA utworzonego z transkryptów mRNA wbudowywana jest sekwencja promotora polimerazy RNA T7. Następnie przeprowadza się nocną reakcję transkrypcji in vitro (IVT), w której polimeraza RNA T7 produkuje liczne transkrypty antysensowne z dwuniciowego cDNA. Druga runda powtarza ten proces, lecz z pewnymi różnicami technicznymi, ponieważ materiałem wyjściowym jest RNA antysensowne. Standardem jest powtórzenie drugiej rundy, co daje łącznie trzy rundy amplifikacji. Często trzecia runda reakcji transkrypcji in vitro jest przeprowadzana z użyciem biotynylowanych nukleozydotrifosforanów, dzięki czemu otrzymane RNA antysensowne może być hybrydyzowane i wykrywane na mikromacierzy.7,8

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Wiele technik analizy ekspresji genów opiera się na materiale izolowanym z heterogenicznych populacji komórek pochodzących z homogenizatów tkankowych lub komórek w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie próbek z pojedynczych komórek do analizy transkryptomu. Jest to realizowane poprzez najpierw odnalezienie komórki odpowiedniej do izolacji. Następnie mikro pipetę ustawia się obok komórki przeznaczonej do izolacji.Następnie przyłożono ssanie do strzykawki, aż komórka została wciągnięta do końcówki mikropipety. Ostatnim krokiem procedury jest odłamanie końcówki mikropipety do probówki zbiorczej i wydrukowanie pozostałej zawartości mikropipety do probówki. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące różnice w populacjach mRNA między komórkami poprzez analizę mikroarrays materiału amplifikowanego metodą amplifikacji arna, opisaną również w protokole, lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji.Choć metoda ta może dostarczyć wglądu w różnice między pojedynczymi komórkami, można ją również zastosować do przedziałów subkomórkowych, takich jak dendryty lub klasy dendrytów, co dostarcza istotnych informacji na temat funkcji dendrytów. Procedurę zaprezentuje Jennifer Singh, postdok w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu, pierwotne neurony z hipokampa szczura z 18. dnia embrionalnego zostały wysiane na szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w szalce 35 mm i utrzymywane zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby przygotować pipety do zbioru, należy użyć mikrowyciągacza do pipet, aby wyciągnąć autoklawowane pipety szklane do średnicy odpowiedniej dla elektrofizjologii.Przy użyciu programu predefiniowanego przez producenta średnica otworu nie jest istotna, ponieważ końcówka zostanie odłamana przed pobraniem komórek. Pipety należy ostrożnie przechowywać w środowisku wolnym od kurzu, na przykład w słoiku do przechowywania mikropipet, aby końcówki pozostały nienaruszone do momentu zbierania komórek. Przygotować odpowiednią liczbę probówek typu einor o pojemności 1,7 ml, dodając 2 µL PBS w celu przechowywania pobranego materiału.Wyjmij z inkubatora w komorze do hodowli tkanek jedną szalkę o średnicy 35 mm z szkiełkami nakrywkowymi. Szybko przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z tej szalki na pokrywkę nowej szalki o średnicy 35 mm zawierającej HBSS. Niezbędne jest bezzwłoczne zwrócenie pozostałych szkiełków nakrywkowych do inkubatora, ponieważ komórki mogą utracić żywotność.W przypadku pozostawienia na dłuższy czas. Do zbioru komórek niezbędny jest odwrócony mikroskop świetlny z obiektywem 40x oraz zamontowanym mikromanipulatorem. Należy użyć uchwytu do pipety z elastycznym przewodem prowadzącym od uchwytu; przewód ten należy przymocować do stabilnej powierzchni, aby zapobiec niepożądanemu przemieszczaniu się pipety podczas zbierania.Na końcu rurki należy umieścić igłę w taki sposób, aby można było przymocować i wymieniać między użytkownikami strzykawkę o pojemności 1 mL z połączeniem Luer-Lock. Mikropipetę przygotowuje się poprzez kontrolowane ścięcie końcówki: należy naciągnąć chusteczkę Kim wipe między palcami jednej ręki i bardzo delikatnie przesunąć końcówkę pipety po papierze jeden lub dwa razy. Otwór powinien mieć wielkość około 75 do 100% rozmiaru docelowej komórki.Zabeziecz mikropipetę w uchwycie do mikropipet i przymocuj uchwyt do elementu mocującego mikromanipulatorów. Następnie ustaw obiektyw 40x. Umieść szalkę na stole mikroskopu i znajdź obszar komórek odpowiedni do zbioru.W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych komórka powinna być stosunkowo odseparowana od sąsiednich komórek. Aby zapobiec pobraniu sąsiednich komórek lub ich wypustek, należy umieścić komórkę przeznaczoną do pobrania w centrum pola widzenia. Za pomocą mikromanipulatora należy przesunąć mikropipetę w stronę roztworu w naczyniu, wprowadzając ją w tor światła.Zanurz końcówkę pipety w roztworze. Patrząc przez okular, pipeta powinna być widoczna jako cień w polu widzenia. Od tego momentu przykładaj nadciśnienie, delikatnie dmuchając przez strzykawkę znacznie powyżej płaszczyzny komórek.Dostosuj położenie końcówki pipety tak, aby znalazła się ona w polu widzenia, a następnie ustaw ostrość na końcówkę, korzystając z pokręteł grubego ustawiania. W tym momencie oceń, czy średnica otworu pipety jest zbyt duża lub zbyt mała. Jeśli średnica otworu jest nieprawidłowa, wymień mikropipetę na inną, aż do znalezienia odpowiedniej średnicy, aby zapobiec pęknięciu pipety w obszarze poboru.Użyj pokrętła ostrości wstępnej, aby przesunąć płaszczyznę ogniskowej, a następnie skieruj końcówkę pipety w stronę komórek za pomocą mikromanipulatorów. Gdy komórki znajdą się bliżej, użyj ostrości precyzyjnej, aż zarówno komórki, jak i końcówka pipety będą ostre. Przestań przykładać dodatnie ciśnienie przed dotarciem do komórek, aby uniknąć ich zdmuchnięcia z lamielki.Używając mikromanipulatorów, ustaw końcówkę pipety tak, aby dotykała ona somy komórki przeznaczonej do pobrania. Za pomocą strzykawki, delikatnie zassać komórkę ustami, aż dostanie się ona do końcówki pipety. Jeśli komórka nie wchodzi do pipety, ostrożnie przesuń końcówkę bliżej komórki i w dół, aż komórka oderwie się od szkiełka nakrywkowego.Użyj mikromanipulatora, aby natychmiast przesunąć pipetę w górę i wyjąć ją z roztworu. Wyjmij pipetę z uchwytu. Trzymając przygotowaną probówkę typu einor o pojemności 1,7 mililitra w jednej ręce, delikatnie odłam końcówkę pipety o ściankę probówki w pobliżu jej dna.Kierując się w stronę oznaczenia 0,1 mililitra, z końcówką złamanej pipety wycentrowaną wewnątrz probówki, wprowadź igłę przymocowaną do strzykawki o pojemności jednego mililitra do górnego otworu pipety. Gwałtownie naciśnij tłok, wymuszając rozpylenie roztworu z pipety do probówki. Należy uważać, aby końcówka nie dotknęła cieczy znajdującej się na ściankach probówki.Ponieważ siły kapilarne przyciągną ciecz z powrotem do pipety, komórka powinna pozostać na samym końcu końcówki, co powinno być wystarczające do prawidłowego wydmuchania komórki. Szybko odwiruj zawartość probówki w mikrowirówce nakładkowej i zamroź na suchym lodzie lub umieść na lodzie w celu dalszego przetwarzania lub do innych zastosowań, takich jak PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji. Przedstawiono tutaj przykład udanego pozyskania izolowanego neuronu.W pierwszej kolejności wybrano obszar o stosunkowo niskiej gęstości komórek. Następnie końcówkę pipety przesunięto w stronę wybranej komórki. Tutaj przedstawiono pole widzenia po pobraniu komórki.Należy zauważyć, że otaczające procesy pozostają na szkiełku podstawowym. Z kolei na tej ilustracji przedstawiono dwa obrazy końcówek pipet, których rozmiar jest niewłaściwy do efektywnego zbierania. Zastosowanie tej końcówki doprowadzi do niepełnego zbioru, natomiast końcówka pokazana tutaj spowoduje zebranie otaczającego środowiska.Po zbiorze i amplifikacji RNA zaleca się przeprowadzenie analizy przy użyciu bioanalizatora w celu zbadania rozkładu i ilości amplifikowanego RNA. Pomyślna amplifikacja z materiału pojedynczej komórki pozwoli uzyskać całkowitą ilość rzędu kilku mikrogramów oraz gładki i szeroki rozkład. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w ciągu kilku minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie technik wolnych od RNaz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Ten artykuł przedstawia metody hodowli miocytów serca o różnych kształtach, które reprezentują różne patologie, oraz sortowania tych przylegających miocytów serca na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczej komórki. Proponowana platforma zapewnia nowatorskie podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań przesiewowych leków w kierunku różnych rodzajów niewydolności serca.

Podejście do badania transkryptomiki zależnej od kształtu na poziomie pojedynczej komórki

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (smFISH) to metoda dokładnego ilościowego określania poziomów i lokalizacji określonych RNA na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy nasze zatwierdzone protokoły laboratoryjne dotyczące przetwarzania na mokrym stole, obrazowania i analizy obrazu w celu ilościowego oznaczania pojedynczych komórek określonych RNA.

Analiza pojedynczych komórek alleli aktywnych transkrypcyjnie za pomocą pojedynczej cząsteczki FISH

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Poznaj metodę izolacji pojedynczych neuronów z pierwotnych kultur szczura do analizy transkryptomu przy użyciu wzmacniania aRNA. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów