Name: Western Blotting przy użyciu Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 45 s
Description: Naucz się western blottingu przy użyciu systemu NuPAGE do analizy ekspresji białek w komórkach transfekcyjnych. Ta metoda zapewnia niezawodne i powtarzalne wyniki w badaniach biokhemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów National Institutes of Health oraz stypendium George E. Hewitt Foundation (A.P.).

Elektroforeza żelowa
Uwaga techniczna: Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować próbki białek.
W tym pierwszym kroku białka w próbce są rozdzielane zgodnie z ich masą cząsteczkową przy użyciu denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Bufor do próbek NuPAGE® LDS zawierający dodecylosiarczan litu (LDS) utrzymuje polipeptydy w stanie zdenaturowanym po podgrzaniu próbki białka w temperaturze 70°C przez 10 minut. Równocześnie stosuje się silny środek redukujący w celu usunięcia struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej (DTT, aby rozerwać mostki dwusiarczkowe). Ponadto białka w próbce zostają pokryte ujemnie naładowanym LDS, przez co przemieszczają się przez siatkę akrylamidu w żelu w kierunku dodatnio naładowanej elektrody. Pozwala to na ich rozdzielenie zgodnie z masą cząsteczkową (mierzoną w kilodaltonach, kDa).
Szczegółowe protokoły krok po kroku dotyczące przygotowania próbek oraz procedury PAGE można znaleźć na stronie internetowej firmy Invitrogen2 lub w przewodniku technicznym NuPAGE3.
Wskazówki techniczne
<ol>
<li>W systemie buforowym do elektroforezy nieciągłej Invitrogen NuPAGE Bis-Tris mobilność elektroforetyczna białek oraz wynikający z niej zakres rozdziału żelu zależą od dwóch czynników: i) stężenia akrylamidu w żelu (wyższe stężenie akrylamidu zapewnia lepszą rozdzielczość białek o niższej masie cząsteczkowej) oraz ii) jonu towarzyszącego w buforze do prowadzenia elektroforezy, MOPS lub MES. Aby dobrać odpowiednią kombinację dla pożądanego zakresu rozdziału, należy skorzystać z tabeli migracji żelu1. Grubość żelu oraz liczba studzienek zależą odpowiednio od objętości i liczby próbek przeznaczonych do nałożenia.</li>
<li>Podczas nakładania próbek do studzienek żelu co najmniej jedna ścieżka jest zarezerwowana dla markera masy cząsteczkowej (drabinki). Standardy białkowe te są dostępne w sprzedaży u kilku producentów i zazwyczaj składają się z mieszaniny barwionych białek o określonych masach cząsteczkowych, które tworzą widoczne prążki umożliwiające monitorowanie postępu migracji. Należy wybrać zakres mas cząsteczkowych dostosowany do rozdzielczości żelu.</li>
<li>W celu uzyskania ładnego i równomiernego wzoru migracji zaleca się wypełnienie WSZYSTKICH studzienek żelu podobną objętością próbki lub 1X buforu do próbek LDS.</li>
</ol>
Przenieś
Uwaga techniczna: Przed rozpoczęciem etapu transferu należy przygotować bufor do transferu (1X z 10% metanolu) i schłodzić go do 4°C w pomieszczeniu chłodniczym.
Aby umożliwić wykrywanie białek za pomocą przeciwciał, są one przenoszone metodą elektroblottingu z żelu na membranę nitrocelulozową. Wiązanie białek opiera się na oddziaływaniach hydrofobowych, a także na oddziaływaniach elektrostatycznych między membraną a białkiem.
(Jako alternatywę można zastosować membranę z polifluorku winylidenu (PVDF). W takim przypadku membranę PVDF należy uprzednio zwilżyć w metanolu przez co najmniej 30 sekund przed użyciem.)
Szczegółowy protokół procedury transferu krok po kroku można znaleźć w odniesieniu 4 w przypadku korzystania z komory do transferu elektroforetycznego Bio-Rad Mini Trans-Blot lub w odniesieniach 2-3, jeśli laboratorium jest wyposażone w moduł do transferu Invitrogen XCell II™ Blot Module.
W wyniku tego procesu białka zostają wyeksponowane na cienkiej warstwie powierzchniowej i są gotowe do detekcji. Jednorodność oraz ogólną skuteczność transferu białka z żelu na membranę można sprawdzić za pomocą odwracalnego barwienia membrany barwnikiem Ponceau S.
Procedura barwienia Ponceau S (opcjonalnie):
<ol>
<li>Po transferze białek umieść membranę w kuwecie do inkubacji (białka skierowane do góry).</li>
<li>Dodaj wystarczającą ilość barwnika Ponceau S, aby pokryć membranę, i inkubuj przez co najmniej 30 sekund przy łagodnym wytrząsaniu.</li>
<li>Płucz membranę wodą destylowaną, aż tło będzie przejrzyste.</li>
<li>Odbarw membranę pod bieżącą wodą destylowaną przez 2-3 minuty.</li>
<li>Umieść membranę w roztworze blokującym (patrz poniżej).</li>
</ol>
Wskazówki techniczne:
<ol>
<li>Zalecamy opisanie membrany ołówkiem przed transferem białek, aby zaznaczyć stronę, na której znajdowały się białka, oraz orientację próbek.</li>
<li>Zarówno barwienie Ponceau S, jak i markery masy cząsteczkowej mogą posłużyć do wycięcia membrany po transferze w celu inkubacji poszczególnych fragmentów z różnymi przeciwciałami.</li>
</ol>
Immunodetekcja:
Uwaga techniczna: Niniejsza procedura immunodetekcji ma charakter wyłącznie wytycznych. Optymalizacja może być wymagana dla każdego przeciwciała; szczegółowe informacje można znaleźć w większości kart charakterystyki przeciwciał dostępnych w sprzedaży (np. rozcieńczenie robocze, czas inkubacji itp.).
Podczas tego ostatniego etapu białko docelowe zostanie wykryte za pomocą specyficznego przeciwciała i pojawi się jako prążek na kliszy. Położenie prążka zależy od masy cząsteczkowej białka docelowego, natomiast intensywność prążka zależy od ilości obecnego białka docelowego.
Zazwyczaj osiąga się to po trzech podetapach:
<ol>
<li>Blokowanie: Aby uniknąć niespecyficznych oddziaływań przeciwciała z membraną (wolna przestrzeń na membranie jest pokrywana rozcieńczonym roztworem białka ogólnego).</li>
<li>Sondowanie: Białko docelowe jest wykrywane za pomocą specyficznego <a title="Przeciwciało pierwszorzędowe" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">przeciwciała pierwszorzędowego</a>. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego, membranę poddaje się działaniu innego przeciwciała sprzężonego z <a title="Enzym" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">enzymem</a> reporterowym, <a title="Peroksydaza chrzanowa" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">peroksydazą chrzanową</a> (HRP). To przeciwciało wtórne jest skierowane przeciwko specyficznej dla gatunku części przeciwciała pierwszorzędowego (np. przeciwciało wtórne anty-królicze zwiąże się z każdym przeciwciałem pierwszorzędowym pochodzącym od królika). </li>
<li>Detekcja: Jako substrat stosuje się czynnik chemiluminescencyjny, który emituje światło w kontakcie z HRP znajdującym się na przeciwciele wtórnym. Reakcja ta powoduje emisję luminescencji w miejscu i w proporcji do ilości sondowanego białka. Światło jest następnie rejestrowane na kliszy fotograficznej.</li>
</ol>
Poniżej przedstawiono ogólną procedurę krok po kroku. Inne szczegółowe procedury można znaleźć w instrukcji obsługi odczynników do detekcji ECL Plus Western Blotting5 lub w większości kart charakterystyki dołączonych do dostępnych komercyjnie przeciwciał. Czas inkubacji, rozcieńczenie przeciwciał oraz roztwory blokujące i płuczące muszą zostać zoptymalizowane empirycznie dla każdego przeciwciała.
Procedura immunodetekcji:
<ol>
<li>Zablokuj niespecyficzne wiązania, inkubując membranę w objętości roztworu blokującego PBS z 1% kazeiną wystarczającej do całkowitego przykrycia całej membrany. Umieść na shakerze na co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.</li>
<li>Inkubuj membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym (specyficznym dla badanego białka). Przeciwciało pierwszorzędowe powinno być rozcieńczone w roztworze blokującym. W przypadku większości przeciwciał pełne wiązanie jest osiągane po 1-2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Alternatywnie, etap inkubacji można przeprowadzić przez noc w 4°C, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.</li>
<li>Usuń roztwór (odrzuć lub przechowuj w temperaturze od 4°C do -20°C do ponownego użycia) i szybko przemyj membranę raz. Następnie przemywaj 3 razy po 10 minut roztworem PBS z 0,05% Tween 20 (PBST) w temperaturze pokojowej przy intensywnym wstrząsaniu.</li>
<li>Inkubuj membranę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP, rozcieńczonym w roztworze blokującym. Wybierz przeciwciało rozpoznające część IgG gatunku, w którym wytworzono przeciwciało pierwszorzędowe. Inkubację przeprowadza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.</li>
<li>Odrzuć roztwór i szybko przemyj membranę raz. Następnie przemywaj 3 razy po 10 minut roztworem PBST w temperaturze pokojowej przy intensywnym wstrząsaniu.</li>
<li>Przejdź do detekcji chemiluminescencyjnej zgodnie z instrukcją producenta. Używamy odczynników do detekcji Western Blotting ECL Plus firmy GE Healthcare (szczegółowe instrukcje znajdują się w referencji 5).</li>
<li>Umieść membranę w folii spożywczej lub woreczku, a następnie włóż do kasety autoradiograficznej. Pamiętaj o odlaniu nadmiaru płynu i usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Naświetl film fotograficzny membraną w ciemni. Zacznij od 1 minuty czasu ekspozycji i dostosuj go do pożądanej intensywności sygnału.</li>
</ol>
Wskazówki techniczne:
<ol>
<li>Blokowanie nieswoistego wiązania osiąga się poprzez umieszczenie membrany w rozcieńczonym roztworze białka. Zazwyczaj stosujemy 1% kazeinę, ale alternatywnie można użyć <a title="Seryjna albumina wołowa" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">albuminy surowicy wołowej</a> (~2% BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku (~5%).</li>
<li>W całej procedurze zamiast PBS można stosować bufor solno-fosforanowy z Trisem (TBS). Zalecamy stosowanie TBS, jeśli planują Państwo analizę membrany z użyciem przeciwciał fosfoswoistych.</li>
<li>Użycie naklejki fluorescencyjnej (np. Stratagene’s Glogos® II Autorad Markers) przyklejonej do dna kasety do autoradiografii pomoże w wyrównaniu filmu i membrany podczas etapu analizy.</li>
</ol>
Analiza
Po naświetleniu filmu zauważysz, że w praktyce nie wszystkie analizy Western blot wykazują białko w formie jednego, wyraźnego prążka. Mogą pojawić się dodatkowe prążki wynikające z niespecyficznego wiązania zarówno przeciwciał pierwszorzędowych, jak i drugorzędowych. Sygnał tła można zredukować poprzez optymalizację procedury immunodetekcji. Ponadto odpowiednia kontrola (np. komórki nietransfekowane, komórki traktowane siRNA itp.) będzie pomocna w określeniu swoistości przeciwciała oraz dokładnej lokalizacji białka docelowego na membranie.
Po zaznaczeniu na folii pozycji zabarwionych prążków standardu białek z membrany, należy wykreślić logarytm masy cząsteczkowej standardów białek (oś y) w funkcji ich odpowiadającej relatywnej mobilności (oś x). Relatywna mobilność (Rf) to termin określający stosunek odległości, o jaką białko przemieściło się od punktu startowego (góra żelu), do odległości przebytej przez barwnik śledzący lub marker o niskiej masie cząsteczkowej (front żelu). Wyznacza się linię regresji krzywej wzorcowej, aby otrzymać wartości nachylenia i punktu przecięcia z osią y. Nieznaną masę cząsteczkową (wielkość) białka docelowego szacuje się, korzystając z jego Rf oraz następującego zmodyfikowanego równania:
log masy cząsteczkowej = (nachylenie)(mobilność lub Rf białka docelowego) + wyraz wolny
(szczegółowe instrukcje znajdują się w referencji 6).
Przybliżone poziomy ekspresji wyznacza się poprzez porównanie intensywności prążka białka docelowego z intensywnością prążka białka strukturalnego (np. tubuliny lub aktyny) lub produktu genu konstytutywnego, takiego jak GAPDH. Tak zwana „kontrola załadunku” nie powinna ulegać zmianom pomiędzy próbkami i jest wykrywana przy użyciu specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego. Obraz może zostać poddany dalszej analizie densytometrycznej w celu oceny względnej ilości zabarwionego białka i kwantyfikacji wyników w formie gęstości optycznej.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Migration+chart%3A+%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gel Migration chart: .</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf">http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , 
		
 <a target="_blank" href="https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E">https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NuPAGE+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">NuPAGE technical guide.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+Manual%2C+Mini+Trans-Blot+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf">http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf">http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis%2C+GE+Healthcare+Website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure">http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure</a> Forthcoming.</li>
<li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li>
<li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li>
<li>Penna,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , Forthcoming.</li>
</ol>

Procedura przedstawiona w niniejszym materiale wykorzystuje żel Bis-Tris z buforem do elektroforezy MES jako przykład denaturującej elektroforezy w żelach poliakrylamidowych (PAGE) z użyciem systemu elektroforetycznego Invitrogen NuPAGE Novex. Ponadto ten system gotowych żeli pozwala na rozdzielanie białek w warunkach denaturujących lub niedenaturujących, a także obsługuje szeroki zakres mas cząsteczkowych (od 1-200 kDa dla żeli Bis-Tris do 36-400 kDa dla żeli Tris-Acetate). W zależności od celu eksperymentu można zdecyd...

western blotting z wykorzystaniem żeli invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western blotting (lub immunoblotting) to standardowa procedura laboratoryjna umożliwiająca badaczom weryfikację ekspresji białka, określenie względnej ilości białka obecnego w różnych próbkach oraz analizę wyników eksperymentów ko-immunoprecypitacji. W tej metodzie białko docelowe jest wykrywane za pomocą specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego. Rozdział białek według masy cząsteczkowej osiąga się przy użyciu denaturującego SDS-PAGE. Po transferze na membranę białko docelowe jest znakowane specyficznym przeciwciałem pierwszorzędowym i wykrywane metodą chemiluminescencji.
Od czasu swojego pierwszego opisu technika western-blotting przeszła szereg ulepszeń, w tym wprowadzenie gotowych żeli oraz intuicyjnego sprzętu. W naszym laboratorium zdecydowaliśmy się na użycie dostępnego komercyjnie systemu elektroforezy NuPAGE firmy Invitrogen. Jest to innowacyjny system gotowych mini-żeli do nieciągłej elektroforezy SDS-PAGE o neutralnym pH. System ten oferuje kilka zalet w stosunku do tradycyjnej metody Laemmli, w tym: i) dłuższą trwałość gotowych żeli, wynoszącą od 8 miesięcy do 1 roku; ii) szeroki zakres rozdzielczości mas cząsteczkowych od 1 do 400 kDa, zależnie od zastosowanego rodzaju żelu; oraz iii) większą wszechstronność (zakres stężenia akryloamidu, rodzaj żelu oraz skład jonowy buforu do elektroforezy).
Procedura opisana w niniejszym artykule wideo wykorzystuje nieciągły system buforowy Bis-Tris z żelami gradientowymi Bis-Tris 4-12% i buforem do elektroforezy MES, stanowiąc ilustrację sposobu przeprowadzania analizy western-blot z użyciem systemu elektroforezy Invitrogen NuPAGE. W naszym laboratorium uzyskaliśmy dobre i powtarzalne wyniki dla różnych zastosowań biochemicznych, stosując tę metodę western-blottingu.

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western blotting (lub immunoblotting) to standardowa procedura laboratoryjna umożliwiająca badaczom weryfikację ekspresji białka, określenie...

Witam, nazywam się OB Pena. Pracuję w laboratorium Michaela Cara w katedrze fizjologii i biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wykonać analizę western blot przy użyciu nowego systemu PAGE firmy Individual Gene.Jest to podstawowa technika analizy ekspresji białka w celu sprawdzenia wyników doświadczeń z wytrącania. Technika western blot obejmuje trzy podstawowe etapy: załadunek i prowadzenie żelu, przeniesienie białka z żelu na membranę nitrocelulozową oraz sondowanie immunologiczne membrany. Dzisiaj wykorzystam tę technikę do analizy ekspresji białka w transfekowanych komórkach.Przygotowuję próbkę w taki sposób, aby próbki białek zawsze znajdowały się w buforze do próbek X. Bufor ten zawiera barwnik, który ułatwia nakładanie próbek, oraz glicerol, który sprawia, że próbka opada na dno dołka. Zawiera on również bufor oraz LDS. Jest to detergent o ładunku ujemnym, który nadaje białkom ładunek ujemny, dzięki czemu mogą one migrować w polu elektrycznym zgodnie z masą cząsteczkową, niezależnie od ich własnego ładunku.Należy również dodać reduktory, takie jak DTT, aby rozbić mostki dwusiarczkowe. Próbki należy podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 70 °C

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Western Blotting za pomocą żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Western blotting to technika analityczna stosowana do wykrywania specyficznych białek w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego.

Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Nasz protokół demonstruje, jak przygotować wiele żeli białkowych jednocześnie poprzez recykling kaset minigel Invitrogen Nupage Novex oraz wykorzystanie niedrogich materiałów zakupionych w sklepie budowlanym. Ta ekonomiczna i usprawniona metoda zawiera sposób przechowywania żeli w temperaturze 4°C przez kilka tygodni. Dzięki ponownemu wykorzystaniu plastikowych kaset do żeli pochodzących z dostępnych komercyjnie zestawów, laboratoria często przeprowadzające elektroforezę białek mogą znacząco...

Przygotowanie i prowadzenie elektroforezy białek w żelu z wykorzystaniem wielokrotnego użycia komercyjnych kaset

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

V3 to procedura western blot z użyciem żeli bez plam. Technologia bezbarwna pozwala naukowcom na wizualizację jakości separacji białek, weryfikację wydajności transferu, a co najważniejsze, walidację zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitej kwantyfikacji białka jako niezawodnej kontroli obciążenia.

V3 Bezbarwny przepływ pracy dla praktycznej, wygodnej i niezawodnej kontroli całkowitego obciążenia białkami w Western blotting

Ten protokół bada najnowsze osiągnięcia w przeprowadzaniu analiz Western blot. Te nowatorskie modyfikacje wykorzystują system żelowy Bis-Tris z 35-minutowym czasem trwania elektroforezy, 7-minutowy system suchego transferu blottingu oraz wykrywanie i obrazowanie białek fluorescencyjnych w podczerwieni, które generują wyższą rozdzielczość, jakość, czułość i lepszą dokładność danych zachodnich.

Najszybszy western w mieście: współczesna wariacja na temat klasycznej analizy Western Blot

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj prezentujemy protokół do analizy składu białkowego dużych natywnych kompleksów białko:białko i białko:kwasy nukleinowe z łyka rzepakowego (B. napus) przy użyciu metody elektroforezy 3D w żelu poliakrylamidowym (PAGE) łączącej niebieski natywny (BN) z dwoma denaturującymi PAGE, a następnie identyfikacją spektrometryczną mas.

Pobieranie próbek soku łyka z Brassica napus do 3D-PAGE kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Naucz się western blottingu przy użyciu systemu NuPAGE do analizy ekspresji białek w komórkach transfekcyjnych. Ta metoda zapewnia niezawodne i powtarzalne wyniki w badaniach biokhemicznych.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Przeglądaj więcej filmów