Name: Izolacja jąder Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Naucz się izolować jądra z samców Drosophila melanogaster w zimnym PBS pod mikroskopem. Ta metoda umożliwia szybką analizę RNA i białek w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Vasia Vagin za wprowadzenie tej techniki do naszego laboratorium.

<ol>
	<li>Przygotuj szklany preparat mikroskopowy z czarnym tłem: Dotnij biały papier 20# do rozmiaru preparatu mikroskopowego. Pokoloruj jedną stronę papieru na czarno za pomocą markera permanentnego (np. Sharpie). Na czarną stronę nałóż biały klej (Elmer's) i przyklej papier do preparatu. Preparat można wykorzystać ponownie. Używając taśmy etykietowej ¾" (Fisherbrand), przymocuj preparat mikroskopowy stroną szklaną do góry do podkładki CO2 do muszek, aby go ustabilizować.</li>
	<li>Zbierz samce muszek w wieku 0-3 dni.</li>
	<li>Przygotuj wiadro z lodem, roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) oraz igły sekcyjne.</li>
	<li>Znieczul 50-100 muszek strumieniem CO2 i przenieś je z butelki lub fiolki na podkładkę do muszek obok preparatu mikroskopowego.</li>
	<li>Nanieś pipetą ~50 μl lodowatego PBS w postaci kropli na środek preparatu mikroskopowego.</li>
	<li>Ostrożnie chwyć samca muszki za pomocą igły sekcyjnej — zanurz igłę w PBS, delikatnie dotknij igłą strony brzusznej muszki (tj. w pobliżu skrzydeł) — umieść ją w kropli PBS.</li>
	<li>Umieść jedną igłę na środku muszki, między klatką piersiową a odwłokiem, mocno naciskając. Drugą igłę umieść między szóstym (A6) a siódmym (A7) segmentem odwłoka (drugim i trzecim prążkiem od dołu); odsuń odwłok od klatki piersiowej.</li>
	<li>Oddziel jądra od pozostałych organów, zwłaszcza od przewodu pokarmowego. Szczególnie u mutantów white jądra i przewód pokarmowy wyglądają podobnie. Kluczowe różnice polegają na tym, że jądra zawsze występują w parach; każde jądro ma spiralny wzór i jest bardziej białe niż przewód pokarmowy.</li>
	<li>Przechowuj jądra w lodowatym PBS w polipropylenowej probówce do mikrocentryfugi.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki: 
<img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Schemat równowagi statycznej; struktura DNA; ilustracja edukacyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Widok grzbietowy męskiego układu rozrodczego,z flybase.org/reports/FBim0000074.html. Atrybucja Flybase: "Na podstawie Rysunku 38 A na stronie 508 z Miller (1950). A. Miller. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. In M. Demerec, editor, Biology of Drosophila, chapter 6, pages 420-534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, facsimile edition, 1994. Copyright 1994 by Cold Spring Harbor Laboratory Press. Użyto za uprzejmą zgodą Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press. Patrz <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a>."

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy protokół izolacji jąder z dorosłych samców Drosophila melanogaster. Ponieważ technika ta wymaga koordynacji obu rąk, biegłość w jej wykonywaniu uzyskuje się jedynie poprzez praktykę.

<table><tbody><tr><td>Igła do sekcji</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka mikroskopowe, czyste</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlenie mikroskopowe</td><td>Narzędzie</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Narzędzie</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Blatowy kompletny system Flowbuddy</td><td>Narzędzie</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżacz bąbelkowy</td><td>Narzędzie</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Igła do napełniania kulistego</td><td>Narzędzie</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Taśma etykietująca &amp;#190;&amp;#8221;</td><td>Materiały</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja jąder drosophila melanogaster

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Jądra Drosophila melanogaster stanowią istotny model do badania utrzymania i różnicowania komórek macierzystych, mejozy oraz interakcji między somą a linią zarodkową. Jądra są zazwyczaj izolowane od dorosłych samców od 0 do 3 dni po wyjściu z poczwarki. Jądra much dzikiego typu można łatwo odróżnić od innych tkanek ze względu na ich żółty kolor, natomiast jądra much mutantów white, będących częstym tłem genetycznym w eksperymentach laboratoryjnych, są podobne kształtem i kolorem do jelit muchy. Przeprowadzenie sekcji na szklanym szkiełku przedmiotowym z czarnym tłem znacznie ułatwia identyfikację jąder. Jądra są usuwane z much za pomocą igieł sekcyjnych. W porównaniu z protokołami wykorzystującymi pęsety do sekcji jąder, nasza metoda jest znacznie szybsza, co pozwala wprawnej osobie na wypreparowanie jąder z 200-300 much dzikiego typu na godzinę, co daje 400-600 jąder. Jądra z much white lub z mutantów o zmniejszonym rozmiarze jąder są trudniejsze do wypreparowania i zazwyczaj pozwalają na uzyskanie 200-400 jąder na godzinę.

Drosophila melanogaster jądra można szybko i efektywnie wyizolować z dorosłych samców za pomocą igieł sekcyjnych. Dzięki praktyce w ciągu jednego lub dwóch dni można bez trudności wyizolować ilość jąder wystarczającą do analizy DNA lub RNA za pomocą sekwencjonowania wysokoprzepustowego lub bardziej tradycyjnych metod biologii molekularnej, a także białek do testów opartych na przeciwciałach lub enzymach.

Izolacja jąder Drosophila melanogaster

Jądra Drosophila melanogaster stanowią istotny model do badania utrzymania i różnicowania komórek macierzystych, mejozy oraz interakcji między somą a linią zarodkową ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie jąder z samców Drosophila melanogaster w wieku od zero do trzech dni. Osiąga się to poprzez znieczulenie much i wypreparowanie ich jąder w kropli zimnego PBS pod mikroskopem. Używając dwóch igieł sekcyjnych, należy odsunąć odwłok muchy od klatki piersiowej.Na koniec oddziel jądra od reszty tkanki i zbierz je do zastosowania w różnych technikach analitycznych, takich jak immunofluorescencja, barwienie lub izolacja całkowitego RNA i białek. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ identyfikacja wypreparowanych jąder może być trudna do opanowania, gdyż ciężko je odróżnić od jelit. Procedurę zaprezentuje shemei ma, technik z mojego laboratorium.W pierwszej kolejności przygotuj wiaderko z lodem, igły sekcyjne oraz około 100 mililitrów soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Umieść PBS w wiaderku z lodem w celu schłodzenia. Przygotuj szkiełko przedmiotowe z czarnym tłem, wycinając biały papier o gramaturze 20 funtów tak, aby pasował do szkiełka.Następnie pokoloruj jedną stronę na czarno. Za pomocą permanentnego markera przyklej papier do szkiełka i przymocuj szkiełko do podkładki CO2. Pod mikroskopem stereoskopowym znieczul strumieniem CO2 butelkę z muchami w wieku od 0 do 3 dni i wysyp je na podkładkę.W pobliżu przytwierdzonego szkiełka przedmiotowego zidentyfikuj samce much po charakterystycznych, ciemnych kolcach kopulacyjnych i odseparuj od 50 do 100 osobników. Nanieś pipetą około 50 µl lodowatego PBS na środek szkiełka przedmiotowego, tworząc kroplę. Chwyć samca muchy, zanurzając igłę sekcyjną w kropli PBS i delikatnie dotykając brzusznej strony owada, aby przywarł do igły.Umieścić muchę w kropli PBS i mocno docisnąć jedną igłę między klatką piersiową a odwłokiem muchy. Drugą igłę docisnąć między szóstym a siódmym segmentem odwłoka, a następnie odciągnąć odwłok od klatki piersiowej. Oddzielić jądra od pozostałych narządów, w szczególności od jelita, które może wyglądać podobnie, aby pomóc w odróżnieniu jąder od jelit.Należy pamiętać, że jądra zawsze występują w parach, mają charakterystyczny spiralny kształt i są bielsze niż tkanka jelitowa. Jądra należy zebrać do probówki do mikrocentryfugi zawierającej lodowaty PBS i przechowywać na lodzie, gdzie mogą pozostawać przez kilka godzin. Po nabraniu wprawy, jedna mucha może zostać wypreparowana w mniej niż jedną minutę zgodnie z tą procedurą.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jak zmienia się zestaw RNA u konkretnej mutanty muszki, można zastosować inne metody, takie jak głębokie sekwencjonowanie krótkich RNA wyciszających lub mikroRNA.

isolation-of-drosophila-melanogaster-testes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja Drosophila melanogaster jąder

Ten film opisuje sekcję gruczołów dodatkowych od samców much i pokazuje przykład, w którym izolowany gruczoł zostanie zdysocjowany na zawiesinę pojedynczej komórki.

Drosophila Rozwarstwienie męskiego gruczołu dodatkowego: metoda izolowania komórek wtórnych

Ten film opisuje ogólną anatomię jajnika Drosophila i przedstawia metodę preparowania jajników do obrazowania na żywo lub stałego.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Rozwarstwienie jajników: technika przygotowania tkanek ex vivo

Ten film opisuje gruczoł pierścieniowy Drosophila, złożoną strukturę endokrynną ważną dla biosyntezy i wydzielania ekdysteroidów i innych hormonów. Przedstawiony protokół demonstruje jego rozwarstwienie, utrwalenie i barwienie immunologiczne.

Rozwarstwienie gruczołu pierścieniowego larw: izolacja rozwojowych narządów endokrynnych od Drosophila

Specyficzna dla danego etapu izolacja mieszków włosowych Drosophila jest przydatna do różnych celów. Takie pęcherzyki rozwijają się w hodowli, co pozwala na połączenie manipulacji genetycznych i/lub farmakologicznych z testami rozwoju in vitro i obrazowaniem na żywo. Dodatkowo pęcherzyki mogą być wykorzystywane do badań molekularnych, takich jak izolowanie mRNA i białka.

Użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę nienaruszonych jąder i torbieli linii zarodkowej poczwarek Drosophila melanogaster. Metoda ta pozwala na mikroskopową obserwację spermatogenezy ex vivo. Ponadto opisano test farmakologiczny wpływu inhibitorów na określone etapy rozwoju komórek rozrodczych w jądrach poczwarki.

Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji i sortowania określonej populacji komórek z męskich gruczołów dodatkowych (komórek wtórnych) Drosophila do sekwencjonowania RNA i RT-qPCR. Izolacja komórek odbywa się poprzez oczyszczanie FACS komórek wtórnych eksprymujących GFP po wieloetapowym procesie dysocjacji wymagającym sekcji, trawienia proteaz i dyspersji mechanicznej.

Oparty na FACS protokół izolacji RNA z komórek wtórnych męskich gruczołów dodatkowych Drosophila

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ z uwzględnieniem polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkryptów rybosomalnego RNA pochodzących z locus rybosomalnego DNA chromosomu X lub Y u Drosophila melanogaster.

Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Naucz się izolować jądra z samców Drosophila melanogaster w zimnym PBS pod mikroskopem. Ta metoda umożliwia szybką analizę RNA i białek w badaniach genetycznych.

Izolacja jąder Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów