Name: Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia NET przez neutrofile w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Odkryj dynamikę neutrofilów w zakażonych płucach za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Ta metoda umożliwia obserwację fagocytozy i tworzenia NET w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować dr. Larsowi Philipsenowi za pomoc w optymalizacji filmów intravitalnych, dr. Jonathanowi Lindquistowi za uważne przeczytanie rękopisu oraz wszystkim członkom laboratorium Gunzera za pomocne dyskusje i uwagi podczas opracowywania metody. Praca ta była finansowana z grantów Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) przyznanych M.G.

1. Zakażanie
<ol>
	<li>Opuchnięte konidia pleśni Aspergillus fumigatus (szczep ATCC 4645) są otrzymywane poprzez preinkubację w pożywce RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Niemcy) 
	z dodatkiem 5% FCS (v/v). 2x107 spoczywające konidia resuspenduje się w 5 ml pożywki i inkubuje w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek (TPP AG; Trasadingen, Szwajcaria, nr katalogowy 9206) przez 7 h w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Po okresie pęcznienia zarodniki są znakowane fluorescencyjnie poprzez dodanie 10 μl roztworu stokowego calcofluor white (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Niemcy, katalog nr F3543; [25 mg/ml] w DMSO) do każdego Aspergillus zawierająca studnię w płytce 6-studzienkowej, osiągając końcowe stężenie calcofluoru wynoszące 50 μg/ml RPMI.
Po delikatnym zmieszaniu zarodniki inkubuje się przez dodatkowe 15 min w 37 °C. </li>
	<li>W następnym kroku zarodniki są zbierane poprzez filtrację przez 70 μm sitko do komórek (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy). Po jednorazowym przemyciu 10 ml PBS (centryfugowanie przy 90xg przez 5 min w temperaturze pokojowej) osad resuspensuje się w 2 ml PBS, a całkowitą liczbę napęczniałych konidiów określa poprzez liczenie przy użyciu komory Neubauera. Na koniec zawiesinę zarodników wiruje się przy 90xg przez 5 min w temperaturze pokojowej, ostrożnie usuwa nadpłyn, a osad resuspensuje do końcowego stężenia 1x107 zarodników na 100 μl PBS.</li>
	<li>W przypadku infekcji, 100 μl roztworu zarodników podaje się wewnątrztachealnie samicom myszy (C57/BL6, w wieku 8–10 tygodni, Harlan, Niemcy). Jeśli planowana jest również obserwacja neutrofili, należy zastosować myszy Lys-EGFP, u których białko EGFP znajduje się pod promotorem lizozymu1 zaleca się. Należy rozpocząć od znieczulenia zwierzęcia pojedynczym wstrzyknięciem doprzewłonowym (i.p.) 150 μl Roztwór ketaminy/Rompunu (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Niemcy (ketamina) i Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy (Rompun), 1 ml ketaminy [50 mg/ml] + 0,5 ml Rompunu [2%] + 3,5 ml sterylnego NaCl [0,9%]). Po 5 minutach znieczuloną mysz można przymocować za pomocą elastycznej opaski za zęby do rampy (tj. powierzchni pochyłej), aby ułatwić intubację (rysunek dodatkowy 1). Za pomocą pęsety odsuwa się język na bok, a następnie, przy stałym oświetleniu lampą typu „gęsia szyja”, można delikatnie wprowadzić do tchawicy kaniulę do dostępów żylnych 2G (B. Braun AG, Melsungen, Niemcy, Vasofix Braunüle). Prawidłowe wprowadzenie kaniuli potwierdza się, obserwując regularne ruchy klatki piersiowej zwierzęcia zgodnie z częstotliwością pracy respiratora mechanicznego. Po potwierdzeniu pomyślnej intubacji, 100 μl zawiesinę zarodników nanosi się za pomocą 100 μl mikropipetą. Objętość ta powinna zostać wchłonięta przez zwierzę bez dodatkowej pomocy w ciągu 1–2 s. Zwiększoną dystrybucję cząstek grzybów w płucach osiąga się poprzez mechaniczną wentylację zakażonego zwierzęcia przez 2 minuty przy użyciu respiratora dla małych zwierząt (MiniVent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Niemcy) z częstotliwością 250 oddechów na minutę i objętością wdechową wynoszącą 300 μl na każdy oddech (rycina dodatkowa 2). Po zakażeniu zwierzęta są umieszczane z powrotem w klatkach i obserwowane co 5 minut, aż do odzyskania zdolności poruszania się. Myszy nie wykazują żadnych oznak bólu ani stresu podczas następującego po tym okresu inkubacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płuc
<ol>
	<li>7 h po zakażeniu zarodnikami zwierzę zostaje uśpione poprzez przedawkowanie izofluranu (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Niemcy) aż do momentu ustania ruchów i oddechu na ponad 30 sekund. Następnie przeprowadza się torakotomię jako wtórną metodę potwierdzenia śmierci klinicznej oraz umożliwienia wizualizacji i dostępu do tchawicy i płuc. Następnie klatka piersiowa jest ostrożnie otwarta, aby odsłonić płuco i górne drogi oddechowe. Wówczas do tchawicy, zaczynając od odsłoniętej nagłośki, wprowadza się kolejny kaniulowany cewnik żylny 2G. Poprzez tę rurkę płuca są wypełniane 1 ml uprzednio ogrzanej agarozy niskotopliwej (2 % w/v, Promega, Mannheim, Niemcy) przy użyciu strzykawki 1 ml Omnifix (B.Braun). Gdy tylko płuca zostaną wypełnione, tchawica zostaje podwiązana krótkim kawałkiem nici chirurgicznej, a całe zwierzę zostaje umieszczone w lodówce w temperaturze 4 °C. </li>
	<li>15 min później, po zestaleniu się agarozy, cały płuc zostaje wycięty, zaczynając od tchawicy. Za pomocą ostrych nożyczek z czubkiem usuwany jest następnie prawy płat płuca; jego dolną powierzchnię krótko osuszono na arkuszu ręcznika papierowego, a następnie cały płat przyklejono do bloku preparacyjnego wibrotomu (Campden Instruments, UK, 752M Vibroslice) za pomocą kropli kleju tkankowego do fiksacji (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy, Roti-Coll 1). Po 1 min blok zostaje zainstalowany w komorze tnącej wibrotomu, która jest wypełniona schłodzonym (4°C) PBS. Wibrotom ustawiono na średnie wibracje (5 z max. 10) oraz umiarkowaną prędkość (5 z max. 10), tak aby uzyskać poziomy przekrój poprzeczny płuca. Górna połowa organu zostaje następnie przeniesiona do małej plastikowej płytki Petriego (5 cm średnicy), gdzie zostaje odwrócona i zamocowana za pomocą wykonanej samodzielnie płaskiej podkładki (1 cm średnicy wewnętrznej) przykrytej zestawem równoległych nici nylonowych, rozmieszczonych co 1 mm (rysunek dodatkowy 3). Na koniec płytkę Petriego wypełnia się 10 ml PBS z dodatkiem 10 μl barwnika DNA Sytox Orange [5 mM] (Invitrogen, Niemcy), co daje końcowe stężenie barwnika 5 μM.</li>
</ol>
3. Mikroskopia laserowa dwufotonowa
<ol>
	<li>Szalkę Petri z próbką płuca umieszcza się następnie pod obiektywem mikroskopu, aby bufor mógł zostać podgrzany do 37°C za pomocą grzejnika sterowanego czujnikiem temperatury (rycina dodatkowa 4). Następnie przeprowadza się mikroskopię dwufotonową całej powierzchni cięcia przy użyciu mikroskopu Zeiss LSM 710 NLO na stojaku Axio Examiner wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy 20xNA1.0 (Zeiss, Jena, Niemcy). W celu obrazowania skanuje się różne obszary wzdłuż przekroju do głębokości 40 μm przy długości fali oświetlenia 80 nm, wykrywając fluorescencję zieloną (530 nm) i czerwoną (580 nm), a także sygnał generacji drugiej harmonicznej (SHG) i niebieską fluorescencję calcofluoru (emisja 40–470 nm) za pomocą zewnętrznych detektorów niedeskanowanych (NDD). Poza obrazami 2D i filmami time-lapse (1 obraz co 5-10 sekund), pojedyncze lub powtarzalne stosy obrazów trójwymiarowych mogą być następnie renderowane jako rendery wokselowe, obrazy z rozszerzoną głębokością ostrości lub dane 4D (3D w czasie) przy użyciu różnych pakietów oprogramowania. Taki układ mikroskopowy pozwala na obserwację zachowania komórek w niemal nienaruszonym środowisku, które, stanowiąc port wejściowy dla wielu patogenów przenoszonych drogą powietrzną, ma ogromne znaczenie immunologiczne. W tych warunkach in situ można łatwo badać mobilność komórek, fagocytozę oraz produkcję NET przez endogenne neutrofile po zakażeniu pleśnią Aspergillus fumigatus.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu obrazowanie pozwoli na wygenerowanie slajdów lub filmów dwu- lub trójkolorowych. Chociaż kolorowanie odbywa się w procedurze postprocesowania i jest zatem w pełni modyfikowalne, zazwyczaj wybieramy schemat kolorów odzwierciedlający naturalny kolor barwnika/sygnału wykrywanego w odpowiednim kanale. W ten sposób barwniki Sytox przedstawiono w kolorze czerwonym, grzyba oraz sygnał SHG w kolorze niebieskim, a w przypadku ich obecności, komórki znakowane EGFP w kolorze zielonym. W pierwszym przykładzie (Rys. 1) niebieski sygnał SHG obrazuje włókna tkankowe nieinfected płuca, a czerwony sygnał Sytox jest generowany przez jądra komórek rezydentnych płuc przeciętych wibrotomem. W drugim przykładzie (Rys. 2) przedstawiono zainfekowane płuco, w którym zarówno struktury pęcherzykowe, jak i masy grzybicze pojawiają się w kolorze niebieskim, natomiast jądra komórkowe i NETy są zabarwione na czerwono. Trzeci przykład (Rys. 3) pochodzi od zwierzęcia transgenicznego Lys-EGFP, gdzie oprócz struktur niebieskich i czerwonych widoczne są również zielone neutrofile. Migracja neutrofili oraz ich fagocytoza poszczególnych elementów grzyba w sekwencjach poklatkowych została przedstawiona w filmie uzupełniającym.
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej: SHG, barwienie Sytox; struktura komórkowa; preparat niezinfekowany." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wygląd niezinfekowanego skrawka płuca w dwukolorowej mikroskopii dwufotonowej. Przygotowano przekrój płuca z niezinfekowanej myszy C57/BL6, a następnie wykonano obrazowanie zgodnie z opisanym protokołem. Przedstawiono tutaj sygnał SHG struktury tkanki pęcherzykowej (A), sygnał Sytox jąder komórkowych uszkodzonych podczas przygotowania przekroju płuca (B) oraz nałożenie obu kanałów (C). Obszar zaznaczony ramką w (C) pokazano w powiększeniu w (D). Należy zwrócić uwagę na tkankę włóknistą w dolnej części przekroju płuca w porównaniu z wyraźną organizacją pęcherzykową w obszarach płuca aktywnych oddechowo znajdujących się powyżej.
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="obrazowanie SHG/grzybów, barwienie Sytox, nałożenie obrazów; mikroskopia, badanie zainfekowanej tkanki zwierzęcej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wygląd skrawka płuca z Aspergillus zainfekowane zwierzę typu dzikiego w dwukolorowej mikroskopii dwufotonowej. przekrój płuca myszy C57/BL6 zainfekowanej 7 h wcześniej za pomocą A. fumigatus przygotowano i zobrazowano zgodnie z opisem w protokole. Przedstawiono połączoną strukturę grzybni i sygnał SHG tkanki pęcherzyków płucnych (A), sygnał Sytox dla NET-ów DNA oraz jąder komórkowych odsłoniętych podczas przygotowywania skrawka płuca (B) oraz nałożenie obu kanałów (C). Obszar zaznaczony ramką w (C) pokazano w powiększeniu w (D). Należy zwrócić uwagę, że wyraźnie odróżnialne obszary mas grzybni, pęcherzyków płucnych i struktur NET są oznaczone odpowiednio literami F, A i N.
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii generacji drugiej harmonicznej przedstawiający grzyba, barwienie Sytox oraz interakcję z neutrofilami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Wygląd przekroju płuca zwierzęcia Lys-EGFP zainfekowanego Aspergillus w trójkolorowej mikroskopii dwufotonowej. Przekrój płuca myszy Lys-EGFP zakażonej 7 h wcześniej A. fumigatus przygotowano i obrazowano zgodnie z opisem w protokole. Przedstawiono połączony obraz struktury grzyba i SHG tkanki pęcherzyków płucnych (kolor niebieski), sygnał Sytox jąder komórkowych i NET (kolor czerwony) oraz liczne neutrofile (kolor zielony).
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="siła chwytu gryzoni, pomiar siły, układ eksperymentalny, badania laboratoryjne, wytrzymałość fizyczna" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina dodatkowa 1. Unieruchomienie myszy do intubacji. W znieczuleniu ketaminą i Rompunem zwierzę zostaje unieruchomione za pomocą elastycznej opaski przy zębach, aby ułatwić intubację za pomocą cewnika dożylnego 2G.
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Konfiguracja eksperymentu na zwierzętach z wyposażeniem anestezjologicznym do badania behawioralnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina uzupełniająca 2. Wentylacja mechaniczna myszy. Intubowaną mysz zakażono poprzez aplikację i.t. 1x107 zarodniki resuspendowane w 
100 μl PBS. Lepszą dystrybucję cząsteczek grzybów wewnątrz płuca uzyskuje się poprzez mechaniczną wentylację zakażonej myszy przy użyciu respiratora dla małych zwierząt.
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Metalowa próbka testowa do analizy statycznej w badaniu wytrzymałości materiałów, wykazująca jednorodne linie odkształcenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina dodatkowa 3. Fixacja płatów płuca. Po przygotowaniu prawego płata płuca organ unieruchamia się w szalce Petriego za pomocą wykonanej w laboratorium płaskiej podkładki, która jest pokryta zestawem równoległych nici nylonowych.
<img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Układ mikroskopii optycznej; analiza szalek Petriego; sprzęt spektroskopowy; obserwacja naukowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina dodatkowa 4. Układ obrazowania dwufotonowego. Szalka Petri zawierająca prawy płat płuca zostaje umieszczona na macie grzejnej pod mikroskopem dwufotonowym po dodaniu barwnika DNA Sytox Orange.
Film uzupełniający: Neutrofile migrujące i fagocytujące elementy grzyba w płucach zainfekowanych Aspergillus, obserwowane za pomocą dwufotonowej mikroskopii poklatkowej żywego skrawka płuca 7 h po infekcji grzybiczej. Neutrofile są koloru zielonego, elementy grzyba oraz SHG są niebieskie, a jądra komórkowe oraz struktury NET są przedstawione w kolorze czerwonym. Rzeczywisty czas trwania eksperymentu jest wyświetlany w prawym dolnym rogu. Pasek skali odpowiada 50 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2659/5_9_1%20-%20supplemental.mpg">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>

<ol><li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%28%2B%29+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li>
<li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8%28%2B%29+T+cell+responses+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li>
<li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li>
<li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li>
<li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li>
<li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li>
<li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li>
<li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li>
<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li>
<li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li>
<li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li>
<li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Dwufotonowa mikroskopia obrazowania w czasie rzeczywistym in vivo lub w nienaruszonych organach zyskała ogromne znaczenie w badaniach nad fizjologią komórek odpornościowych w ciągu ostatnich 10 lat. To właśnie dzięki tej technice po raz pierwszy widoczne stały się kluczowe zdarzenia, takie jak dynamika aktywacji limfocytów T w węzłach chłonnych2-4. W ostatnim czasie badacze zaczęli również wykorzystywać to podejście do analizy specyficznych funkcji komórkowych, takich jak pierwsze etapy powstawania komórek efektorowych w tkankach limfatycznych5.
Jednakże, mimo że dzięki tej metodzie odkryto szereg nowych koncepcji biologicznych, wciąż istnieją trudne i istotne pytania, dla których do tej pory nie opublikowano żadnych badań z obrazowania intravitalnego. Dotyczy to w szczególności płuc ssaków. Interesujący aspekt tego organu, będącego bramą wlotową dla wielu patogenów przenoszonych drogą powietrzną, czyni go jedną z najważniejszych powierzchni, na których w organizmie ssaków zachodzą procesy immunologiczne. Z każdym oddechem przez całe życie wdychane są niepożądane cząstki, z których niektóre mają potencjał wywoływania infekcji zagrażających życiu6. Jest oczywiste, że w tak wrażliwym i narażonym miejscu musi istnieć gęsta sieć mechanizmów obronnych wykazujących cały repertuar odpowiedzi immunologicznych. Z drugiej strony bardzo ważne jest, aby indukowana walka immunologiczna przeciwko potencjalnym patogenom w tak „zanieczyszczonym” miejscu była ściśle kontrolowana. Przesadne reakcje układu odpornościowego niosą ze sobą wysokie ryzyko uszkodzenia własnego organizmu poprzez masywne uszkodzenie tkanki narządu w wyniku stymulacji nieswoistych działań komórek odpornościowych7,8.
W świetle tych rozważań niezwykle interesująca i pomocna byłaby możliwość zbadania zachowania komórek w płucach ssaków w rzeczywistych warunkach in vivo. Jednak fakt, że taki system nie został dotąd pomyślnie wdrożony, wyraźnie wskazuje na ogromne trudności, które należy rozwiązać przy opracowywaniu działającego protokołu. Największym wyzwaniem jest prawdopodobnie stabilność ogniska. Płuco, jako organ odpowiedzialny za oddychanie, znajduje się w nieustannym ruchu we wszystkich trzech kierunkach przestrzeni w celu realizacji wdechu. Ta okoliczność sama w sobie powoduje poważne problemy z obrazowaniem i może być uznana za „koszmar” osób zajmujących się obrazowaniem intravitalnym. Już niewielki ruch w dowolnym wymiarze przestrzeni ma ogromny, pogarszający wpływ na obraz mikroskopowy, który musi być stabilny z dokładnością do mikrometra, aby można było wygenerować sensowne obrazy9. Ze względu na immanentnie wąską płaszczyznę ogniskowania10, mikroskopia dwufotonowa jest jeszcze bardziej wrażliwa na niestabilność ogniska, ponieważ przesunięcie danej struktury o zaledwie kilka mikrometrów w kierunku Z jest równoznaczne z całkowitą utratą ostrości, a tym samym z niepowodzeniem eksperymentu.
Protokół przedstawiony w niniejszym badaniu do obserwacji komórek odpornościowych w płucach myszy nie jest jeszcze zastosowaniem in vivo, lecz stanowi bliską aproksymację sytuacji w funkcjonalnie nienaruszonym płucu11. Wykazano, że podejścia ex vivo do obrazowania limfocytów, np. w wypreparowanych węzłach chłonnych, dają wyniki równoważne z rzeczywistymi obserwacjami in vivo12, a zatem są one wysoce istotne5. Obserwacje in situ w skrawkach płuca, które są możliwe wyłącznie dzięki naszemu podejściu, odbywają się w zakażonym płucu krótko po wycięciu. Integralność 3D podczas procesu cięcia jest zapewniona przez matrycę agarozową, co jest niezbędnym etapem umożliwiającym precyzyjnie kontrolowany proces cięcia płuca. Chociaż konieczne jest krótkotrwałe schłodzenie wypreparowanego płuca, aby umożliwić zestalenie matrycy agarozowej, po przecięciu i ponownym ogrzaniu tkanki możliwe jest powrót do warunków bliskich fizjologicznym dla komórek. Wyraźnie pokazują to nasze dane, które dowodzą, że w tych warunkach neutrofile są bardzo aktywne i wykazują pełny potencjał jako zwinne fagocyty, które są niezbędne do skutecznego usunięcia infekcji Aspergillus fumigatus. Patrolują one tkankę płucną, przenikając przez bariery nabłonkowe, aby dotrzeć do wewnętrznych części pęcherzyków płucnych, a ponadto aktywnie pochłaniają zarodniki grzybów 11. Kluczowym odkryciem w tej pracy było pojawienie się struktur przypominających zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) w organie zakażonym Aspergillus. NETs są niedawnym odkryciem nowego mechanizmu obronnego neutrofili13. Jednak od czasu ich pierwszego opisu w 2004 roku, liczba warunków fizjologicznych lub patologicznych w modelach zwierzęcych lub u ludzi, w których zjawisko to zaobserwowano lub stwierdzono jego brak, gwałtownie rośnie14-16. Co ciekawe, mimo że tak wiele pracy nad tymi strukturami zostało wykonanych przez tak wiele różnych grup, większość doniesień wciąż znajduje się na poziomie bardzo opisowym i niewiele wiadomo o mechanizmie uwalniania NET oraz jego regulacji. Dzięki naszemu protokołowi po raz pierwszy udało nam się ukazać włókna NET w zakażonym płucu. Ponadto mogliśmy wykazać znaczenie świeżo zrekrutowanych neutrofili, a także cząsteczkowych struktur grzyba dla ich powstawania lub hamowania11. Wyraźnie pokazuje to potencjał naszej metody do bardziej szczegółowego badania poszczególnych etapów formowania NET. Można by na przykład rozważyć wykorzystanie neutrofili z odpowiednich myszy knock-out, aby zaobserwować ich zdolność do formowania NET w eksperymentach z transferem adopcyjnym.
Zatem, mimo że bezpośrednia obserwacja imigracji neutrofili z krwi obwodowej nie jest możliwa w tym systemie ze względu na brak ukrwienia po eksplantacji narządu, uważamy, że nasz protokół stanowi wartościowe i stosunkowo łatwe w obsłudze podejście, które umożliwia obrazowanie wczesnych lub późnych etapów odpowiedzi immunologicznej przeciwko infekcjom płuc. Jest to zatem istotny krok w kierunku badania tego zjawiska w oddychającym płucu żywych zwierząt.

bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (net) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Po przewodzie pokarmowym, płuca stanowią drugą pod względem powierzchni barierę oddzielającą organizm kręgowca od środowiska zewnętrznego. Musi w nich zachodzić efektywna wymiana gazowa, przy jednoczesnym unikaniu infekcji wywołanych przez liczne patogeny wdychane podczas normalnego oddychania. W celu osiągnięcia tego celu istnieje doskonały zestaw strategii obronnych łączących mechanizmy odporności humoralnej i komórkowej. Jedną z najskuteczniejszych metod ostrej obrony płuc jest rekrutacja neutrofili, które fagocytują wdychane patogeny lub zabijają je poprzez uwalnianie chemikaliów cytotoksycznych. Niedawnym uzupełnieniem arsenału neutrofili jest ich gwałtowne uwalnianie zewnątrzkomórkowego DNA – tzw. NETs, za pomocą których bakterie lub grzyby mogą zostać pochwycone lub unieczynnione, nawet po śmierci komórek uwalniających NETy. Przedstawiamy tutaj metodę pozwalającą na bezpośrednią obserwację neutrofili migrujących w niedawno zainfekowanych płucach, fagocytujących patogeny grzybicze, a także wizualizację rozległych NET-ów wytworzonych w zainfekowanej tkance. Metoda opisuje przygotowanie grubych, żywych skrawków płuc 7 godzin po infekcji wewnątrzoskrzelnej myszy konidiami pleśni Aspergillus fumigatus oraz ich badanie za pomocą wielokolorowej dwufotonowej mikroskopii time-lapse. Podejście to pozwala na bezpośrednie badanie obrony przeciwgrzybiczej w natywnej tkance płucnej, otwierając tym samym nową drogę do szczegółowego badania odporności płuc.

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Po przewodzie pokarmowym płuca stanowią drugą pod względem wielkości powierzchnię interakcji między organizmem kręgowca a środowiskiem. Tutaj...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja żywych granulocytów neutrofilowych oraz zewnątrzkomórkowych sieci DNA w płucu, które zostało niedawno zainfekowane patogenem grzybiczym. W pierwszej kolejności myszy wykazujące ekspresję EGFP w populacji neutrofili są zarażane Candida, które również są znakowane fluorescencyjnie. Następnie pozwala się na rozwój infekcji przez siedem godzin, po czym zwierzę zakażone zostaje uśmiercone.Następnie płuca zainfekowanego zwierzęcia wypełnia się niskotopiącym agarosem, aby ułatwić krojenie za pomocą beome. Na koniec, za pomocą viome, pobiera się gruby plaster zainfekowanej tkanki płucnej i neutrofili płucnych. Wykonuje się obrazowanie sieci DNA oraz elementów grzybiczych.W rezultacie, za pomocą wielokolorowej mikroskopii dwufotonowej można uzyskać wysokorozdzielcze obrazy statyczne lub sekwencje filmowe granulocytów w żywej tkance płucnej. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technologiami jest możliwość bezpośredniej obserwacji komórek odpornościowych odpowiedzialnych za eliminację infekcji w ich naturalnym środowisku. Może to być realizowane podczas procesu tworzenia sieci oraz zabijania grzybów, co pozwala na analizę fizjologii neutrofili przy znacznie mniejszej ilości artefaktów.Opracowałem tę technikę, gdy Mathias dręczył mnie swoimi natrętnymi pytaniami dotyczącymi istotności in vivo moich wcześniejszych wyników in vitro i zaprezentuję ją w ciągu najbliższych kilku minut. Aby uzyskać napęczniałe kedia środowiskowej pleśni Aspergilus fumigatus, należy dodać 5 mL pożywki do 6-dołkowej płytki hodowlanej, następnie przenieść 2 × 10⁷ spoczynkowych CEDIA na płytkę i inkubować zarodniki przez 7 h w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w laboratorium klasy BSL-2.Po okresie pęcznienia należy oznakować zarodniki fluorescencyjnie, dodając 10 µL roztworu calcior white stalk do każdej studzienki po delikatnym wymieszaniu. Inkubuj płytkę przez kolejne 15 minut w tych samych warunkach. Aby zebrać oznakowane fluorescencyjnie zarodniki, umieść sitko komórkowe o oczkach 70 µm na wierzchu probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Zbierz zarodniki z płytki za pomocą pipety, a następnie przefiltruj roztwór pożywki przez sitko komórkowe do probówki.Następnie odwirować komórki przy 900 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej i usunąć medium. Potem przemyć zarodniki 10 mililitrami PBS w tych samych warunkach wirowania. Zawiesić osad z zarodników w dwóch mililitrach PBS i określić całkowitą liczbę napęczniałych kanadiów za pomocą licznika komórek; ponownie odwirować zawiesinę zarodników w tych samych warunkach co wcześniej, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz.Resuspend osad kedia do stężenia końcowego 1×10⁷ komórek na 100 µL PBS. Aby przygotować mysz do zakażenia roztworem przetrwalników, zwierzę zostaje poddane znieczuleniu, a sedację potwierdza się brakiem reakcji na uciśnięcie palca u nogi. W niniejszym filmie wykorzystano myszy lys EGFP, które posiadają EGFP pod promotorem lizozymu, a co za tym idzie, mają neutrofile wykazujące ekspresję EGFP. Pięć minut po podaniu znieczulenia i potwierdzeniu sedacji, z narkotyzowaną myszą zawiesza się za zęby na uchwycie za pomocą gumki recepturki pod lampą z gęsim szyją. Za pomocą pęsety odciąga się język na bok i wprowadza do tchawicy zwierzęcia kaniulę dożylną o rozmiarze 22G.Po pomyślnym wprowadzeniu rurki, za pomocą mikropipety 100 µL podaj 100 µL zawiesiny zarodników. Następnie, aby poprawić rozprzestrzenienie cząstek grzyba w płucach, wentyluj mechanicznie zainfekowane zwierzę przez dwie minuty za pomocą respiratora dla małych zwierząt, przy częstotliwości oddechów 250 breaths per minute i objętości wdechowej 300 µL na oddech. Na koniec usuń cewnik i umieść mysz z powrotem w klatce na siedem godzin, aby infekcja mogła postępować.Obserwuj wybudzanie się zwierzęcia co pięć minut, aż odzyska zdolność poruszania się, tuż przed zakończeniem okresu infekcji. Rozpuść 20 mililitrów agarozy niskotopliwej w kuchence mikrofalowej i utrzymuj ją w cieple, aby nie zastygła przed wstrzyknięciem. W tym samym czasie schłodź butelkę PBS do czterech stopni Celsius w lodówce.Pod koniec okresu infekcji zwierzę zostaje poddane eutanazji. Za pomocą igieł przymocuj mysz do silikonowej maty preparacyjnej, a następnie ostrożnie otwórz klatkę piersiową, używając nożyczek i pęsety, aby odsłonić płuca i górne drogi oddechowe. Rozpoczynając od odsłoniętej nagłośnika, wprowadź do tchawicy kolejny cewnik żylny do stałego dostępu o rozmiarze 22 G.Za pomocą igły krawieckiej standardową nić nawleczono wokół tchawicy w ramach przygotowania do następnego etapu wypełniania płuc roztworem agros. Następnie strzykawkę o pojemności 1 ml napełniono podgrzanym roztworem aros i podano go przez cewnik, aby wypełnić płuca. Gdy płuca zostały wypełnione, tchawicę zawiązano przygotowaną nicią, usuwając jednocześnie cewnik, a całe zwierzę umieszczono w lodówce w temperaturze 4 °C na 15 minut.Po zastygnięciu arosu, zaczynając od tchawicy, wyciąć całe płuco z otwartej klatki piersiowej i przemyć je schłodzonym wcześniej PBS, używając ostrych nożyczek z zakrzywionym czubkiem. Usunąć prawy płat płuca. Krótko osuszyć spód płata na arkuszu ręcznika papierowego, a następnie przymocować płat do bloku preparacyjnego Vibram, używając kropli kleju tkankowego, i pozostawić na jedną minutę.Następnie zamontuj blok w komorze tnącej wibratomu, a następnie wypełnij komorę schłodzonym wcześniej PBS. Ustaw brzytwę na średni zakres wibracji z centralnym ustawieniem napędu i wykonaj poziomy przekrój poprzeczny płuca. Następnie umieść górną połowę wyciętej tkanki płucnej do góry dnem w plastikowej szalce Petri o średnicy pięciu centymetrów.Przymocuj tkankę płucną do szalki Petriego, kładąc na niej płaską podkładkę. Napełnij szalkę 10 milliliters PBS i dodaj 10 microliters barwnika cytoxin. Na koniec umieść szalkę z tkanką płucną pod obiektywem mikroskopu, aby bufor mógł zostać ogrzany do 37 degrees Celsius za pomocą grzałki sterowanej czujnikiem temperatury w celu przeprowadzenia obrazowania.Różne obszary wzdłuż skanu sekcyjnego są obrazowane do głębokości 400 µm przy użyciu długości fali oświetlenia 800 nm, z detekcją fluorescencji zielonej o długości 530 nm i czerwonej 580 nm, a także sygnału generowania drugiej harmonicznej (SHG). W kolorze niebieskim, przy emisji fluorescencji od 400 do 470 nm z zewnętrznymi detektorami skanującymi non-descanned (NDD), przedstawiono sygnał SHG struktury tkanki pęcherzykowej niezakażonego płuca myszy C57BL/6. Należy zwrócić uwagę na tkankę włóknistą u dołu skrawka płuca w porównaniu do wyraźnej organizacji pęcherzykowej w obszarach aktywnych oddechowo w górnej części płuca.Na tej rycinie sygnał cyt talk jąder komórek płuc, które zostały rozcięte podczas przygotowywania skrawka płuca, jest zwizualizowany w kolorze czerwonym. Rycina przedstawia nałożenie dwóch kanałów wraz z powiększeniem obszaru tkanki zaznaczonego ramką. Niebieski sygnał SHG wskazuje struktury pęcherzykowe oraz grzybicze obecne w skrawku płuca myszy C 57 black six, zainfekowanej siedem godzin wcześniej afu tis.Na tej rycinie czerwony sygnał Cyt talk pokazuje nie tylko jądra komórek płuc otwartych podczas przygotowywania przekroju płuc, ale także widoczne tutaj sieci DNA. Na tym powiększeniu obszaru zaznaczonego ramką z poprzedniej ryciny widoczna jest nakładka dwóch kanałów. Wyraźne obszary mas grzybni, pęcherzyków płucnych i struktur sieciowych oznaczono odpowiednio literami FA i N; połączona struktura grzyba oraz SHG tkanki pęcherzykowej są koloru niebieskiego.Sygnał cytalk w jądrach komórkowych i sieciach jest czerwony, widoczne są również liczne neutrofile naciekające płuca. Kolor zielony można tutaj zaobserwować w przekroju tkanki płucnej myszy lys EGFP. Siedem godzin po zakażeniu afu goddess w płucach zakażonych aspers, w zapisie time-lapse, widoczne są migrujące i fagocytujące elementy grzybowe w kolorze niebieskim neutrofile w kolorze zielonym.Mikroskopia dwufotonowa żywego skrawka płuca. Siedem godzin po infekcji jądra komórkowe i struktury sieciowe są przedstawione na czerwono. Rzeczywisty czas eksperymentu jest wyświetlony w prawym dolnym rogu, a pasek skali odpowiada 50 micrometers.Opisana metoda może dostarczyć cennych informacji na temat infekcji grzybiczych. Można ją również zastosować do innych układów, takich jak infekcje wirusowe lub bakteryjne, a także wykorzystać do badania funkcji innych rezydentnych komórek odpornościowych w płucach.

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Bezpośrednie obserwowanie fagocytozy i tworzenia sieci neutrofilowych przez neutrofile w zakażonych płucach za pomocą mikroskopii 2-fotonowej

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Odkryj dynamikę neutrofilów w zakażonych płucach za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Ta metoda umożliwia obserwację fagocytozy i tworzenia NET w czasie rzeczywistym.

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Przeglądaj więcej filmów